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Crispr/Cas9技术在CHO细胞中进行基因定点敲入的应用

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中国医药工业杂志 2017年第1期48卷 33-37页

作者：王佳贤赵梦琳丁凯路慧丽朱建伟上海交通大学药学院细胞工程及抗体药物教育部工程研究中心上海200240

工业生产中,哺乳动物细胞是重组蛋白类药物最常用的表达系统之一,但重组细胞株经常在表达量及产品质量方面不尽理想。在基因组中定点整合外源基因则可以极大地改善细胞株的生产能力及产品质量。Crispr/Cas9技术是近年发展起来的基因编... 详细信息

工业生产中,哺乳动物细胞是重组蛋白类药物最常用的表达系统之一,但重组细胞株经常在表达量及产品质量方面不尽理想。在基因组中定点整合外源基因则可以极大地改善细胞株的生产能力及产品质量。Crispr/Cas9技术是近年发展起来的基因编辑技术,在动植物细胞中得到了广泛应用。基于已有文献和本实验室经验,本文主要介绍了Crispr/Cas9技术在工业生产常用细胞系中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中进行基因定点整合的方法,并介绍了应用Crispr/Cas9技术进行基因定点敲入的案例。

关键词： Crispr/Cas9技术基因定点整合中华仓鼠卵巢细胞重组细胞株稳定性

GenCenter:一个基因综合信息数据集成系统

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复旦学报（自然科学版） 2006年第5期45卷 599-603页

作者：李杨曹顺良曹文君李亦学复旦大学计算机与信息技术系上海200433 上海生物信息技术研究中心上海200235

GenCenter集成了已被实验验证以及功能已经明确了的基因信息,增加了基因相关的核酸序列、蛋白质结构、专利以及与该基因相关的疾病、药物与文献等信息.描述了GenCenter的体系结构、数据库构成、关键技术、功能.

关键词：基因 GenCenter 文本挖掘生物信息学

扶正化瘀方对NK92细胞活化和杀伤功能的影响

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中成药 2021年第12期43卷 3310-3315页

作者：平大冰孙鑫彭渊胡旭东陶艳艳刘成海上海中医药大学附属曙光医院肝病研究所上海201203 上海中医药大学基础医学院生物教研室上海201203 上海市中医临床重点实验室上海201203

目的通过体外实验观察扶正化瘀方对人外周血NK细胞系NK92细胞活化和杀伤功能的影响。方法CCK8法检测扶正化瘀方对NK92细胞的最大无毒质量浓度,基于最大无毒质量浓度,选取不小于3个有效药物质量浓度对NK92细胞进行细胞功能和活性评价,Ann... 详细信息

目的通过体外实验观察扶正化瘀方对人外周血NK细胞系NK92细胞活化和杀伤功能的影响。方法CCK8法检测扶正化瘀方对NK92细胞的最大无毒质量浓度,基于最大无毒质量浓度,选取不小于3个有效药物质量浓度对NK92细胞进行细胞功能和活性评价,Annexin V/7-AAD复染法检测NK92细胞凋亡,荧光定量PCR法检测NK92细胞表面激活型受体NKG2D、NKp30、NKp46的基因表达,流式细胞术检测并验证NK92细胞表面激活型受体的表达变化,ELISA法检测药物孵育后NK92细胞分泌因子IFN-γ和颗粒酶B的水平;以聚肌胞苷酸PolyI:C为阳性对照药物,在NK92细胞与K562细胞共培养杀伤体系中评价药物对NK92细胞杀伤功能的影响。结果扶正化瘀方在100μg/mL及以下质量浓度时对NK92细胞无明显毒性,较低质量浓度时扶正化瘀方对NK92细胞凋亡有保护作用;经不同质量浓度扶正化瘀方孵育的NK92细胞,可不同程度增强细胞表面激活型受体的表达以及促进的IFN-γ、颗粒酶B分泌;杀伤性实验评价显示扶正化瘀方在无毒质量浓度范围呈现剂量依赖性地提高NK92细胞对K562细胞的杀伤功能。结论扶正化瘀方可以促进NK92细胞活化,增强其杀伤功能,充当NK细胞正性调节剂。

