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酶消化细胞团块法对人胚胎干细胞中OCT4与SOX2蛋白水平的影响

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上海交通大学学报（医学版） 2021年第4期41卷 413-420页

作者：孙潇智李爽金颖廖兵上海交通大学基础医学院组织胚胎与遗传发育学系上海200025

目的·探究酶消化细胞团块法对人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)的八聚体结合转录因子4(octamerbinding protein 4,OCT4)和性别决定区Y框蛋白2(sex determining region Y-box 2,SOX2)蛋白水平的影响及可能的作用机制。方法·(1)利用Western blotting分析检测酶消化细胞团块法[分散酶Dispase或胶原酶Ⅳ(collagenase typeⅣ,COL4)]、酶消化单细胞法(细胞分离溶液Accutase或胰酶)和机械刮取法对hESC中OCT4和SOX2蛋白水平的影响。(2)使用金属离子螯合剂乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)破坏hESC-hESC细胞间连接,然后利用Western blotting检测EGTA单独处理或联合COL4处理对hESC中OCT4与SOX2的蛋白水平的影响。(3)通过基于质谱的定量蛋白质组学技术,检测COL4单独处理或与EGTA联合处理hESC细胞样本中差异表达的磷酸化蛋白和总蛋白,并进行功能富集分析。(4)利用Western blotting和免疫荧光染色检测蛋白酶体抑制剂bortezomib或溶酶体抑制剂氯喹预处理对COL4引起的hESC中OCT4与SOX2蛋白水平下调的影响。(5)利用Western blotting检测COL4对丝切蛋白(cofilin)的影响,以及Rac1小分子抑制剂EHT1864和EHop-016对SOX2蛋白表达水平的影响。结果·(1)COL4和Dispase引起OCT4和SOX2的蛋白水平下降;Accutase、胰酶和机械刮取法未观察到此作用。(2)EGTA处理能够抑制COL4消化hESC引起的OCT4和SOX2蛋白水平下降。(3)蛋白质谱和功能富集分析发现,COL4消化hESC引起的OCT4和SOX2蛋白水平下降可能与肌动蛋白微丝(actin filament,F-actin)、微管和溶酶体相关蛋白的变化有关。(4)氯喹能够抑制COL4消化hESC引起的OCT4和SOX2蛋白水平下降,bortezomib则不能。(5)COL4处理或Rac1抑制剂均能下调cofilin和SOX2的蛋白水平。结论·当使用酶消化细胞团块法处理hESC时,OCT4和SOX2蛋白水平下降,Rac1/cofilin/F-actin信号通路和溶酶体可能参与其中。

关键词：人胚胎干细胞细胞外基质八聚体结合转录因子4 性别决定区Y框蛋白2 溶酶体丝切蛋白

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人胚胎干细胞多基因同时抑制系统的建立

上海交通大学学报（医学版） 2019年第5期39卷 478-486页

作者：朱超南陈沁雯辛晨歌李慧上海交通大学基础医学院组织胚胎学与遗传发育学系

目的·在人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)中构建基于CRISPR 干扰系统的多基因同时抑制系统,作为研究家族基因功能和构建多基因疾病模型的工具。方法·通过Golden Gate 克隆法在hESCs 中建立受强力霉素(doxycycline,Dox... 详细信息

目的·在人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)中构建基于CRISPR 干扰系统的多基因同时抑制系统,作为研究家族基因功能和构建多基因疾病模型的工具。方法·通过Golden Gate 克隆法在hESCs 中建立受强力霉素(doxycycline,Dox)调控的多基因CRISPR 干扰系统。该系统主要由2 个质粒组成:1 个质粒在Dox 调控下融合表达核酸酶失活的CRISPR 相关蛋白9(nucleasedeactivatedCRISPR-associated protein 9,dCas9)和Krüppel 相关盒(Krüppel-associated box,KRAB)抑制结构域(dCas9-KRAB),另1 个质粒可同时表达8 个独立的导向RNA(guide RNA,gRNA)来分别引导dCas9-KRAB 蛋白到基因组特定位点抑制转录起始或延伸。以基因组DNA 为模板进行PCR,确定2 个质粒是否整合至细胞基因组,并通过Western blotting 确定细胞在Dox 诱导下是否可表达dCas9-KRAB 蛋白。结果·使用这种可调控的多基因CRISPR 干扰系统,可在Dox 诱导下在hESCs 中同时成功抑制多个基因的表达;并且这些基因的表达被抑制导致hESCs 形态改变,碱性磷酸酶活性下降,hESCs 表面标志物阶段特异性胚胎表面抗原4(stagespecificembryonic antigen 4,SSEA4)的表达下降,hESCs 发生分化。结论·该CRISPR 干扰系统可以在hESCs 中高效地同时抑制多个基因的表达,是十分有效的多基因研究工具。

