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α-淀粉酶检测方法及其应用

生物工程学报 2023年第3期39卷 898-911页

作者：张娜英杨广宇上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240

α-淀粉酶是一种内切糖苷水解酶,可以水解淀粉等多聚糖内部的α-1,4-糖苷键,生成低聚糖、糊精、麦芽三糖、麦芽糖和少量葡萄糖。由于α-淀粉酶在食品、人体健康监测和制药方面的重要作用,其活性检测广泛应用于工业生产菌株的选育、临床... 详细信息

α-淀粉酶是一种内切糖苷水解酶,可以水解淀粉等多聚糖内部的α-1,4-糖苷键,生成低聚糖、糊精、麦芽三糖、麦芽糖和少量葡萄糖。由于α-淀粉酶在食品、人体健康监测和制药方面的重要作用,其活性检测广泛应用于工业生产菌株的选育、临床疾病的诊断、糖尿病药物的开发和食品质量的控制中。近年来,随着检测技术的发展,许多更加快速、灵敏的α-淀粉酶检测方法被开发出来。本文综述了近年来α-淀粉酶的检测方法和应用研究进展,分类介绍其检测原理和优缺点,并对未来α-淀粉酶检测方法提出展望,以期为α-淀粉酶检测方法的开发和应用提供参考。

关键词： α-淀粉酶检测方法应用

CRISPRi/ddCpf1促进大肠杆菌中丙二酰辅酶A的积累

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食品与生物技术学报 2021年第12期40卷 17-25页

作者：洪煦琳贾笑肖毅上海交通大学生命科学技术学院上海200240

丙二酰辅酶A是多种有价值化合物(包括食品、保健品等)合成的重要前体物质,其合成已成为大肠杆菌中生产目标代谢物的潜在瓶颈。为解决其生物合成的瓶颈问题,作者通过CRISPR干扰(CRISPR interference,CRISPRi)促进丙二酰辅酶A的积累。首先... 详细信息

丙二酰辅酶A是多种有价值化合物(包括食品、保健品等)合成的重要前体物质,其合成已成为大肠杆菌中生产目标代谢物的潜在瓶颈。为解决其生物合成的瓶颈问题,作者通过CRISPR干扰(CRISPR interference,CRISPRi)促进丙二酰辅酶A的积累。首先,构建了丙二酰辅酶A的生物传感器,实现了其快速、可视化的胞内测量。随后,构建了CRISPRi/ddCpf1系统,实现了基因转录的抑制,并尝试用ddCpf1(催化失活的Cpf1)和RNA聚合酶抑制蛋白Gp2融合表达(CRISPRi/ddCpf1-Gp2)。结果表明,Gp2虽然有一定的转录抑制效果,但是严重影响了生长。最后,利用CRISPRi/ddCpf1系统进行两组双靶点基因抑制,分别靶向乙醛脱氢酶和3-氧代酰基-酰基载体蛋白合酶II基因,以及3-氧代酰基-酰基载体蛋白合酶I和琥珀酰辅酶A合成酶基因,均实现了丙二酰辅酶A浓度的提高。

关键词： CRISPR干扰 ddCpf1 丙二酰辅酶A 生物传感器

链球菌噬菌体透明质酸裂解酶的异源表达及酶学性质表征

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中国医药工业杂志 2023年第1期54卷 67-74页

作者：延泉德马瑞邱旭吴金鸿张勇上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240 菏泽市立医院山东菏泽274000 上海交通大学农业生物技术学院食品科学与工程系上海200240

透明质酸酶是一类能降解透明质酸的酶的总称,在生物医药及药物递送等多方面具有重要的应用价值。为了挖掘高活性、高底物特异性及高稳定性的透明质酸酶,对来自链球菌噬菌体的透明质酸裂解酶(HylP)进行了异源表达及酶学性质表征。结果表... 详细信息