关键词：扶正化瘀方 NK细胞活化杀伤功能

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斯钙素2对口腔鳞癌细胞的作用及机制研究

中国癌症杂志 2015年第4期25卷 269-274页

作者：杨舒雯王宇杨恭复旦大学附属肿瘤医院头颈外科复旦大学上海医学院肿瘤学系上海200032 复旦大学附属肿瘤医院肿瘤研究所复旦大学上海医学院肿瘤学系上海200032

背景与目的:口腔颌面部恶性肿瘤中约80%以上为口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC),虽过去的几十年诊断及治疗技术不断改进,其存活率却没有得到明显改善,5年生存率仍小于50%。该研究旨在探讨斯钙素2(stanniocalcin 2,ST... 详细信息

背景与目的:口腔颌面部恶性肿瘤中约80%以上为口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC),虽过去的几十年诊断及治疗技术不断改进,其存活率却没有得到明显改善,5年生存率仍小于50%。该研究旨在探讨斯钙素2(stanniocalcin 2,STC2)对口腔鳞癌细胞KB的增殖、凋亡及侵袭迁移的影响。方法:构建STC2的RNA干扰载体,将其转染KB细胞使STC2基因沉默后,采用CCK8实验检测STC2对KB细胞增殖的影响,通过APC Annexin V/7-AAD染色、流式细胞术检测细胞凋亡情况,分析STC2对细胞凋亡的影响。细胞划痕和细胞小室(Transwell)试验分析比较STC2基因沉默后对口腔鳞癌细胞侵袭和迁移的差异。最后用蛋白[质]印迹法(Western blot)检测凋亡、转移相关蛋白。结果:成功构建KB细胞STC2敲除细胞系,CCK8增殖实验结果显示,STC2沉默后,细胞增殖被明显抑制,其生长速度低于对照组(P药物顺铂的敏感性。

关键词：口腔肿瘤增殖侵袭转移

GPR120选择性剪切异构体2的高通量药物筛选细胞模型的构建

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中国新药杂志 2009年第1期18卷 57-62,66页

作者：褚甜蒋明刘剑峰中国科学院北京基因组研究所北京101300 上海华大天源生物科技有限公司上海201203 华中科技大学生命科学与技术学院教育部分子生物物理重点实验室武汉430074

目的:建立GPR120选择性剪切异构体2的功能性筛选模型,筛选GPR120的激动剂和抑制剂,开发防治糖尿病等疾病的药物。方法:从健康人胎脑cDNA文库中得到缺失了第3外显子的GPR120选择性剪切异构体2(hGPR120-s)的cDNA,将其克隆到pcDNA3载体中,... 详细信息

目的:建立GPR120选择性剪切异构体2的功能性筛选模型,筛选GPR120的激动剂和抑制剂,开发防治糖尿病等疾病的药物。方法:从健康人胎脑cDNA文库中得到缺失了第3外显子的GPR120选择性剪切异构体2(hGPR120-s)的cDNA,将其克隆到pcDNA3载体中,构建pcDNA3/hGPR120-s重组表达质粒,继而转染HEK293细胞,通过G418筛选,获得稳定表达该异构体的真核重组细胞系。利用特异性配体亚麻酸和GW 9508探索和优化了筛选条件。并初步应用该模型研究各种天然脂肪酸的构效关系。结果:建立了稳定可靠的高通量筛选模型,Z因子=0.69。结论:该系统适合于GPR120激动剂的高通量筛选。

关键词： GPR120 功能性钙流检测高通量筛选 G蛋白偶联受体(GPCR)

白血病细胞株对马法兰的耐药机制与α干扰素的逆转作用

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中华医学杂志 1996年第7期76卷 485-489页

作者：钱其军严文伟杨纯正韩俊领韩明哲施红邱录贵郝玉书中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所上海第二军医大学东方肝胆外科医院肿瘤免疫及基因治疗中心

