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PCR荧光探针技术对结核分枝杆菌复合群及利福平耐药性检测性能的评价

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中国防痨杂志 2024年第10期46卷 1250-1258页

作者：李静姜琦江渊沈鑫上海市疾病预防控制中心结核病和艾滋病防治所上海200336 上海市预防医学科学院上海200336

目的:评价PCR荧光探针技术检测痰液样本中结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)和利福平耐药性效果,为进一步开展“结核分枝杆菌复合群及利福平耐药核酸检测试剂盒”多中心临床试验提供可行性研究数据。方法:... 详细信息

目的:评价PCR荧光探针技术检测痰液样本中结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)和利福平耐药性效果,为进一步开展“结核分枝杆菌复合群及利福平耐药核酸检测试剂盒”多中心临床试验提供可行性研究数据。方法:采用前瞻性研究方法,参照入组标准收集2021年12月至2022年8月上海市3家结核病定点医院肺科门诊就诊的205例初诊疑似肺结核患者的3份痰液样本(即时痰、夜间痰、晨痰),分别进行痰涂片、BACTEC MGIT 960(MGIT 960)、GeneXpert MTB/RIF(Xpert)和PCR荧光探针法检测,评价PCR荧光探针法对痰液样本中MTBC及利福平耐药性的检测效能。另对随机选取同期上海市疾病预防控制中心结核病实验室菌株库中保存的96株MTBC临床菌株(包括利福平表型耐药菌株47株和利福平表型敏感菌株49株)分别进行PCR荧光探针法和Xpert检测利福平耐药性,分析两种检测方法对利福平耐药相关基因突变的检出情况。结果:205例疑似肺结核患者中,PCR荧光探针法对MTBC的检出率为22.44%(46/205),与MGIT 960[21.95%(45/205)]、Xpert[20.98%(43/205)]和痰涂片[16.10%(33/205)]的差异均无统计学意义(χ^(2)=0.014,P=0.904;χ^(2)=0.129,P=0.719;χ^(2)=2.650,P=0.104)。以临床诊断为参照标准,PCR荧光探针法、Xpert、MGIT 960和痰涂片检测MTBC的敏感度(95%CI)分别为48.10%(36.93%~59.56%)、48.10%(36.93%~59.56%)、50.63%(39.23%~61.97%)和40.51%(29.79%~52.15%),特异度(95%CI)分别为93.65%(87.47%~97.12%)、96.03%(90.52%~98.53%)、96.03%(90.52%~98.53%)和99.21%(95.01%~99.96%),一致率分别为76.10%(156/205)、77.56%(159/205)、78.54%(161/205)和76.59%(157/205),Kappa值分别为0.453、0.482、0.507和0.446。PCR荧光探针法检测痰液样本中MTBC的涂阴和极低级别阳性样本的检出率[10.73%(19/177)]与Xpert检测结果[8.47%(15/177)]的差异无统计学意义(χ^(2)=0.793,P=0.373)。PCR荧光探针法在检出MTBC的46份样本中同时检出6份样本发生利福平耐药基因突变,突变率为13.04%(6/46);而Xpert在检出MTBC的43份样本中仅同时检出1份样本发生利福平耐药基因突变,突变率为2.33%(1/43)。在96株临床菌株中,两种分子检测方法均检测到56株菌株发生利福平耐药基因突变,除2株探针突变类型不一致外,其他探针突变类型均一致,且多发生在probe E(529~533)和FAM通道(531/533突变)。结论:以临床诊断为参照标准,PCR荧光探针法检测MTBC的效能与MGIT 960、Xpert和痰涂片基本相当,且与Xpert检测MTBC临床菌株的利福平耐药性效果一致,认为PCR荧光探针法不仅是一种等同于Xpert检测功能的新技术,还具有操作简单、价格低于Xpert、真正实现一体化和全封闭等优势。建议在临床推广过程中进一步优化PCR荧光探针法以提高MTBC检出率,并开展多中心临床试验验证研究。

