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禽腺病毒血清4型纤突蛋白1(Fiber 1)多克隆抗体的制备

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畜牧与兽医 2020年第10期52卷 91-96页

作者：曹洁刘萌陈雨晴闫丽萍教育部动物健康与食品安全国际联合试验室/江苏省动物免疫工程试验室/江苏省陆生野生动物疫源疫病检测中心/南京农业大学免疫研究所/南京农业大学动物医学院江苏南京210095

为了制备禽腺病毒血清4型(FAdV-4)纤突蛋白1(Fiber 1)的多克隆抗体并对其特异性进行鉴定,将FAdV-4感染的病死鸡组织中扩增得到的Fiber 1基因构建到原核表达质粒pCold I,获得pCold I-Fiber 1表达质粒;然后将其转入大肠杆菌Rosetta(DE3)... 详细信息

为了制备禽腺病毒血清4型(FAdV-4)纤突蛋白1(Fiber 1)的多克隆抗体并对其特异性进行鉴定,将FAdV-4感染的病死鸡组织中扩增得到的Fiber 1基因构建到原核表达质粒pCold I,获得pCold I-Fiber 1表达质粒;然后将其转入大肠杆菌Rosetta(DE3)表达菌株中,加入1 mmol/L IPTG分别于16和37℃条件下诱导表达,SDS-PAGE检测结果显示重组蛋白Fiber 1以包涵体的形式成功表达,分子质量约53 kDa。表达蛋白纯化后免疫新西兰白兔,制备得到兔源Fiber 1蛋白的多克隆抗体。Western blot检验结果表明制备的Fiber 1阳性血清1∶1000倍稀释时具有良好的反应性,间接免疫荧光试验测得多抗血清在1∶3000倍稀释时,仍具有较好的活性且特异性良好。本研究为后续FAdV-4检测方法的开发及其相关致病机制的研究奠定了物质基础。

关键词：禽腺病毒4型 Fiber 1 多克隆抗体制备

牛奶淀粉样蛋白A的原核表达及单克隆抗体制备

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中国兽医学报 2021年第6期41卷 1111-1117页

作者：张正荣郭晨瑶陈诗胜赵亚男任建鸾汤芳薛峰戴建君南京农业大学动物健康与食品安全国际合作实验室江苏南京210095 中国药科大学药学院江苏南京211198

牛奶中血清淀粉样蛋白A(MAA)是表征奶牛乳腺炎的重要生物标志物,本研究构建了携带MAA基因的重组原核表达质粒pET28a-SUMO-MAA,采用大肠杆菌BL21(DE3)作为表达菌株,IPTG诱导表达,获得可溶性重组蛋白SUMO-MAA,用特异性SUMO酶切除重组蛋白... 详细信息

牛奶中血清淀粉样蛋白A(MAA)是表征奶牛乳腺炎的重要生物标志物,本研究构建了携带MAA基因的重组原核表达质粒pET28a-SUMO-MAA,采用大肠杆菌BL21(DE3)作为表达菌株,IPTG诱导表达,获得可溶性重组蛋白SUMO-MAA,用特异性SUMO酶切除重组蛋白上的SUMO标签后通过亲和层析纯化获得MAA。用纯化后的MAA免疫BALB/c小鼠,制备抗MAA的单克隆抗体并测定其效价和特异性。结果显示,本研究成功表达可溶性MAA蛋白,大小约为17 kDa,筛选出2株单抗均可与MAA蛋白反应,效价分别为1∶25600,1:51200。试验为后续开发牛奶中血清淀粉样蛋白的检测方法以及奶牛乳腺炎的诊断研究奠定重要基础。

关键词：奶牛乳腺炎牛奶中血清淀粉样蛋白A 原核表达单克隆抗体

鸭坦布苏病毒Capsid蛋白原核表达及多克隆抗体制备

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中国畜牧兽医 2023年第6期50卷 2395-2402页

作者：焦琳琳成玉婷吴庆国吴双吴植朱善元钱莺娟南京农业大学教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室南京210095 江苏农牧科技职业学院江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室江苏现代畜牧与新兽药工程技术中心泰州225300

【目的】本研究选择原核表达系统表达鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)核衣壳蛋白(Capsid protein),并制备其多克隆抗体,为DTMUV分子机制研究奠定基础。【方法】根据DTMUV-201909株基因序列,运用一步克隆技术将Capsid基因克隆至... 详细信息

【目的】本研究选择原核表达系统表达鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)核衣壳蛋白(Capsid protein),并制备其多克隆抗体,为DTMUV分子机制研究奠定基础。【方法】根据DTMUV-201909株基因序列,运用一步克隆技术将Capsid基因克隆至表达载体pET-30a(+)中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;使用ISA206佐剂与纯化后的重组蛋白混合乳化后免疫BALB/c小鼠,以获得多克隆抗体。间接ELISA方法测定获得的多克隆抗体效价,并对多克隆抗体进行Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)验证。【结果】试验成功构建pET-30a-Capsid重组质粒,SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白大小约为18 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应,具有良好反应原性。间接ELISA结果显示,制备的鼠抗Capisd蛋白多克隆抗体效价可达1∶256000;Western blotting和IFA结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别DTMUV感染细胞样品的Capsid蛋白。【结论】本研究成功制备小鼠抗Capsid蛋白多克隆抗体,为深入研究DTMUV Capsid蛋白的结构和功能提供了试验材料,为进一步阐明DTMUV的致病机制奠定基础。