探讨白血病细胞对烷化剂马法兰的耐药机制，寻找逆转其对马法兰耐药的有效途径。方法采用逐渐增加马法兰剂量来建立一株耐马法兰白血病细胞系（Ｋ５６２／Ｍｅｌ），研究其耐药相关基因表达水平，进而观察α－干扰素（ＩＦＮ）对其耐药... 详细信息

探讨白血病细胞对烷化剂马法兰的耐药机制，寻找逆转其对马法兰耐药的有效途径。方法采用逐渐增加马法兰剂量来建立一株耐马法兰白血病细胞系（Ｋ５６２／Ｍｅｌ），研究其耐药相关基因表达水平，进而观察α－干扰素（ＩＦＮ）对其耐药的逆转作用。结果Ｋ５６２／Ｍｅｌ细胞株细胞对马法兰耐药的８．０倍，对氮芥和噻替派有交叉耐药，而对阿霉素和卡氮芥仍敏感。它的耐药机制与谷胱甘肽－Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）的总活性及ＧＳＴα表达增强有关，而与ＧＳＴπ、ＧＳＴμ、ＭＤＲ－１及Ｔｏｐ－Ⅱ基因无明显相关。应用无细胞毒性剂量αＩＦＮ能明显逆转马法兰耐药，其效果优于利尿酸，其机制可能是通过下调ＧＳＴα基因表达而起作用。结论白血病细胞对马法兰的耐药机制与ＧＳＴ总活性及ＧＳＴα表达升高有关，αＩＦＮ能逆转马法兰耐药。

关键词：白血病药物耐受性干扰素马法兰

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鳜胚胎细胞系的建立与应用

水产学报 2018年第10期42卷 1626-1634页

作者：陈晓武申亚伟赵金良吴明林上海海洋大学上海水产养殖工程技术研究中心安徽省农业科学院水产研究所上海海洋大学水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心上海海洋大学水产科学国家级实验科教示范中心

为更好地开展鳜基因功能研究和药物筛选工作,提高基因转染效率,本研究以鳜囊胚期胚胎为材料,采用含有20%胎牛血清的DMEM培养基进行培养,建立了生长稳定的鳜胚胎细胞系MFE。在此基础上,采用绿色荧光蛋白(GFP)作为标记物,在HEK293T细胞中... 详细信息

为更好地开展鳜基因功能研究和药物筛选工作,提高基因转染效率,本研究以鳜囊胚期胚胎为材料,采用含有20%胎牛血清的DMEM培养基进行培养,建立了生长稳定的鳜胚胎细胞系MFE。在此基础上,采用绿色荧光蛋白(GFP)作为标记物,在HEK293T细胞中体外包装逆转录病毒,再感染MFE细胞系。MTT法分析表明传代后细胞培养96 h内,细胞生长率变化也经历增殖、降低到达稳定期。而且MFE细胞能稳定表达GFP基因,感染效率为20%±5%,而脂质体转染效率为3%±2%。可见包装病毒感染细胞不仅能获得稳转细胞系,效率也远高于脂质体瞬时转染。荧光定量PCR分析表明,MFE细胞系能表达Irf1、Irf3和Irf7基因,Irf1基因表达量最高。MFE细胞系受到poly I:C刺激后,Irf1、Irf3和Irf7的表达量分别升高3.5,2.3和2.1倍。因此,MFE细胞通过病毒感染可以获得较高的转染效率,该细胞可作为鳜免疫相关基因功能研究的工具。

关键词：鳜细胞培养逆转录病毒干扰素调节因子

鳜AKT2在传染性脾肾坏死病毒增殖中的作用

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2021年第2期49卷 14-22页

作者：明月牛银杰付小哲刘礼辉梁红茹林强李宁求中国水产科学研究院珠江水产研究所农业农村部渔用药物创制重点实验室/广东省水产动物免疫技术重点实验室广东广州510380 上海海洋大学水产与生命学院上海201306

【目的】研究鳜AKT2(ScAKT2)在传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)增殖中的作用,为鳜ISKNV防控提供参考。【方法】克隆ScAKT2基因开放阅读框,构建原核表达载体,进行原核表达及蛋白纯化。用纯化后的... 详细信息