关键词：分枝杆菌,结核抗药性,细菌利福平微生物敏感性试验分子诊断技术

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耐药结核病实验室诊断技术研究进展

检验医学 2024年第2期39卷 203-208页

作者：李宁迪江渊上海市疾病预防控制中心上海200336

结核病(TB)是严重危害公众健康的全球性公共卫生问题。耐药结核病(DR-TB)是TB防治的重点和难点。目前,常用的体外药物敏感性试验方法包括表型药物敏感性检测技术和分子药物敏感性检测技术。表型药物敏感性检测技术包括固体药物敏感性试... 详细信息

结核病(TB)是严重危害公众健康的全球性公共卫生问题。耐药结核病(DR-TB)是TB防治的重点和难点。目前,常用的体外药物敏感性试验方法包括表型药物敏感性检测技术和分子药物敏感性检测技术。表型药物敏感性检测技术包括固体药物敏感性试验、液体药物敏感性试验、最低抑菌浓度法,分子药物敏感性检测技术包括GeneXpert MTB/RIF、线性探针技术、基因芯片技术、荧光聚合酶链反应(PCR)熔解曲线法、FluoroType MTBDR、Xpert MTB/XDR、核酸质谱分析、全基因组测序技术。文章就表型药物敏感性检测和分子药物敏感性检测对DR-TB实验室诊断技术的研究进展进行综述,旨在为DR-TB的早期诊断提供参考。

关键词：耐药结核病表型药物敏感性检测分子药物敏感性检测

2021年8月珠海一起食源性疾病暴发事件中金黄色葡萄球菌病原学特征分析

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中国食品卫生杂志 2024年第6期36卷 735-740页

作者：方艳梅龙冬玲京舒娉陈晶京杨春晓黄辉涛黄利群黄开松珠海市疾病预防控制中心微生物检验所广东珠海519064 广东医科大学广东省医学分子诊断重点实验室广东东莞523822

目的研究一起食源性疾病事件金黄色葡萄球菌(金葡菌)病原学特征和同源性。方法采用国标方法分离鉴定病原菌,微量肉汤稀释法检测菌株对16种药物的敏感性,全基因组测序和生物信息学分析病原菌分子遗传特征和同源性。结果该事件分离得到16... 详细信息

目的研究一起食源性疾病事件金黄色葡萄球菌(金葡菌)病原学特征和同源性。方法采用国标方法分离鉴定病原菌,微量肉汤稀释法检测菌株对16种药物的敏感性,全基因组测序和生物信息学分析病原菌分子遗传特征和同源性。结果该事件分离得到16株金黄色葡萄球菌,包括8株患者分离株,1株厨工分离株和7株食品分离株。MLST和Spa分型结果为ST7-t91、ST5-t548、ST398-t588和ST965-t62,患者株分为ST7-t91型和ST5-t548型;ST7分离株均对四环素和青霉素耐药,携带耐药基因aadD、te(t K)、blaZ和lnu(A),ST5株对16种抗生素均敏感;cgMLST分析发现ST7型菌株间等位基因差异≤3;毒力基因注释发现ST7株携带sea、chp、scn和sak毒力基因,ST5株携带chp、scn、sak、seg、selk、selm、selo和seln毒力基因。结论该事件由多个ST型金葡菌混合感染引起,以ST7-t91型为主,该克隆株致病力强,但对头孢类抗生素和喹诺酮类等临床一线抗生素敏感。

关键词：食源性疾病金黄色葡萄球菌全基因组测序 cgMLST 肠毒素

大片形吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶的表达纯化及多克隆抗体制备

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中国动物传染病学报 2024年

作者：何宇婷郭晴晴岳永程贾静韩艳辉周岩卢丽丹唐文强洪炀傅志强西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所海南热带病研究中心(国家热带病研究中心海南分中心) 中国农业科学院上海兽医研究所国家动物血吸虫病参考实验室贵州省疾病预防控制中心中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心)国家卫生健康委员会寄生虫病原与媒介生物学重点实验室(中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所)

