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小鼠慢性弓形虫病发生过程及其动态变化规律初探

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中国血吸虫病防治杂志 2024年第3期36卷 304-309页

作者：周国庆白邵缘李宇渊朱国鼎黄思扬扬州大学兽医学院比较医学研究院、江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 国家卫生健康委员会寄生虫病预防和控制技术重点实验室、江苏省寄生虫与媒介控制技术重点实验室、江苏省医学重点实验室、江苏省血吸虫病防治研究所教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室江苏扬州225009

目的观察不同形态刚地弓形虫感染后小鼠脑内包囊形成及其动态变化,为弓形虫病防控提供依据。方法取6~8周龄ICR小鼠(20~25 g)建立慢性弓形虫感染模型,其中弓形虫PRU株速殖子按1×10^(5)个/只剂量腹腔注射感染小鼠,包囊和卵囊分别按20、20... 详细信息

目的观察不同形态刚地弓形虫感染后小鼠脑内包囊形成及其动态变化,为弓形虫病防控提供依据。方法取6~8周龄ICR小鼠(20~25 g)建立慢性弓形虫感染模型,其中弓形虫PRU株速殖子按1×10^(5)个/只剂量腹腔注射感染小鼠,包囊和卵囊分别按20、200个/只剂量通过灌胃针口服感染小鼠,观察感染后小鼠临床症状和存活情况。分别以10(低剂量组)、20(中剂量组)、40个包囊/只(高剂量组)剂量感染小鼠,观察弓形虫不同感染剂量对小鼠脑内包囊数量的影响。将小鼠按性别(雌、雄性)、感染时间(感染后20、30、60、90、120、150、180 d)分组,按20个/只剂量口服弓形虫包囊后,分别观察性别和感染时间对小鼠脑内包囊数量的影响。将小鼠分成速殖子组(T组)、包囊1代组(C1组)、包囊2代组(C2组)、包囊3代组(C3组)、包囊4代组(C4组);T组小鼠按1×10^(5)个/只剂量腹腔注射弓形虫速殖子,感染后第30天处死小鼠并收集其脑组织内包囊,再按20个/只感染C1组小鼠。此后每一代小鼠均采用上一代所产生包囊进行口服连续传代,观察连续传代对小鼠脑内弓形虫包囊数量的影响。结果以弓形虫速殖子、包囊、卵囊分别感染小鼠,感染第6~13天小鼠出现明显临床症状、感染第7~12天小鼠出现集中死亡。感染第30天时,感染速殖子、包囊、卵囊的小鼠存活率分别为67.0%、87.0%、53.0%,平均脑内包囊数量分别为(516.0±257.2)、(1203.0±502.0)、(581.0±183.1)个,差异有统计学意义(F=11.94,P学意义(F=0.42,P>0.05);雄、雌性组小鼠存活率分别为73.0%和80.0%,平均脑内包囊数量分别为(946.4±411.4)、(932.1±322.4)个,差异无统计学意义(F=1.63,P>0.05)。通过连续传代感染后,T、C1、C2、C3、C4组小鼠平均脑内包囊数量分别为(516.0±257.2)、(1203.0±502.0)、(896.8±332.3)、(782.5±423.9)、(829.2±306.0)个,差异有统计学意义(F=4.82,P学意义(P<0.01)。小鼠口服20个包囊后,感染第20天首次查见脑内弓形虫包囊,随感染时间延长脑内包囊数量逐渐增加;至感染第30、90天时,脑内包囊数量分别达峰值,此后逐步下降,至感染第180天时仍能查见脑内包囊。结论刚地弓形虫包囊较速殖子、卵囊感染后形成慢性感染的可能性更高,且慢性感染程度亦最严重;感染弓形虫包囊数量与慢性感染严重程度无关;脑内包囊形成数量于感染第30天和90天时达高峰。

关键词：刚地弓形虫慢性弓形虫病包囊卵囊速殖子脑组织小鼠

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多房棘球蚴感染小鼠肝转录组分析及肝纤维化关键基因的筛选与验证

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中国兽医科学 2024年

作者：孙慧李立闫鸿斌李秀荣吴耀东何兴殷宏付宝权贾万忠中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃省动物寄生虫病重点实验室国家动物包虫病专业实验室中国人民解放军海军军医大学江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心

为探究多房棘球蚴感染引起宿主肝纤维化的关键基因变化，通过建立多房棘球蚴感染小鼠模型，利用高通量测序技术获得感染小鼠肝不同时间点差异mRNA表达谱，结合DisGeNET、GeneGard等数据库中已收录的肝纤维化相关基因集，挖掘感染进程中... 详细信息