透明质酸酶是一类能降解透明质酸的酶的总称,在生物医药及药物递送等多方面具有重要的应用价值。为了挖掘高活性、高底物特异性及高稳定性的透明质酸酶,对来自链球菌噬菌体的透明质酸裂解酶(HylP)进行了异源表达及酶学性质表征。结果表明HylP由337个氨基酸残基构成,是多糖裂解酶家族16(PL16)新成员,重组HylP可在大肠埃希菌BL21(DE3)中可溶性表达,纯化产率可达到30 mg/L,最适酶活反应条件为40℃、pH 6.0,且在35℃及pH 6.0~7.0的中性条件下较为稳定。HylP专一性作用于透明质酸,比活力为24 u/mg;该酶的米氏常数(K_(m))为0.13 mg/mL,催化常数(kcat)为13.80 s^(-1),具有较好的催化活性。链球菌噬菌体来源的HylP具有中温、高特异性、高酶活的特性,在绿色制备功能性低分子透明质酸上有潜在应用价值。

关键词：透明质酸裂解酶噬菌体重组异源表达酶学性质

需钠弧菌外膜囊泡的蛋白质组分析与异源蛋白的递送(英文)

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微生物学通报 2021年第12期48卷 4564-4580页

作者：崔阳董涛上海交通大学生命科学技术学院上海200240

【背景】需钠弧菌(Vibrio natriegens)是一种快速生长的革兰氏阴性菌,作为一种新兴工具在生物技术领域有重要的应用潜力。此前的研究主要集中在开发利用V.natriegens成为体内外重组蛋白生产的工具。然而,许多支持细菌进行快速生长和蛋... 详细信息

【背景】需钠弧菌(Vibrio natriegens)是一种快速生长的革兰氏阴性菌,作为一种新兴工具在生物技术领域有重要的应用潜力。此前的研究主要集中在开发利用V.natriegens成为体内外重组蛋白生产的工具。然而,许多支持细菌进行快速生长和蛋白质生产的生理活动大部分仍未确定。外膜囊泡(Outer Membrane Vesicle,OMV)是由革兰氏阴性细菌普遍产生的一种球形小泡,其不仅具有重要的功能,而且还可以作为一种应用于疫苗治疗的高效运载工具。【目的】表征指数生长期OMV的蛋白质组并利用OMV进行异源蛋白的递送。【方法】使用透射电镜、动态光散射和质谱学的方法,观察OMV的形态及粒径分布并鉴定蛋白组成。以超折叠绿色荧光蛋白(Superfolded Green Fluorescent Protein,sfGFP)作为货物蛋白来确定OMV蛋白载体。【结果】从细菌培养的指数期中期和末期分别提取的OMV中鉴定到了288个和317个蛋白。这些蛋白分属不同的功能组,包括ABC转运蛋白、鞭毛、双组分系统。相比之下,同时鉴定了全细胞样品,其在指数期中期和末期分别含有1480个和1565个蛋白。我们筛选OMV的蛋白作为候选载体发现了一种属于OmpA家族的蛋白(命名为OmpA24),其能够将sfGFP以融合货物蛋白的形式运载到OMV中。【结论】首次证实V.natriegens能够在指数生长期产生OMV,并展示了第一个不同生长时期OMV和全细胞的蛋白质组鉴定结果。OmpA24是将外源融合货物蛋白呈递到OMV中的有前景的载体。本研究有助于促进V.natriegens在蛋白表达和OMV介导的分泌中的应用。

关键词：需钠弧菌外膜囊泡生物技术

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神经节苷脂氟化寡糖在大肠杆菌中的生物合成

生物技术通报 2019年第8期35卷 162-169页

作者：刘新平谭玉萌张雪冯雁杨广宇上海交通大学生命科学技术学院

神经节苷脂是一类存在于所有脊椎动物细胞中的糖脂分子,具有重要的生理功能和药用活性。合成生物学为构建神经节苷脂类的人工高效合成体系提供了契机,而其神经节苷脂氟化寡糖中间体的合成是至关重要的步骤。旨在实现神经节苷脂氟化寡糖... 详细信息