关键词：鸭坦布苏病毒(DTMUV) 核衣壳蛋白原核表达多克隆抗体

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Tubacin对蓝舌病毒感染的抑制作用

中国兽医学报 2019年第10期39卷 1902-1906页

作者：陈新曹雨薄宗义陈欢孙雯张志芳印春生钱莺娟 JUNG Yong-sam 戴建君南京农业大学动物医学院教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室/农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095 中国兽医药品监察所北京100081 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193

蓝舌病(bluetongue,BT)是由蓝舌病毒(bluetongue virus,BTV)感染反刍动物,包括山羊、绵羊、水牛和骆驼等,引起的非接触性传染病,以口腔、鼻腔及胃黏膜发生溃疡性炎症病变为主要特征,库蠓是其主要传播媒介。BTV传播相当广泛,除了南极洲... 详细信息

蓝舌病(bluetongue,BT)是由蓝舌病毒(bluetongue virus,BTV)感染反刍动物,包括山羊、绵羊、水牛和骆驼等,引起的非接触性传染病,以口腔、鼻腔及胃黏膜发生溃疡性炎症病变为主要特征,库蠓是其主要传播媒介。BTV传播相当广泛,除了南极洲外的所有洲都有发现,近20年间在欧洲肆虐传播,造成了巨大的经济损失。目前发现的BTV包含26个血清型,型间没有交叉保护作用,使用传统疫苗只能提供部分保护。虽然目前已经有针对多种血清型BTV重组疫苗的研究,但保护效果并不理想。因此,研究防治BT的药物具有重要的应用价值。本研究发现,组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)的特异性抑制剂Tubacin能够抑制13型BTV感染,通过半定量PCR、Western blot、TCID50等试验验证,Tubacin处理后细胞病变减轻,病毒RNA和蛋白表达水平下降,上清中病毒粒子含量减少。结果证明Tubacin可在一定程度上抑制BTV感染,Tubacin是抗BTV的候选药,HDAC6可能是抗BTV感染的靶点之一。

关键词：蓝舌病 Tubacin 抗病毒

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1株禽4型腺病毒JS株的分离鉴定

畜牧与兽医 2020年第5期52卷 92-96页

作者：陈雨晴曹洁王玉峰宋素泉闫丽萍教育部动物健康与食品安全国际联合试验室/江苏省动物免疫工程试验室/江苏省陆生野生动物疫源疫病检测中心/南京农业大学免疫研究所/南京农业大学动物医学院江苏南京210095

自2015年以来,心包积液-肝炎综合征在我国部分地区暴发并造成大量肉鸡死亡,从而给养殖户带来巨大的经济损失。2017年从江苏省某发病鸡场的患鸡肝组织中分离获得了1株禽腺病毒4型(fowl adenovirus 4,FAdV-4),将其命名为JS株。Hexon基因... 详细信息

自2015年以来,心包积液-肝炎综合征在我国部分地区暴发并造成大量肉鸡死亡,从而给养殖户带来巨大的经济损失。2017年从江苏省某发病鸡场的患鸡肝组织中分离获得了1株禽腺病毒4型(fowl adenovirus 4,FAdV-4),将其命名为JS株。Hexon基因同源进化分析显示,该病毒株为我国近期流行株。为了验证该病毒株对鸡的致病性,将10^6.0TCID50的病毒用肌肉注射或口服的方式感染3周龄SPF鸡,连续观察14 d。结果发现:肌注组鸡在攻毒后24 h有精神沉郁的症状,在攻毒后第2~3天大批量死亡,死亡率达90%;而口服组鸡一直没有观察到明显的精神症状且死亡率为0。病死鸡剖检可见心包积液、肝脏肿大发黄、肾脏肿大出血、脾肿大等明显病变;荧光定量PCR检测结果显示,病毒在鸡体内多个组织器官均有分布。结果表明本研究分离获得了1株对鸡有较强致病性的FAdV-4毒株,为有效防控心包积液-肝炎综合征奠定基础。