关键词： CRISPR干扰系统可诱导的多基因同时抑制 GoldenGate克隆法人胚胎干细胞

MUC1在HER2阳性乳腺癌发病中的作用及机制研究

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上海交通大学学报（医学版） 2021年第7期41卷 839-848页

作者：王成志邓华云庞智黄雷上海交通大学基础医学院组织胚胎学与遗传发育学系上海200025

目的·研究黏蛋白1(mucin 1,MUC1)在人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)阳性乳腺癌发病中的作用及其调控的分子机制。方法·使用病毒感染技术构建MT2/MUC1诱导表达细胞株和MT2/Vec及MT2/CD过表达细... 详细信息

目的·研究黏蛋白1(mucin 1,MUC1)在人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)阳性乳腺癌发病中的作用及其调控的分子机制。方法·使用病毒感染技术构建MT2/MUC1诱导表达细胞株和MT2/Vec及MT2/CD过表达细胞株;采用蛋白质印迹法(Western blotting)检测过表达MUC1和MUC1-CD后6-磷酸葡萄糖脱氢酶(glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase,G6PD)的蛋白质表达水平;通过细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)法、平板克隆形成实验、细胞划痕实验、Transwell迁移实验和肿瘤细胞成球实验,研究MUC1对HER2阳性乳腺癌细胞MT2增殖、克隆形成、迁移和成球的影响;使用GP6D的抑制剂6-AN抑制酶活性,CCK-8检测乳腺癌细胞增殖;采用GEPIA和Kaplan-Meier Plotter数据库分析HER2、MUC1和G6PD在乳腺癌中的表达及其对乳腺癌患者生存期的影响。结果·过表达MUC1或MUC1-CD促进HER2阳性乳腺癌细胞MT2的增殖、克隆形成、迁移和成球,并且提高G6PD的蛋白质表达水平。抑制G6PD活性显著降低MUC1和MUC1-CD诱导的细胞增殖。G6PD蛋白在乳腺癌组织中表达上调且与乳腺癌患者生存期缩短相关。结论·MUC1可能通过调控G6PD的表达促进HER2阳性乳腺癌的进程,提示抑制磷酸戊糖途径可能成为HER2阳性乳腺癌治疗的靶点。

关键词：乳腺癌黏蛋白1 磷酸戊糖途径 6-磷酸葡萄糖脱氢酶

与MUC1共同调控肿瘤化疗耐药的MUCIN家族成员的筛选

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上海交通大学学报（医学版） 2022年第9期42卷 1288-1295页

作者：汤开然吴琼黄思佳邱旭东李文彦邓华云黄雷上海交通大学基础医学院组织胚胎学与遗传发育学系上海200025

目的·在黏蛋白(MUCIN)家族成员中,筛选与黏蛋白1(mucin 1,MUC1)协同调控肿瘤细胞化学治疗(化疗)耐药的蛋白。方法·利用2对细胞系(紫杉醇耐药细胞HeLa229/TR-CasCTL和MUC1敲除细胞HeLa229/TR-CasMUC1,母本细胞HeLa229/P和紫杉醇耐药细... 详细信息

