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检测H6亚型禽流感病毒的双抗体夹心ELISA方法的建立及初步应用

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中国家禽 2024年

作者：万志敏龚简汐赵喆泓汤婷李亚锋谢泉李拓凡邵红霞秦爱建叶建强扬州大学兽医学院禽类预防医学教育部重点实验室江苏省动物预防医学重点实验室江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州大学农业科技发展研究院(国际联合实验室) 教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室

为建立快速检测H6亚型禽流感病毒的血清学方法，试验利用前期制备的两株抗H6亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体，建立检测H6亚型禽流感病毒的双抗体夹心ELISA方法，并进行特异性、灵敏度、稳定性试验以及对活禽市场采集的48份咽拭子样品... 详细信息

为建立快速检测H6亚型禽流感病毒的血清学方法，试验利用前期制备的两株抗H6亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体，建立检测H6亚型禽流感病毒的双抗体夹心ELISA方法，并进行特异性、灵敏度、稳定性试验以及对活禽市场采集的48份咽拭子样品的检测效果。结果显示：该ELISA方法只与H6亚型禽流感病毒反应，而与H1、H3、H4、H5、H7、H9、H10、H12等其他亚型禽流感病毒，血清4型禽腺病毒、血清8b型禽腺病毒、血清3型鸭腺病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、鹅星状病毒、小鹅瘟病毒、传染性法氏囊病病毒以及禽白血病病毒均无交叉反应；该ELSIA方法可检测2.32×10～4 TCID50/mL H6亚型禽流感病毒，批间和批内重复试验变异系数均小于10%；该ELISA方法和RT-PCR方法对活禽市场采集的48份咽拭子样品检测结果一致，进一步检测攻毒鸡的咽拭子显示该方法可有效检测咽拭子中H6亚型禽流感病毒。研究表明，基于两株单克隆抗体建立的检测H6亚型禽流感病毒的双抗体夹心ELISA方法具有特异性强、灵敏度高的特点，适用于H6亚型禽流感病毒感染的临床检测。

关键词： H6亚型禽流感病毒单克隆抗体血凝素蛋白双抗体夹心ELISA

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A型塞内卡病毒VP1蛋白的抗体制备及鉴定

中国兽医科学 2024年

作者：李佳乐郭子强罗梦唐银保帅文娜李丽薇周艳君姜一峰童武童光志丛雁方高飞中国农业科学院上海兽医研究所广西大学动物科学技术学院南京农业大学动物医学院扬州大学江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心青岛动保国家工程技术研究中心有限公司

本研究旨在制备A型塞内卡病毒（SVA）VP1的多克隆抗体，并用重组病毒rPRRSV-SVA-VP1和真核质粒pcDNA3.1-VP1-Myc进行验证。首先对VP1序列进行优化分析，合成序列后插入克隆载体中，构建原核表达质粒pET-VP1，并转化至感受态*** BL21（DE... 详细信息

本研究旨在制备A型塞内卡病毒（SVA）VP1的多克隆抗体，并用重组病毒rPRRSV-SVA-VP1和真核质粒pcDNA3.1-VP1-Myc进行验证。首先对VP1序列进行优化分析，合成序列后插入克隆载体中，构建原核表达质粒pET-VP1，并转化至感受态*** BL21（DE3）细胞，经IPTG诱导后，获得重组VP1蛋白。将该重组蛋白免疫新西兰大白兔，制备获得重组VP1蛋白的多克隆抗体。此外，利用本团队构建并保存的能够稳定表达SVA VP1蛋白的重组病毒rPRRSV-SVA-VP1感染Marc-145细胞后，用上述制备的VP1多克隆抗体进行验证。结果显示，pET-VP1在大肠杆菌中于37 ℃经1 mmol/L的IPTG诱导12 h，成功表达约37 ku目的蛋白；Western-blot结果显示，制备的多克隆抗体能特异性识别VP1蛋白；间接免疫荧光试验表明，制备的多克隆抗体能够特异性识别rPRRSV-SVA-VP1感染Marc-145细胞后表达的VP1蛋白和真核质粒pcDNA3.1-VP1-Myc转染至293T细胞后表达的VP1蛋白。上述结果表明，本研究制备的VP1多克隆抗体具有良好的反应性和特异性，为SVA血清学检测方法的建立以及SVA VP1蛋白的生物学功能的研究奠定了基础。

关键词： A型塞内卡病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒 VP1蛋白多克隆抗体原核表达活病毒载体

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羊用布鲁氏菌病疫苗研究进展

中国畜牧兽医 2024年第9期51卷 4043-4051页

作者：邱东旭吕浪皮向成冯宇蒋卉陈祥丁家波中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物生物安全与公共卫生防控科技创新团队北京100193 北京邦卓生物科技有限公司北京100183 江苏省人兽共患病学重点实验室江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225000