为探究多房棘球蚴感染引起宿主肝纤维化的关键基因变化，通过建立多房棘球蚴感染小鼠模型，利用高通量测序技术获得感染小鼠肝不同时间点差异mRNA表达谱，结合DisGeNET、GeneGard等数据库中已收录的肝纤维化相关基因集，挖掘感染进程中影响肝纤维化的重要基因。结果显示，多房棘球蚴感染小鼠肝出现胶原纤维沉积；通过转录组测序数据结合vlookup函数检索，发现2943个肝纤维化相关基因在感染不同时间出现差异表达，其中显著上调的基因主要富集在PI3K-Akt等通路上，实时荧光定量PCR验证结果与高通量测序结果一致，通路中神经生长因子（Ngf）、肌腱蛋白C（Tnc）基因在肝星状细胞中表达量显著高于肝实质细胞、肝窦内皮细胞和枯否细胞，在小鼠原代肝星状细胞中敲低Ngf基因影响胶原基因Col1α1及Timp1的表达，推测这些通路和基因可能参与多房棘球蚴感染后致小鼠肝组织纤维化的过程。

关键词：多房棘球蚴转录组测序生物信息学纤维化神经生长因子

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细粒棘球蚴病疫苗的研制现状

中国病原生物学杂志 2024年第1期19卷 107-112页

作者：于涛王利磊赵慧卿解晓曼张妤魏婕山东省寄生虫病防治研究所山东第一医科大学(山东省医学科学院)山东济宁272033 新疆动物疫病研究重点实验室新疆畜牧科学院兽医研究所

细粒棘球蚴病是由细粒棘球蚴寄生引起的人兽共患寄生虫病,呈世界性流行,严重阻碍着畜牧业的发展和人体健康。目前细粒针对棘球蚴病的药物和手术治疗效果尚不理想,切断传播途径是有效的预防手段,预防性疫苗接种是预防细粒棘球蚴病的有效... 详细信息

细粒棘球蚴病是由细粒棘球蚴寄生引起的人兽共患寄生虫病,呈世界性流行,严重阻碍着畜牧业的发展和人体健康。目前细粒针对棘球蚴病的药物和手术治疗效果尚不理想,切断传播途径是有效的预防手段,预防性疫苗接种是预防细粒棘球蚴病的有效措施之一。使用潜在的家畜和犬类疫苗来对抗细粒棘球绦虫生命周期的幼虫和成虫阶段可能是生产强效疫苗的关键,而此类免疫疗法通常无法诱导足够的免疫反应。本文基于粗抗原或针对细粒棘球蚴的活疫苗、DNA疫苗、重组蛋白疫苗、系统疫苗学和/计算建模疫苗等的研究进展进行综述,为研发和改进下一代细粒棘球蚴疫苗提供理论参考。

关键词：细粒棘球蚴病疫苗研制现状免疫保护综述

环形泰勒虫Tams1单个B细胞抗体的制备及鉴定

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中国兽医科学 2024年

作者：张楚晗赵帅阳朱浩瀚苏书晓关贵全罗建勋殷宏刘军龙中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州大学

本研究旨在利用单个B细胞抗体技术制备环形泰勒虫Tams1蛋白特异性单克隆抗体对其反应性进行鉴定。构建重组质粒pET-30a-Tams1，并进行蛋白原核表达与纯化。纯化的Tams1蛋白免疫健康黄牛，第4次免疫后结合流式分选技术，从外周血单个核... 详细信息

本研究旨在利用单个B细胞抗体技术制备环形泰勒虫Tams1蛋白特异性单克隆抗体对其反应性进行鉴定。构建重组质粒pET-30a-Tams1，并进行蛋白原核表达与纯化。纯化的Tams1蛋白免疫健康黄牛，第4次免疫后结合流式分选技术，从外周血单个核细胞获得分泌Tams1特异性单克隆抗体的B淋巴细胞(IgM-/CD21+/抗原+B淋巴细胞)。经单细胞裂解及反转录后，通过巢式PCR扩增获得IgG天然配对的轻/重链可变区域序列，并克隆至包含IgG 轻/重链恒定区域的真核表达载体。配对质粒共转染HEK-293T细胞后，收集细胞培养上清，Western-blot 结果显示所得8株抗体均能与Tams1蛋白结合。同时IFAT结果证明8株抗体可与裂殖子表面抗原Tams1特异性结合。上述结果表明，本研究成功获得8株Tams1特异性单克隆抗体，为后续该蛋白的功能研究及单个B细胞抗体制备技术平台的建立奠定基础。

关键词：环形泰勒虫 Tams1 单个B细胞抗体

基于RPA-CRISPR/Cas12a的异尖线虫快速可视化检测方法

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中国兽医科学 2024年第6期54卷 735-741页

作者：王皓璐赵连静陈秀琴杨亚明吴方伟刘晓雷王洋白雪吉林大学、动物医学学院、人兽共患病研究所、人兽共患病研究教育部重点实验室吉林长春130062 云南省寄生虫病防治所云南普洱665000