神经节苷脂是一类存在于所有脊椎动物细胞中的糖脂分子,具有重要的生理功能和药用活性。合成生物学为构建神经节苷脂类的人工高效合成体系提供了契机,而其神经节苷脂氟化寡糖中间体的合成是至关重要的步骤。旨在实现神经节苷脂氟化寡糖在大肠杆菌中的人工生物合成途径:通过在大肠杆菌JM107中引入来源于脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的CMP-NeuAc合成酶(neuA),空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)来源的α2,3-NeuAc转移酶(cst)、β1,4-GalNAc转移酶(cgtA)、β1,3-Gal转移酶(cgtB)和UDP-GlcNAc异构酶(gne),成功构建了以氟化乳糖和唾液酸为底物的3种神经节苷脂GM3、GM2、GM1氟化寡糖在大肠杆菌中的生物合成途径;开发了高灵敏度的氟化寡糖柱前衍生-HPLC定量检测方法;并通过对工程菌株进行透酶过表达和启动子优化,在摇瓶发酵中GM3、GM2及GM1氟化寡糖的产量分别达到81.5mg/L、18.1mg/L及12.3mg/L,为进一步的代谢工程改造奠定了良好的基础。

关键词：大肠杆菌神经节苷脂合成生物学氟化寡糖生物合成

不同调控元件及组合对烟草外源蛋白瞬时表达的效果分析

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生物技术通报 2020年第7期36卷 62-71页

作者：刘文浩王瑞丰刘琬琳许杰上海交通大学生命科学技术学院上海200240

植物瞬时表达是一种高效快速获得外源基因表达的方法,该系统主要应用于蛋白互作研究、调控元件功能分析、蛋白亚细胞定位和蛋白制剂合成等方面。为了进一步提高外源基因在瞬时表达体系中稳定表达效果,本研究对瞬时表达载体的多种作用元... 详细信息

植物瞬时表达是一种高效快速获得外源基因表达的方法,该系统主要应用于蛋白互作研究、调控元件功能分析、蛋白亚细胞定位和蛋白制剂合成等方面。为了进一步提高外源基因在瞬时表达体系中稳定表达效果,本研究对瞬时表达载体的多种作用元件及转化条件进行优化。首先,我们在目前最常用的双元表达载体pCambia1300骨架上,分别添加可增强特异性转录和稳定蛋白表达的新的调控元件,构建pREU-EF、pREUR-EF和pREUR-p24-EF重组表达载体,并且通过定性和定量方法分析不同元件组合、不同菌液浓度对报告基因eGFP表达的影响。激光共聚焦显微镜观察结果证明3个重组载体可在烟草叶片的细胞膜、细胞质和细胞核中快速表达报告基因;定量PCR分析表明3个重组载体中报告基因在转录表达水平上分别比原pCambia1301-eGFP载体提高了4倍、20倍和28倍;蛋白水平分析表明烟草叶片转化48 h后,pREUR-EF外源蛋白表达量明显高于pREU-EF;并且当菌液注射液浓度OD600=0.4左右时,外源蛋白的表达效率最高。此外,我们还进一步把改造后的瞬时表达重组载体运用到双荧光素酶(Dual-Luciferase)报告系统中,实验证明改造后的瞬时表达重组载体可以更加快捷和有效地用于转录调控分析。因此,烟草瞬时表达载体中作用元件增加和优化组合,可以有效地提高外源蛋白的表达。

关键词：植物瞬时表达调控元件烟草转录调控双荧光素酶

三种数字PCR平台对多靶标质粒标准物质的定值

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农业生物技术学报 2017年第9期25卷 1500-1507页

作者：郑兰杨立桃王灿华上海交通大学生命科学技术学院

数字PCR是一种不依赖于外部标准曲线而对目标DNA/RNA进行绝对定量的测量技术,在转基因生物的定量检测、外源基因拷贝数分析以及标准物质定值方面具有广阔的应用前景。本研究基于3种数字PCR平台:微流控芯片数字PCR（chamber digital PCR,... 详细信息

数字PCR是一种不依赖于外部标准曲线而对目标DNA/RNA进行绝对定量的测量技术,在转基因生物的定量检测、外源基因拷贝数分析以及标准物质定值方面具有广阔的应用前景。本研究基于3种数字PCR平台:微流控芯片数字PCR（chamber digital PCR,cd PCR）、QX100;微滴数字PCR（droplet digital PCR,dd PCR）和Quant Studio;3D数字PCR（3D digital PCR,3D-d PCR）,分别测定转基因油菜（Brassica campestris）多靶标质粒DNA标准分子p CAN的外源品系特异性序列拷贝数和內源标准基因磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因（phosphoenolpyruvate carboxylase,PEP）拷贝数,二者之比即为p CAN标准分子的特性量值。实验结果表明,三种数字PCR平台对多靶标质粒分子的各靶标的量值测定结果均接近真实值1（copies/copies）,且反应体系稳定,重复性良好,相对标准差（relative standard deviation,RSD）均小于25%,说明这三种数字PCR技术均能准确地对质粒标准物质进行定值。同时,本研究建立的基于cd PCR、dd PCR和3D-d PCR平台的质粒标准物质的定值方法也为其他形式标准物质的定值提供新的方法借鉴。