布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏菌引起的一种重要的人兽共患病,在全球广泛流行,造成了严重的经济损失并威胁公共卫生安全。中国是布病严重流行的国家之一,在高流行地区实施疫苗免疫接种是预防布病传播的有效策略之一。中国流行菌株主... 详细信息

布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏菌引起的一种重要的人兽共患病,在全球广泛流行,造成了严重的经济损失并威胁公共卫生安全。中国是布病严重流行的国家之一,在高流行地区实施疫苗免疫接种是预防布病传播的有效策略之一。中国流行菌株主要为羊种布鲁氏菌,患病羊是造成布鲁氏菌传播的主要传染源。目前中国可用于预防羊布病的疫苗有羊种布鲁氏菌Rev.1株、羊种布鲁氏菌M5/M5-90株、猪种布鲁氏菌S2株等常规弱毒疫苗,以及新批准的羊种布鲁氏菌M5-90Δ26株、BA0711株等基因缺失活疫苗。虽然可用于预防羊布病的疫苗种类众多,但现有疫苗仍存在两点不足,一是安全性不够,注射免疫怀孕动物会引起流产;二是疫苗株与野毒株同为光滑型,免疫后干扰临床诊断。因此,研制安全性高且不干扰临床诊断的布病疫苗仍十分迫切。笔者对羊用布病疫苗的应用及新型疫苗的研究现状作一综述。

关键词：人兽共患病羊布鲁氏菌病疫苗

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稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的Vero细胞系的建立及鉴定

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中国动物传染病学报 2024年第1期32卷 56-61页

作者：钱炳旭薄宗义白雪雁张成成郭梦娇李梦娇廖凯薛峰吴艳涛张小荣扬州大学兽医学院江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225000 南京农业大学动物健康与食品安全国际合作实验室南京210095 扬州大学农业科技发展研究院教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室扬州225000

为获得稳定表达猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)核衣壳(N)蛋白的非洲绿猴肾(Vero)细胞系,本研究将PDCoV-N基因克隆入慢病毒载体中,获得重组质粒pLVX-PDCoV-N,利用慢病毒包装系统转染293T细胞,包装成表达N蛋白的慢病毒颗粒,慢病毒感染Vero细胞,... 详细信息

为获得稳定表达猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)核衣壳(N)蛋白的非洲绿猴肾(Vero)细胞系,本研究将PDCoV-N基因克隆入慢病毒载体中,获得重组质粒pLVX-PDCoV-N,利用慢病毒包装系统转染293T细胞,包装成表达N蛋白的慢病毒颗粒,慢病毒感染Vero细胞,嘌呤霉素加压筛选目的细胞。RT-PCR扩增N基因和测序表明细胞系基因组中存在N蛋白编码序列,Western blot和IFA试验表明N蛋白可在细胞系中稳定表达。应用制备的细胞系对临床PDCoV阳性血清样品进行检测,与ELISA检测结果符合率达到100%。本研究成功建立了稳定表达PDCoV N蛋白的Vero细胞系,为PDCoV N蛋白生物学特性研究和PDCoV的临床检测、流行病学调查奠定了基础。

关键词：猪德尔塔冠状病毒核衣壳(N)蛋白慢病毒稳转细胞系

表达鸡传染性贫血病毒VP1蛋白的新型重组血清4型禽腺病毒的构建

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中国家禽 2024年第4期46卷 47-53页

作者：徐贞琦蒋蕙如郭艺文谢泉殷楠李拓凡万志敏邵红霞秦爱建张俊叶建强扬州大学兽医学院禽类预防医学教育部重点实验室江苏省动物预防医学重点实验室江苏扬州225009 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 扬州大学农业科技发展研究院江苏扬州225009 教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室江苏扬州225009

为研制新型鸡传染性贫血(CIA)高效疫苗以解决国内商品鸡群中普遍存在的鸡传染性贫血病毒(CIAV)感染问题,试验利用CRISPR-Cas9技术和Cre-LoxP系统,以血清4型禽腺病毒(FAdV-4)为载体,构建表达CIAV VP1蛋白的重组FAdV-4。通过间接免疫荧光... 详细信息