为了实现对海产品中异尖线虫的快速、便捷、高效的检测以控制其流行,针对异尖线虫内转录间隔区(ITS)保守序列设计重组酶聚合酶扩增(RPA)引物和CRISPR RNA(crRNA),并通过优化crRNA浓度等反应条件建立RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测体系,并评... 详细信息

为了实现对海产品中异尖线虫的快速、便捷、高效的检测以控制其流行,针对异尖线虫内转录间隔区(ITS)保守序列设计重组酶聚合酶扩增(RPA)引物和CRISPR RNA(crRNA),并通过优化crRNA浓度等反应条件建立RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测体系,并评估该方法的灵敏度、特异性与重复性,通过人工污染样品验证其实际检测能力。结果表明:RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测体系可在40 min内完成反应,敏感性为1 copy/μL,该方法仅能检测出异尖线虫,不与宫脂线虫、肠舌状绦虫、带鱼鱼肉组织、小黄花鱼鱼肉组织反应。本实验建立的RPA-CRISPR/Cas12a荧光可视化检测体系快速、灵敏、特异,可应用于海产品中异尖线虫的检测。

关键词：异尖线虫 RPA CRISPR/Cas12a 可视化检测

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豆状囊尾蚴小胞外囊泡可抑制家兔外周血淋巴细胞NLRP3活化

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中国兽医科学 2024年

作者：蒲桂婷王立群刘婷丽王得先曹珊菱郭小腊殷宏骆学农中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室扬州大学江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心

本研究旨在探究家兔感染豆状囊尾蚴过程中炎症小体的表达。取豆状带绦虫的孕卵节片感染家兔，分离不同感染时期的外周血淋巴细胞，检测NLRP3、IL-1β等炎症小体相关基因的表达水平。同时，收集豆状囊尾蚴的分泌排泄产物，并通过超速离... 详细信息

本研究旨在探究家兔感染豆状囊尾蚴过程中炎症小体的表达。取豆状带绦虫的孕卵节片感染家兔，分离不同感染时期的外周血淋巴细胞，检测NLRP3、IL-1β等炎症小体相关基因的表达水平。同时，收集豆状囊尾蚴的分泌排泄产物，并通过超速离心分离小胞外囊泡，用分泌排泄产物和小胞外囊泡分别处理外周血淋巴细胞，24小时后，qPCR和Western-blot分析炎症小体相关基因的表达变化。结果显示，家兔感染后第30天和60天，炎症小体相关基因NLRP3、IL-1β、Caspase-1及GSDMD的表达水平明显升高，而在感染第90天时明显下降；用分泌排泄产物处理PBLC后，NLRP3、IL-1β、Caspase-1及GSDMD的表达水平也明显升高；而用小胞外囊泡处理细胞后，虽然IL-1β的表达水平升高，但NLRP3、Caspase-1及GSDMD的表达水平明显受到了抑制。说明豆状囊尾蚴可通过其分泌排泄产物或小胞外囊泡调控家兔外周血淋巴细胞炎症小体的活化，从而达到其长期生存和持续感染的目的。

关键词：豆状囊尾蚴 NLRP3炎症小体分泌排泄产物小胞外囊泡

环形泰勒虫SHERLOCK-LF检测方法的建立与初步应用

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中国兽医科学 2024年

作者：苏书晓赵帅阳刘军龙张楚晗朱浩瀚关贵全殷宏罗建勋中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州大学

为快速、准确、简便的对环形泰勒虫感染进行检测，选取环形泰勒虫子孢子表面抗原基因作为靶标分子，设计特异性RPA引物及crRNA（CRISPR RNA）序列，建立环形泰勒虫的特异性高灵敏酶报告基因解锁（specific high-sensitive enzymatic rep... 详细信息

为快速、准确、简便的对环形泰勒虫感染进行检测，选取环形泰勒虫子孢子表面抗原基因作为靶标分子，设计特异性RPA引物及crRNA（CRISPR RNA）序列，建立环形泰勒虫的特异性高灵敏酶报告基因解锁（specific high-sensitive enzymatic reporter unlocking， SHERLOCK）-LF检测方法，并分析该方法的特异性、敏感性和符合率。结果显示：该方法可特异性检测环形泰勒虫基因组，与中华泰勒虫、东方泰勒虫、牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫基因组均无交叉反应，且检测灵敏度达到1.42 copies/μL；与行业标准PCR方法检测结果相比，其符合率达到86.96%。本研究建立的SHERLOCK-LF检测方法可在1.5h内完成对环形泰勒虫的检测，为该病的现场诊断及防控提供了技术支撑。