目的·在黏蛋白(MUCIN)家族成员中,筛选与黏蛋白1(mucin 1,MUC1)协同调控肿瘤细胞化学治疗(化疗)耐药的蛋白。方法·利用2对细胞系(紫杉醇耐药细胞HeLa229/TR-CasCTL和MUC1敲除细胞HeLa229/TR-CasMUC1,母本细胞HeLa229/P和紫杉醇耐药细胞HeLa229/TR),应用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技术检测MUCIN家族成员的mRNA表达水平,分析其与MUC1表达的相关性;通过蛋白质印迹法(Western blotting)检测筛选出的MUCIN家族成员的蛋白表达水平,以筛选出在mRNA和蛋白水平均与MUC1表达存在相关性的靶蛋白;通过短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)方法沉默靶基因,利用药物半抑制浓度(half-maximum inhibitory concentration,IC^(50))实验检测细胞耐药性的变化;进一步利用GEPIA数据库分析多种肿瘤组织中MUC1和MUC13的平均表达水平;采用R2数据库分析在宫颈癌、结肠癌和胰腺癌组织中MUC1与MUC13表达的线性相关性;通过Kaplan-Meier Plotter数据库分析MUC1和MUC13的表达与胃癌患者生存率的关系。结果·qPCR检测结果显示,在MUCIN家族成员中,与MUC1在mRNA水平存在相关性的有MUC13和MUC18;Western blotting检测结果显示,在蛋白水平,只有MUC13随着MUC1的上调而上调,随着MUC1的敲除而下调;IC^(50)实验结果显示,随着MUC13的沉默,肿瘤细胞对紫杉醇的IC^(50)明显下降。进一步利用GEPIA数据库分析发现,在多种肿瘤组织中MUC1与MUC13存在同时高表达或低表达的特点;通过R2数据库分析发现,MUC1和MUC13的表达量在宫颈癌、结肠癌和胰腺癌肿瘤组织中呈正相关;通过Kaplan-Meier Plotter数据库分析发现,MUC1和MUC13的表达量与胃癌患者的生存率呈负相关。结论·MUC1与MUC13在肿瘤细胞化疗耐药中存在协同作用,同时与肿瘤患者的生存预后密切相关;临床上联合抑制MUC1和MUC13在肿瘤细胞化疗耐药治疗上具有可行性。

关键词：黏蛋白家族黏蛋白1 协同作用化学治疗耐药

SUMO特异肽酶3调控小鼠睾丸Sertoli细胞自噬

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上海交通大学学报（医学版） 2019年第7期39卷 706-713页

作者：陶亚群朱慧琴潘艺青劳一敏易静杨洁上海交通大学基础医学院生物化学与分子细胞生物学系上海200025 上海交通大学基础医学院组织胚胎与遗传发育学系上海200025

目的·探讨小鼠睾丸中SUMO特异肽酶3(SUMO specific peptidase3,SENP3,又称SUMO特异蛋白酶3)对自噬的调控作用。方法·采用免疫荧光法对SENP3在睾丸生精细胞和支持细胞(Sertoli cells,简称Sertoli细胞)中的定位进行检测。对Senp3野生型(... 详细信息

目的·探讨小鼠睾丸中SUMO特异肽酶3(SUMO specific peptidase3,SENP3,又称SUMO特异蛋白酶3)对自噬的调控作用。方法·采用免疫荧光法对SENP3在睾丸生精细胞和支持细胞(Sertoli cells,简称Sertoli细胞)中的定位进行检测。对Senp3野生型(Senp3+/+)小鼠和Senp3基因敲除杂合子(Senp3+/-)小鼠进行饥饿处理,诱导自噬的发生。提取小鼠的睾丸组织蛋白质,采用Western blotting检测自噬的程度。利用透射电子显微镜技术、免疫荧光法检测睾丸组织切片中的细胞自噬,并区分睾丸生精细胞和Sertoli细胞自噬的程度。结果·SENP3主要定位于Sertoli细胞核。与Senp3+/+小鼠相比,Senp3+/-小鼠饥饿后,Sertoli细胞自噬增加。结论·SENP3能够抑制营养缺乏时Sertoli细胞自噬,可能对细胞自噬的程度发挥控制作用。

关键词：自噬 SUMO特异蛋白酶3 睾丸支持细胞(Sertoli细胞)

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黏蛋白1与肿瘤相关蛋白的调控网络研究

上海交通大学学报（医学版） 2022年第8期42卷 1024-1033页

作者：褚云开廖春华邓华云黄雷上海交通大学医学院组织胚胎学与遗传发育学系上海200025

目的·研究黏蛋白1(mucin1,MUC1)在不同肿瘤组织中的表达水平及其对患者生存期的影响;通过分析与MUC1存在相互作用的肿瘤相关蛋白的调控网络,预测MUC1参与肿瘤发生发展的可能机制。方法·使用GEPIA 2在线平台对MUC1在33种肿瘤中的mRNA水... 详细信息