片形吸虫病主要是由大片形吸虫（Fasciolagigantica）和肝片形吸虫（Fasciolahepatica）寄生在草食性哺乳动物或人肝胆内引起的一种人畜共患寄生虫病。片形吸虫中存在的硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（TGR)是其氧化还原系统中一个含硒的多... 详细信息

片形吸虫病主要是由大片形吸虫（Fasciolagigantica）和肝片形吸虫（Fasciolahepatica）寄生在草食性哺乳动物或人肝胆内引起的一种人畜共患寄生虫病。片形吸虫中存在的硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（TGR)是其氧化还原系统中一个含硒的多功能酶。本研究对大片形吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（FgTGR）进行了克隆、表达及纯化，并制备其多克隆抗体。通过PCR方法扩增了含开放阅读框（ORF）的FgTGR序列与含硒蛋白序列的FgTGR序列（FgTGRsec），分别构建了克隆质粒pMD19T-FgTGR和表达质粒pET28a(+)-FgTGRsec。将pET28a(+)-FgTGRsec单独转入BL21（DE3）感受态细胞后进行诱导表达，此外，将pET28a(+)-FgTGRsec与pSUABC质粒共同转入BL21（DE3）感受态细胞后进行表达，并对表达后的这两种重组蛋白分别进行纯化。以纯化的重组FgTGR蛋白（rFgTGR）作为免疫抗原对BALB/c小鼠进行皮下免疫，制备多克隆抗体。FgTGR基因的ORF为1920bp，编码639个氨基酸，理论分子量约为70 kDa，FgTGRsec基因片段为1968 bp，编码656个氨基酸，表达的重组蛋白理论分子量约为72 kDa，两者在大肠杆菌中表达的重组蛋白在蛋白电泳结果中均符合预测大小。成功制备了针对rFgTGR的多克隆抗体，将该抗体1:400稀释后作为蛋白免疫印迹实验的一抗，可成功地检测到rFgTGRsec条带。本研究成功表达了含硒蛋白和不含硒蛋白的重组FgTGR蛋白，制备了针对FgTGR蛋白的多克隆抗体，为FgTGR的酶动力学研究及其抑制物的筛选提供了基础。

关键词：大片形吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶表达纯化多克隆抗体

旋毛虫新生幼虫细胞外囊泡的分离鉴定及组学分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2024年第2期42卷 225-233页

作者：刘毅蔡玉春陈家旭陈韶红俞英昉中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心) 传染病溯源预警与智能决策全国重点实验室国家卫生健康委员会寄生虫病原与媒介生物学重点实验室世界卫生组织热带病合作中心科技部国家级热带病国际研究中心上海200025 上海健康医学院医学技术学院上海201318

目的分离并鉴定旋毛虫新生幼虫分泌的细胞外囊泡(EV)主要成分,了解新生幼虫EV的功能。方法消化旋毛虫保种小鼠肌肉,手机旋毛虫肌幼虫,昆明小鼠灌胃感染肌幼虫(2000条/鼠)后5 d取小肠,网筛法收集旋毛虫成虫,成虫置于RPMI 1640培养液中培... 详细信息