关键词：转基因生物多靶标质粒标准物质微流控芯片数字PCR QX100 微滴式数字PCR QuantStudio 3D数字PCR

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负碳人工光合群落的设计、优化与应用

合成生物学 2024年

作者：郑皓天李朝风刘良叙王嘉伟李恒润倪俊上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海交通大学张江高等研究院

CO2生物转化技术的开发为解决能源转型和气候变化问题提供了可能。人工光合群落是由密切协作的光合自养微生物与异养微生物组成的新一代生物炼制平台，能够通过群落成员间的互利代谢分工，高效地利用光能将CO2直接转化为生物质和多种化... 详细信息

CO2生物转化技术的开发为解决能源转型和气候变化问题提供了可能。人工光合群落是由密切协作的光合自养微生物与异养微生物组成的新一代生物炼制平台，能够通过群落成员间的互利代谢分工，高效地利用光能将CO2直接转化为生物质和多种化学品，是实现负碳生物制造的潜在途径之一，因其在适用性和鲁棒性方面的优势受到了广泛的关注。近年来，随着系统生物学研究和合成生物技术的快速发展，多种研究策略被用于人工光合群落的设计与优化，取得了长远的进展，促进了对光合群落生产的理解。本文综述了光合群落的互作机制、独到优势和系统生物学研究方法，着重介绍人工光合群落的底盘升级、固定化/区室化技术、加强内部多层次调控等设计与优化策略以及在不同领域的应用进展。在此基础上，探讨了进一步将人工光合群落规模化应用所面临的光合效率和中间碳水化合物限制以及外源生物污染等潜在挑战，对纳米半导体材料杂合、物种间精细互作关系调控、基于多组学数据的群落模型构建等未来的改造方向和研究策略进行了展望。

关键词：合成生物学光合群落负碳生物合成 CO 利用系统生物学群体感应

Osa在果蝇卵巢生殖干细胞分化中的功能研究

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生物技术通报 2017年第9期33卷 139-144页

作者：李敏瞿杰李梦婕胡晓龙上海交通大学生命科学技术学院上海200240

果蝇卵巢生殖干细胞(Germline stem cell,GSC)是在活体(in vivo)研究干细胞命运调控的理想平台。表观遗传机制在果蝇卵巢GSC命运调控中发挥重要作用,其机理的探明需要研究并发现更多参与此过程的表观调控因子。为探究果蝇染色质重塑复合... 详细信息

果蝇卵巢生殖干细胞(Germline stem cell,GSC)是在活体(in vivo)研究干细胞命运调控的理想平台。表观遗传机制在果蝇卵巢GSC命运调控中发挥重要作用,其机理的探明需要研究并发现更多参与此过程的表观调控因子。为探究果蝇染色质重塑复合物BAP中特有的亚基Osa在果蝇卵巢GSC分化调控中的功能及其分子机理,利用GAL4/UAS二元表达系统结合RNAi技术在干细胞微环境组分护卫细胞(Escort cells,ECs)中特异性下调osa的表达,并通过免疫荧光染色法对相关指标进行检测。结果显示,敲减ECs中osa可致卵巢组织卵原区中未分化生殖细胞数目(Undifferentiated germ cells,UGCs)显著增多,同时BMP信号通路激活标志p Mad、Dad-lacZ阳性细胞数目显著增多,并观察到EC细胞形态异常,不能有效包裹生殖系细胞。推论Osa以BMP信号通路依赖方式参与果蝇卵巢GSC的分化调控,其作用机理还可能涉及EC细胞特定的形态学过程。

关键词：果蝇 Osa 生殖干细胞分化