关键词：环形泰勒虫 RPA Cas13a crRNA 侧向流试纸条

敲低多房棘球蚴let-7-5p可抑制BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞极化和虫体生长

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畜牧兽医学报 2024年第6期55卷 2619-2628页

作者：王立群吴易璇蒲桂婷曹珊菱王得先刘婷丽李红 AMUDA Tharheer Oluwashola 郭小腊殷宏骆学农中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室兰州730046 西北民族大学生命科学与工程学院兰州730030 扬州大学江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009

旨在明确敲低多房棘球蚴emu-let-7-5p对小鼠腹腔巨噬细胞极化和虫体生长的影响。构建表达多房棘球蚴emu-let-7-5p海绵序列的重组腺相关病毒载体,并在293T细胞上验证其抑制效果和特异性。70只清洁级BALB/c小鼠分别经尾静脉注射AAV8-si-le... 详细信息

旨在明确敲低多房棘球蚴emu-let-7-5p对小鼠腹腔巨噬细胞极化和虫体生长的影响。构建表达多房棘球蚴emu-let-7-5p海绵序列的重组腺相关病毒载体,并在293T细胞上验证其抑制效果和特异性。70只清洁级BALB/c小鼠分别经尾静脉注射AAV8-si-let-7-5p、AAV8-control和PBS后两周,每组随机选取2只小鼠分别用Western blot和qRT-PCR分析肝组织中GFP、let-7-5p及其靶基因C/EBP δ的表达。随后,所有小鼠每只腹腔接种1 000个原头蚴,3个月后qRT-PCR检测腹腔巨噬细胞emu-let-7-5p、C/EBP δ、M1型(IL-1β、iNOS和IL-6)和M2型(Arg-1、IL-4和IL-10)相关分子的转录水平,并统计各组小鼠多房棘球蚴的包囊重量和原头蚴数量。结果表明,注射后第15天,AAV8-si-let-7-5p成功靶向小鼠肝脏,并引起emu-let-7-5p的敲低和C/EBP δ的上调表达。感染后3个月,AAV8-si-let-7-5p组小鼠腹腔巨噬细胞emu-let-7-5p和M2型相关分子Arg-1均显著下调,而C/EBP δ和M1型相关分子IL-1β和iNOS均显著上调。此外,AAV8-si-let-7-5p组IL-4和IL-6下调表达,而IL-10上调表达,且小鼠肝脏包囊重量和原头蚴数量显著低于对照组。敲低多房棘球蚴感染小鼠体内emu-let-7-5p,可促进C/EBP δ的表达,进而抑制M2型极化和虫体生长。

关键词：多房棘球蚴 emu-let-7-5p 腹腔巨噬细胞极化虫体生长

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多房棘球绦虫蛋白Musashi-1的克隆及RNA结合功能初步鉴定

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中国兽医科学 2024年

作者：吴易璇仲顺虎郭小腊陈轶霞西北民族大学生命科学与工程学院临夏市动物疫病预防控制中心中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防治国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室

初步探究Musashi-1蛋白在多房棘球蚴中的分布及其与RNA结合的能力。利用RACE技术获得Musashi-1全长，扩增该基因并克隆到载体pET-28a上，表达并纯化Musashi-1重组蛋白用于制备多克隆抗体；免疫荧光观察Musashi-1在多房棘球蚴组织中的分... 详细信息

初步探究Musashi-1蛋白在多房棘球蚴中的分布及其与RNA结合的能力。利用RACE技术获得Musashi-1全长，扩增该基因并克隆到载体pET-28a上，表达并纯化Musashi-1重组蛋白用于制备多克隆抗体；免疫荧光观察Musashi-1在多房棘球蚴组织中的分布；双荧光素酶试验检测Musashi-1蛋白与RNA结合能力。结果显示多房棘球绦虫Musashi-1基因有两个转录本，分别为1 017 bp和966 bp。Western-blot结果表明，制备的多克隆抗体能够特异性识别天然多房棘球绦虫Musashi-1蛋白。免疫荧光试验表明Musashi-1蛋白主要分布在多房棘球蚴生发层细胞中。在亚细胞水平上，Musashi-1蛋白主要分布在细胞质中。双荧光素酶试验表明Musashi-1蛋白能够与Musashi家族共识别RNA基序(富含GUA)结合。本研究确定了编码Musashi-1基因的全长，证实Musashi-1蛋白主要分布在多房棘球蚴生发层细胞中，具有RNA结合能力。本研究为进一步探讨多房棘球绦虫Musashi-1蛋白在多房棘球蚴生发层细胞中的功能提供了帮助。

关键词：多房棘球绦虫 RNA结合蛋白 Musashi-1 生发层