目的·研究黏蛋白1(mucin1,MUC1)在不同肿瘤组织中的表达水平及其对患者生存期的影响;通过分析与MUC1存在相互作用的肿瘤相关蛋白的调控网络,预测MUC1参与肿瘤发生发展的可能机制。方法·使用GEPIA 2在线平台对MUC1在33种肿瘤中的mRNA水平,以及其与患者生存期的关系进行分析。在HEK293T细胞中转染MUC1-HA质粒,用HA抗体进行免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)实验,对MUC1结合蛋白进行液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LCMS/MS)分析。使用String 11.5在线平台对MUC1结合蛋白的亚细胞定位、分子功能、涉及的疾病、参与的生物学过程以及这些蛋白之间的相互作用调控网络进行分析。结果·MUC1在乳腺癌、宫颈癌、弥漫性大B细胞瘤、多发性胶质细胞瘤、低级别脑胶质瘤、卵巢癌、胰腺癌、胸腺癌和子宫内膜癌等9种肿瘤中高表达;对这9种肿瘤中MUC1表达与生存期的关系分析发现,MUC1表达与生存期呈负相关,其中在乳腺癌、宫颈癌、多发性胶质细胞瘤、低级别脑胶质瘤、胰腺癌和胸腺癌等6种肿瘤中具有统计学意义。质谱分析共检测到526个MUC1结合蛋白,这些蛋白定位于细胞器、细胞质和膜结构最多;主要分子功能包括蛋白结合、离子结合和酶活性等;涉及的疾病有解剖实体性疾病、细胞增殖性疾病、代谢性疾病和癌症等;参与的生物学过程主要包括细胞应激、代谢、发育和生物合成等。MUC1结合蛋白主要参与代谢、癌症、cGMP-依赖cGMP的蛋白激酶(cGMP-dependent protein kinase,PKG)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)和细胞周期等信号通路;深入分析后发现,MUC1结合蛋白一方面大量参与到Wnt/β-catenin、Notch和cAMP等癌症相关信号通路,另一方面通过调控代谢、凋亡和细胞周期促进肿瘤的发生发展。结论·MUC1在多种肿瘤组织中高表达并与患者预后不良相关;MUC1通过蛋白相互作用参与调控细胞代谢和肿瘤相关信号通路。该研究创新性地发现多个新的MUC1结合蛋白,可为进一步研究MUC1生物学新功能奠定基础。

关键词：黏蛋白1 肿瘤生存分析蛋白质组信号通路

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灵长类特异基因在男性生殖系统中的作用探究

中国科学：生命科学 2024年第1期54卷 94-102页

作者：周大鹏李阔阔田世雄周怡伶张锋贺小进刘春雨复旦大学附属妇产科医院遗传工程国家重点实验室生殖与发育研究院上海200011 复旦大学人类表型组研究院代谢与整合生物学研究院上海200438 安徽医科大学第一附属医院国家卫生健康委配子及生殖道异常研究重点实验室合肥230022 上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院上海200030

男性不育是一类多因素的复杂疾病.作为导致男性不育的重要因素,弱畸精子症越来越受到人们的关注并且被发现与遗传因素有关.随着高通量测序技术的不断发展,多个弱畸精子症的致病基因被揭示.其中,对于在人和小鼠中进化保守的致病基因,利... 详细信息

男性不育是一类多因素的复杂疾病.作为导致男性不育的重要因素,弱畸精子症越来越受到人们的关注并且被发现与遗传因素有关.随着高通量测序技术的不断发展,多个弱畸精子症的致病基因被揭示.其中,对于在人和小鼠中进化保守的致病基因,利用传统的基因编辑小鼠模型即可完成表型或致病机理的探究.然而,随着研究的进行,人们陆续发现了与生殖疾病相关的一类灵长类特异基因(primate specific genes, PSGs),即存在人类基因组中、在灵长类和小鼠进化分支产生后出现的基因.对于此类基因,小鼠不再是疾病研究的理想模型,新的动物模型以及研究系统的探索尤为必要.本文在总结前期利用小鼠模型开展弱畸精子症遗传致病机理以及干预探究的基础上,重点介绍了新近发现的灵长类特异基因在男性生殖系统中的作用及研究系统构建.相关论述不仅为遗传咨询和临床诊断提供理论指导,也将为睾丸组织中富集的灵长类特异基因在生殖系统中的功能探索提供新的研究思路.