目的分离并鉴定旋毛虫新生幼虫分泌的细胞外囊泡(EV)主要成分,了解新生幼虫EV的功能。方法消化旋毛虫保种小鼠肌肉,手机旋毛虫肌幼虫,昆明小鼠灌胃感染肌幼虫(2000条/鼠)后5 d取小肠,网筛法收集旋毛虫成虫,成虫置于RPMI 1640培养液中培养48 h后收集新生幼虫。采用差速超速离心法提取旋毛虫新生幼虫培养液中的EV,透射电子显微镜观察EV形态,使用纳米颗粒跟踪分析技术检测EV的粒径,蛋白质免疫印迹(Western blotting)验证EV蛋白。对新生幼虫及其EV进行蛋白组质谱分析和miRNA测序分析,采用t检验比较新生幼虫及其EV之间蛋白和miRNA的表达差异。差异表达蛋白和miRNA靶基因进行基因本体论(GO)功能条目富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。使用WoLFPSORT分析蛋白的亚细胞定位。结果透射电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析结果显示,旋毛虫新生幼虫分泌的EV为“杯盘”形膜性囊泡,平均粒径为(101.7±1.8)nm。Western blotting结果显示,新生幼虫EV能与旋毛虫感染小鼠血清产生特异性条带,相对分子质量约为65000。蛋白组质谱分析结果显示,新生幼虫及其EV样品中分别检测到1424和231种蛋白,有220种蛋白在两组样品中均有表达,其中116种表达有差异(在EV中31种表达上调、85种表达下调)。蛋白亚细胞定位分析结果显示,差异蛋白主要分布于细胞质(30.2%,35/116)、细胞核(19.0%,22/116)和细胞膜(17.2%,20/116)。miRNA测序结果显示,新生幼虫及其EV样品分别检测到183和117种miRNA,有46种miRNA在两组样品中均有表达,其中40种表达有差异(在EV中10种表达上调、30种表达下调)。在EV中表达上调的10种miRNA中,let-7-5p表达最高。GO功能条目富集分析结果显示,差异蛋白有57种属于细胞组成、73种具有分子功能、63种参与生物过程,差异miRNA的靶基因主要与自噬相关12基因转移酶活性、胞质泛素连接酶复合物、细胞对紫外线A的响应和钙离子稳态等条目有关。KEGG通路富集分析结果显示,差异蛋白主要富集在代谢途径、内质网中的蛋白质加工等相关通路,差异miRNA的靶基因仅涉及自噬-其他1条途径。结论本研究分离并鉴定了旋毛虫新生幼虫分泌的EV,检测到新生幼虫及其EV间差异表达的116种蛋白和40种miRNA,主要参与代谢、自噬等途径,推测新生幼虫EV可能在旋毛虫感染早期逃避宿主免疫防御的过程中发挥重要作用。

关键词：旋毛虫新生幼虫细胞外囊泡蛋白组学 miRNA测序

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蚊虫杀虫剂抗性机制及检测方法研究进展

中国病原生物学杂志 2024年第1期19卷 113-119,123页

作者：曹自有冯欣宇尹建海夏志贵中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所国家热带病研究中心世界卫生组织热带病合作中心科技部国家级热带病国际联合研究中心国家卫生健康委寄生虫病原与媒介生物学重点实验室上海200025

蚊虫作为疾病传播媒介,对全球公共卫生产生重大影响。长期以来,化学方法是控制蚊虫种群的主要手段,然而蚊虫对杀虫剂的抗性问题已经引起了广泛关注。本文对蚊虫杀虫剂抗性的产生原因、抗性机制及其检测方法的研究进展进行了全面梳理和... 详细信息

蚊虫作为疾病传播媒介,对全球公共卫生产生重大影响。长期以来,化学方法是控制蚊虫种群的主要手段,然而蚊虫对杀虫剂的抗性问题已经引起了广泛关注。本文对蚊虫杀虫剂抗性的产生原因、抗性机制及其检测方法的研究进展进行了全面梳理和分析。首先,分析了抗性产生的原因,包括杀虫剂使用不当、生物选择压力、环境污染、基因突变和基因流等。其次,探讨了抗性产生的机制,如生物代谢途径的改变、杀虫剂靶点的突变、表达调控、行为抗性、解毒酶活性协同作用和抗性基因多态性等。最后,总结了蚊虫杀虫剂抗性检测方法的研究进展,涉及生物测定法、生化检测法和分子生物学检测法。旨在为蚊虫杀虫剂抗性检测新方法的研究以及杀虫剂抗性监测和管理提供新的理论支持和科学手段。

关键词：疟疾蚊虫杀虫剂抗性检测方法研究进展综述

新孢子虫硫氧还蛋白的生物信息学分析及其原核表达的鉴定

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中国预防兽医学报 2024年第7期46卷 691-699页