为研制新型鸡传染性贫血(CIA)高效疫苗以解决国内商品鸡群中普遍存在的鸡传染性贫血病毒(CIAV)感染问题,试验利用CRISPR-Cas9技术和Cre-LoxP系统,以血清4型禽腺病毒(FAdV-4)为载体,构建表达CIAV VP1蛋白的重组FAdV-4。通过间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹试验对重组病毒进行验证,通过体外病毒生长曲线来研究其复制效率。结果显示:该重组病毒构建成功,能有效表达CIAV VP1蛋白,命名为rFAdV-4-CIAV-VP1,且发现rFAdV-4-CIAV-VP1在LMH细胞中的复制效率远低于野生型FAdV-4。研究表明构建的重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1为CIAV和FAdV-4的联防联控提供了二联候选疫苗株。

关键词：鸡传染性贫血病毒 VP1蛋白 CRISPR-Cas9 重组血清4型禽腺病毒表达

猪细小病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立与应用

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中国兽医科学 2024年

作者：帅文娜郭子强李佳乐罗梦李丽薇周艳君姜一峰童武童光志李兆龙高飞中国农业科学院上海兽医研究所广西大学动物科学技术学院扬州大学江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心福建省农业科学院畜牧兽医研究所上海市兽医生物技术重点实验室

本研究通过对猪细小病毒（PPV）1型非结构蛋白NS1基因保守序列进行设计，建立了PPV的TaqMan实时荧光定量PCR方法，实现了对PPV1的快速检测。结果显示，该检测方法的Ct值与标准品质粒在1.0×1010copies/μL～1.0×104copies/μL具有良好... 详细信息

本研究通过对猪细小病毒（PPV）1型非结构蛋白NS1基因保守序列进行设计，建立了PPV的TaqMan实时荧光定量PCR方法，实现了对PPV1的快速检测。结果显示，该检测方法的Ct值与标准品质粒在1.0×1010copies/μL～1.0×104copies/μL具有良好的线性关系，曲线回归方程为y=-3.618 6x+42.01，R2=0.99，扩增效率为189%；重复性好，组内与组间变异系数均低于1.089 8%；敏感性好，最低检测限度为1.0×101copies/μL；特异性强，不与猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、非洲猪瘟病毒之间发生交叉反应，并用该方法对临床样品与病毒拷贝数进行了检测。表明本研究建立的方法重复性好、敏感性高、特异性强，适用于对PPV进行临床检测与诊断。

关键词：猪细小病毒 NS1蛋白 TaqMan实时荧光定量PCR

抗菌肽LL-37胞内诱导表达机制的研究进展

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微生物学报 2024年第10期64卷 3647-3655页

作者：张孟捷李晓飞李云露焦新安黄金林扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室江苏扬州225009 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 农业农村部农产品质量安全生物性危害因子(动物源)控制重点实验室江苏扬州225009 教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室江苏扬州225009

先天免疫是免疫防御的第一道防线,抗菌肽LL-37作为人体先天免疫的一部分,在维持人体稳态中发挥重要作用,具备直接杀菌和免疫调节两大功能。目前,对LL-37的研究主要侧重于其功能本身,而对其在体内的诱导表达知之甚少。然而,这对深入探究... 详细信息

先天免疫是免疫防御的第一道防线,抗菌肽LL-37作为人体先天免疫的一部分,在维持人体稳态中发挥重要作用,具备直接杀菌和免疫调节两大功能。目前,对LL-37的研究主要侧重于其功能本身,而对其在体内的诱导表达知之甚少。然而,这对深入探究人体免疫防御机制至关重要。因此,本文简要综述了LL-37的合成过程与功能、诱导分泌的因素以及诱导表达的调控通路等方面的研究进展,旨在为进一步揭示LL-37在人体内的调控通路及免疫防御功能提供新思路。

关键词：抗菌肽LL-37 体内诱导调控通路

稳定表达猪 BRD4-BD1/2蛋白的猪肺泡巨噬细胞传代细胞系的构建及其用于 ASFV 增殖的效果观察

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畜牧兽医学报 2024年第10期 4646-4659页

作者：吴梦丽孙华林杨吉飞赵亚茹关贵全殷宏牛庆丽中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室国家非洲猪瘟区域实验室(兰州)甘肃省病原生物学基础学科研究中心扬州大学江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心

前期研究发现宿主表观遗传调控蛋白——含溴结构域蛋白质4（bromodomain-containing protein 4, BRD4）有助于非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）的复制，为了深入研究BRD4对ASFV复制的影响，通过筛选出显著促进ASFV复制... 详细信息