【目的】研究鳜AKT2(ScAKT2)在传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)增殖中的作用,为鳜ISKNV防控提供参考。【方法】克隆ScAKT2基因开放阅读框,构建原核表达载体,进行原核表达及蛋白纯化。用纯化后的ScAKT2重组蛋白免疫日本大耳兔后制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体的效价,用间接免疫荧光和Western blot法测定抗体的特异性。克隆鳜AKT2基因,构建过表达载体pCMV-EGFP-ScAKT2,将其转染至CPB细胞系中构建ScAKT2过表达细胞系,用荧光显微镜检测转染效率,用qRT-PCR法及Western blot法分别测定ScAKT2 mRNA水平和蛋白水平的表达,以鉴定ScAKT2过表达细胞系是否构建成功。将ISKNV接种至ScAKT2过表达细胞系中,用qPCR法及Western blot法分别测定ISKNV病毒拷贝数及ISKNV-MCP蛋白的表达,用qRT-PCR法测定ScIRF3、ScIRF7、ScMx、ScIL8、ScTRAF2和ScTRAF3等先天免疫因子mRNA水平的表达情况。【结果】PCR扩增获得1400 bp的AKT2 ORF片段,成功构建了原核表达质粒,诱导表达出72 ku的重组蛋白。成功制备了ScAKT2多克隆抗体,抗体效价达1∶256000,纯化后质量浓度约为10 mg/mL。成功构建了pCMV-EGFP-ScAKT2过表达载体和过表达ScAKT2的CPB细胞系,过表达ScAKT2 CPB细胞可极显著抑制ISKNV的增殖,能明显上调ScIRF3、ScIRF7、ScMx、ScIL8、ScTRAF2和ScTRAF3等先天免疫因子mRNA的表达水平。【结论】ScAKT2通过上调先天免疫因子的表达抑制ISKNV的增殖,为鳜ISKNV防控提供了新的潜在靶点。

关键词：鳜 AKT2 传染性脾肾坏死病毒病毒增殖

高三尖杉酯碱诱导K562和CML细胞凋亡及分化的实验研究

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上海医学 2001年第3期24卷 166-168,172页

作者：王昀孙关林邬维礼姚一芸肖冬梅苏卉熊树民上海第二医科大学瑞金医?现在上海第二医科大学附属新华医院干细胞移植科上海市血液病研究所

目的　明确高三尖杉酯碱 (HHT)治疗慢性粒细胞性白血病 (CML)的机理。方法　应用细胞生长曲线、克隆形成能力、细胞内血红蛋白含量测定、细胞形态 ,结合DNA凝胶电泳、流式细胞仪等方法 ,观察HHT对K5 6 2细胞株及CML慢性期细胞的作用方... 详细信息

目的　明确高三尖杉酯碱 (HHT)治疗慢性粒细胞性白血病 (CML)的机理。方法　应用细胞生长曲线、克隆形成能力、细胞内血红蛋白含量测定、细胞形态 ,结合DNA凝胶电泳、流式细胞仪等方法 ,观察HHT对K5 6 2细胞株及CML慢性期细胞的作用方式。进一步用RT PCR方法研究bcr abl、c myc、max基因在转录水平的改变。结果　低浓度HHT抑制K5 6 2细胞的克隆形成能力并使K5 6 2细胞内血红蛋白含量增加 ;0 .1μmol/L及以上浓度HHT可诱导K5 6 2细胞及CML细胞凋亡 ;细胞周期分析发现细胞阻滞于G1期。c myc基因在加药 2 4h开始下调 ;bcr abl和max基因的表达未见明显改变。结论　低浓度HHT可抑制K5 6 2细胞增殖并诱导其向红系分化 ;超过一定“阈浓度”HHT可诱导K5 6 2细胞和CML慢性期细胞凋亡 ;HHT可通过抑制c

关键词：高三尖杉酯碱慢性髓细胞性白血病细胞凋亡细胞分化药物治疗实验 K562 细胞 CML细胞