作者：齐闻新张旻李晨周思含徐啊慧钱伟锋胡苏辉王天奇位治国洪炀闫文朝河南科技大学动物科技学院河南洛阳471023 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所国家卫生健康委员会寄生虫病原与媒介生物学重点实验室上海200241

为研究新孢子虫硫氧还蛋白(Trx)的生物学特性,本研究利用PCR扩增犬新孢子虫Trx(NcTrx)基因的编码区序列,构建pET-32a(+)-NcTrx原核表达载体,经双酶切与测序鉴定正确后,利用系列生物信息学软件分析NcTrx基因及其编码氨基酸序列的生物信... 详细信息

为研究新孢子虫硫氧还蛋白(Trx)的生物学特性,本研究利用PCR扩增犬新孢子虫Trx(NcTrx)基因的编码区序列,构建pET-32a(+)-NcTrx原核表达载体,经双酶切与测序鉴定正确后,利用系列生物信息学软件分析NcTrx基因及其编码氨基酸序列的生物信息学特征,并对其蛋白互作网络中排名前100的蛋白进行GO功能和KEGG信号通路的富集分析。重组质粒中NcTrx基因的测序结果显示,NcTrx基因片段为1 287 bp,编码428个氨基酸;该蛋白含1个信号肽,1个跨膜区,主要位于内质网上;NcTrx蛋白的二、三级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲组成,有12个B细胞抗原表位;该蛋白属于硫氧还蛋白家族,存在典型的氧化还原基序“-CXXC-”,有38个磷酸化位点、10个O-糖基化位点;与NcTrx蛋白互作最强的为酪氨酸激酶样蛋白,二者通过氢键和静电作用实现相互对接;GO功能及KEGG信号通路的显著性富集分析结果显示,NcTrx与其互作的蛋白主要参与蛋白质转运、蛋白质二硫键异构酶活性等生物学过程,与内质网蛋白质加工、硫代谢等信号通路密切相关。将pET-32a(+)-NcTrx转化BL21(DE3)感受态细胞,并经IPTG诱导表达后采用镍亲和层析法纯化重组NcTrx蛋白(rNcTrx),经SDS-PAGE检测该蛋白的表达及纯化效果,采用Bradford法测定纯化蛋白的浓度。采用western blot鉴定rNcTrx的反应原性。SDS-PAGE结果显示,rNcTrx分子量约66 ku,主要以包涵体的形式表达,且纯化效果较好,浓度为0.8 mg/mL。Western blot检测结果显示,纯化的rNcTrx能够与鼠His MAb、新孢子虫感染的小鼠血清发生特异性反应,在66 ku处出现特异性条带。本研究首次经PCR扩增NcTrx基因,对NcTrx基因及其蛋白进行了生物信息学分析,并经原核系统表达及鉴定了NcTrx蛋白,为后续深入探究该蛋白的生物学功能提供参考依据。

关键词：新孢子虫硫氧还蛋白生物信息学原核表达

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纳米二氧化钛颗粒毒理学进展

毒理学杂志 2006年第5期20卷 334-336页

作者：应贤平仲伟鉴上海市疾病预防控制中心毒物危害分子基因检测实验室上海200336

纳米颗粒（直径＜100 nm）产生有自然和人为2种类型,后者又分故意（纳米技术）和非故意（燃烧）2种方式.在生物进化过程中,适存的生物已适应以自然类型产生的纳米颗粒;但人为类型,尤其是为特定功能而故意设计可控制大小及形状的纳米技... 详细信息

纳米颗粒（直径＜100 nm）产生有自然和人为2种类型,后者又分故意（纳米技术）和非故意（燃烧）2种方式.在生物进化过程中,适存的生物已适应以自然类型产生的纳米颗粒;但人为类型,尤其是为特定功能而故意设计可控制大小及形状的纳米技术广泛应用,对整个生物系统的影响将是非常巨大的.

关键词：纳米颗粒纳米二氧化钛毒性纳米毒理学

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三唑磷慢性暴露对大鼠肝脏基因表达的作用

三唑磷慢性暴露对大鼠肝脏基因表达的作用