前期研究发现宿主表观遗传调控蛋白——含溴结构域蛋白质4（bromodomain-containing protein 4, BRD4）有助于非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）的复制，为了深入研究BRD4对ASFV复制的影响，通过筛选出显著促进ASFV复制的BRD4-BD1/2结构域，利用慢病毒表达系统成功构建稳定表达BRD4-BD1/2结构域的3D4/21细胞系，分析ASFV在3D4/21-BRD4-BD1/2细胞系与WT细胞系之间的复制差异。首先，以家猪基因BRD4-BD1/2为靶标，构建了含有3x Flag标签的重组质粒pLVX-IRES-puro-3x Flag-BRD4-BD1/2,并将其与质粒pMD2.G和pSPAX2共同转染至HEK-293T细胞进行慢病毒包装，获得具有感染能力的慢病毒。使用慢病毒感染3D4/21细胞后通过嘌呤霉素药物筛选，成功获得了稳定表达BRD4-BD1/2结构域的3D4/21细胞系。利用RT-qPCR和Western blot技术分别检测了ASFV感染3D4/21-BRD4-BD1/2细胞后CP204L和B602L基因的转录水平以及相应蛋白表达水平，并通过HAD50测定评价ASFV的复制能力。研究结果表明：成功构建了稳定表达BRD4-BD1/2结构域的3D4/21细胞系。与3D4/21-WT细胞系相比，BRD4-BD1/2稳定表达细胞系能够显著促进ASFV复制。本研究提供了深入研究BRD4蛋白在ASFV复制中功能的生物材料，并为ASFV疫苗候选株的开发提供了理论基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 BRD4 BD1/2 3D4/21细胞稳定表达细胞系

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安徽地区新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及其σC基因序列分析

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中国预防兽医学报 2024年第8期46卷 805-811页

作者：胡晓苗李薇李婷许夏澎薄宗义郭梦娇张小荣吴艳涛戴银张成成安徽省农业科学院畜牧兽医研究所/安徽省畜禽疫病研究中心/畜禽产品安全工程安徽省重点实验室安徽合肥230031 扬州市职业大学江苏扬州225009 扬州大学兽医学院/江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 河北省定州市农业农村局河北定州073000

为掌握新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)的最新流行特征,本研究收集安徽某地区鸭场出现肝组织肿胀、出血等临床症状的25份雏鸭肝脏及脾脏样品,利用RT-PCR方法检测NDRV。将RT-PCR检测为阳性的病料样品接种SPF鸡胚分离病毒,收获第3代尿囊液进行PCR... 详细信息

为掌握新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)的最新流行特征,本研究收集安徽某地区鸭场出现肝组织肿胀、出血等临床症状的25份雏鸭肝脏及脾脏样品,利用RT-PCR方法检测NDRV。将RT-PCR检测为阳性的病料样品接种SPF鸡胚分离病毒,收获第3代尿囊液进行PCR检测及病毒纯净性鉴定;同时对NDRV分离株的全长σC基因进行克隆并测序,将测序所得的分离株σC基因序列与GenBank中登录的21株禽源呼肠孤病毒参考株的相应基因序列及推导氨基酸序列进行相似性比对分析,利用Mega 7.0软件构建分离株基于σC基因的系统进化树,并进行σC基因编码氨基酸序列的突变分析。将分离株接种Vero细胞观察其体外培养特性,感染雏鸭进行致病性试验。结果显示,25份病料样品中检出3份NDRV阳性样品,将阳性病料样品接种鸡胚3 d内,鸡胚全部死亡,并伴有水肿、严重充血等现象;病毒纯净性试验结果显示,病料样品仅NDRV呈阳性,其他病原如鸭甲型肝炎病毒(DHV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、H9亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)及禽腺病毒(FAdV)均为阴性。将3株分离株经测序分析,结果显示,其目的基因序列完全一致,为同一株病毒,并将其命名为NDRV AH株。对NDRV AH株σC基因进行序列相似性分析发现,NDRV AH株与其他NDRV参考株σC核苷酸序列的相似性为89.5%~99.0%,氨基酸序列的相似性为85.3%~98.9%。σC基因的遗传演化结果显示,NDRV AH株属于基因2型。σC氨基酸比对分析结果显示,与灭活疫苗TH11株(KC493571.1)相比,NDRV AH株aa67、aa93、aa100、aa132、aa151、aa158、aa212、aa253和aa298均发生了突变。将该分离株接种Vero细胞,可观察到细胞出现形态圆缩、细胞核聚集等细胞病变。致病性试验结果显示,感染雏鸭死亡率为40%,剖检发现雏鸭肾脏、肝脏出血,脾脏肿大,有轻微坏死灶或大面积坏死灶,有些脾脏质地较硬。可见大面积坏死灶。本研究揭示了NDRV在我国安徽地区的分子流行病学特征,为变异株疫苗研发奠定了基础,对NDRV感染的防治具有重要意义。

关键词：新型鸭呼肠孤病毒分离鉴定 σC基因进化分析致病性试验