关键词：男性不育弱畸精子症 PSGs 新型研究系统

无化学修饰的小分子药物靶蛋白鉴定技术及其应用进展

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生物工程学报 2021年第4期37卷 1131-1138页

作者：马婕刘强上海交通大学医学院基础医学院组织胚胎学与遗传发育学系上海市生殖医学重点实验室上海200025

鉴定小分子药物的靶蛋白对于理解药物的作用机理以及药物副作用至关重要。传统方法需要对药物进行化学修饰共价交联,可能会导致药物活性的改变。目前已经发展多种无需化学修饰便可以对药物靶蛋白鉴定的方法,包括药物亲和力反应靶标稳定... 详细信息

鉴定小分子药物的靶蛋白对于理解药物的作用机理以及药物副作用至关重要。传统方法需要对药物进行化学修饰共价交联,可能会导致药物活性的改变。目前已经发展多种无需化学修饰便可以对药物靶蛋白鉴定的方法,包括药物亲和力反应靶标稳定性技术(Drug affinity responsive target stability,DARTS)、蛋白质氧化速率稳定性技术(Stability of proteins from rates of oxidation,SPROX)、细胞热移位分析技术(Cellular thermal shift assay,CETSA)和热蛋白组分析技术(Thermal proteome profiling,TPP)等。文中将介绍这些技术的原理、应用以及各自的优点和局限性,另外也介绍了这些技术最新的优化方案。

关键词：小分子药物无共价修饰药物亲和力反应靶标稳定性蛋白质氧化速率稳定性细胞热移位分析热蛋白质组分析

沙乌头猪生长发育及繁殖性状全基因组关联研究

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中国畜牧杂志 2024年第8期60卷 97-104页

作者：李何君张彩云李拓芜马裴裴吴昊旻徐忠惠陆雪林上海农林职业技术学院上海201699 上海交通大学农业与生物学院上海200240 上海市动物疫病预防控制中心上海201103 上海市崇明区种畜场上海202177

本文旨在通过全基因组关联分析方法鉴定与沙乌头猪生长发育及繁殖性状相关的基因。本研究数据来自沙乌头猪保种场2019年采集的26头生产公猪和207头生产母猪,采集耳组织样后,利用中芯一号基因芯片进行检测,经过填充及质控后,使用主成分... 详细信息

本文旨在通过全基因组关联分析方法鉴定与沙乌头猪生长发育及繁殖性状相关的基因。本研究数据来自沙乌头猪保种场2019年采集的26头生产公猪和207头生产母猪,采集耳组织样后,利用中芯一号基因芯片进行检测,经过填充及质控后,使用主成分分析方法检验群体分层情况。同时测定这些猪的生长发育及繁殖数据,包括6月龄体重、体长、胸围、体高、胸深及总产仔数、产活仔数、死胎数、初生窝重、断奶仔猪数和断奶窝重,使用混合线性模型对这些性状分别进行全基因组关联分析。结果表明,沙乌头猪群体内无明显分层。全基因组关联分析方法鉴定到影响产活仔数的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)位点共计11个,与初生窝重、体重、胸围显著关联的SNP分别为7、1、1个。为查找关联基因,检测了显著位点上下游100 kb的区段,除产活仔数以外,其他性状均未找到关联基因。与产活仔数关联的基因共计19个,其中CRABP2、STON1、KCNK12、MSH2、VANGL2 5个基因前期被报道与繁殖性状有关,这些基因可作为与沙乌头猪产活仔数关联的候选基因,后续可通过试验进一步验证。本研究为沙乌头猪生长发育及繁殖性状的遗传机制解析提供了理论依据。

关键词：沙乌头猪生长发育性状繁殖性状全基因组关联分析