关键词：禽腺病毒4型分离致病性心包积液包涵体肝炎

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非洲猪瘟病毒p30单克隆抗体的制备和鉴定

中国兽医科学 2020年第8期50卷 976-981页

作者：杨莎莎苗雨润薄宗义王振忠谭凯鲍晨沂吴晓东陈鸿军郑龙三钱莺娟戴建君南京农业大学动物医学院教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室农业部细菌学重点实验室江苏南京210095 中国动物卫生与流行病学中心国家非洲猪瘟参考实验室山东青岛266000 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

p30蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)的膜蛋白,在病毒感染早期分泌表达,含量丰富且抗原性较高,是重要的病毒早期诊断靶标。本研究以ASFV基因Ⅱ型格鲁吉亚2007株p30基因的质粒为模板扩增p30基因片段,连接至原核表达载体pET-28a,转化到大肠杆菌Ro... 详细信息

p30蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)的膜蛋白,在病毒感染早期分泌表达,含量丰富且抗原性较高,是重要的病毒早期诊断靶标。本研究以ASFV基因Ⅱ型格鲁吉亚2007株p30基因的质粒为模板扩增p30基因片段,连接至原核表达载体pET-28a,转化到大肠杆菌Rosetta后,经IPTG诱导表达和镍柱纯化;将纯化后的重组p30蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合和间接ELISA方法,筛选出了2株能够稳定分泌抗p30蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,并通过制备腹水的方法获得单克隆抗体;最后经Western-blot和IFA试验鉴定,其均能与ASFV感染细胞发生特异性反应。本研究为ASFV感染的诊断和致病机制研究提供了重要材料。

关键词：非洲猪瘟病毒 p30蛋白单克隆抗体

小反刍兽疫病毒液相芯片检测方法的建立及初步应用

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畜牧与兽医 2018年第11期50卷 69-73页

作者：阮智杨胡波宋艳华魏后军范志宇吴晓东王芳钱莺娟南京农业大学动物医学院教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室江苏南京210095 江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京210014 中国动物卫生与流行病学中心国家外来动物疫病诊断中心山东青岛266032

为建立小反刍兽疫病毒（PPRV）液相芯片检测方法,根据Gen Bank上公布的PPRV的N蛋白基因序列高度保守区设计引物与探针;对探针进行C12臂修饰后与荧光编码微球偶联,将偶联后的探针与PPRV的PCR产物进行杂交,在Bio-Plex系统上读取荧光信号,... 详细信息

为建立小反刍兽疫病毒（PPRV）液相芯片检测方法,根据Gen Bank上公布的PPRV的N蛋白基因序列高度保守区设计引物与探针;对探针进行C12臂修饰后与荧光编码微球偶联,将偶联后的探针与PPRV的PCR产物进行杂交,在Bio-Plex系统上读取荧光信号,建立了小反刍兽疫病毒液相芯片检测方法,并对该方法的特异性和敏感性进行了研究,最终用建立的方法对临床样本进行检测。结果显示,该方法只与PPRV基因的PCR产物反应,而不与其他病毒基因反应,可检出的最低基因拷贝数为5. 78×104copies/m L,表明该方法具有良好的特异性与敏感性。利用该方法对25份临床样本进行检测,共检出阳性样本15份,与传统PCR方法检测结果一致。本研究建立了小反刍兽疫病毒的快速液相芯片检测方法,为进一步建立多种外来动物疫病的液相芯片检测方法奠定了基础。

关键词：小反刍兽疫外来病原液相芯片检测方法

鸭坦布苏病毒Capsid蛋白的亚细胞定位及其功能分析

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中国动物传染病学报 2023年

作者：成玉婷焦琳琳吴庆国朱善元江苏农牧科技职业学院江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室江苏现代畜牧与新兽药工程技术中心猪传染病防控团队南京农业大学教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室

为探讨鸭坦布苏病毒(DTMUV)201909株在不同细胞中的适应性，本研究以DTMUV-201909株感染四种不同细胞系(DEF、DF-1、BHK21和Vero)，并用TCID50、RT-PCR和IFA方法分析DTMUV增殖情况。结果显示，DTMUV在DEF和DF-1细胞中复制能力较BHK21和V... 详细信息

为探讨鸭坦布苏病毒(DTMUV)201909株在不同细胞中的适应性，本研究以DTMUV-201909株感染四种不同细胞系(DEF、DF-1、BHK21和Vero)，并用TCID50、RT-PCR和IFA方法分析DTMUV增殖情况。结果显示，DTMUV在DEF和DF-1细胞中复制能力较BHK21和Vero细胞强。此外，利用一步克隆技术获得DTMUV Capsid重组真核表达载体并瞬时转染至DEF细胞。PCR克隆获得目的基因DTMUV Capsid片段大小为360 bp，Western blot显示重组质粒在细胞内表达的融合蛋白分子质量大约为16 ku，IFA观察到DTMUV Capsid在细胞质和细胞核中均有分布。将DTMUV Capsid质粒转染至DEF细胞，发现IFN-α、IFN-β和IFN-γ表达分别升高3.78、2.31和1.82倍，MAVS、TLR3和RIG-I表达分别降低49.5%、62.3%和73.1%。本研究为进一步阐明DTMUV的分子致病机理奠定基础，也为深入研究DTMUV Capsid蛋白的结构与功能提供了材料。

关键词：鸭坦布苏病毒衣壳蛋白细胞适应性亚细胞定位

猪德尔塔冠状病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用

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中国兽医学报 2021年第7期41卷 1234-1241页

作者：钱炳旭白雪雁张成成郭梦娇李梦娇廖凯薛峰吴艳涛张小荣扬州大学兽医学院江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225000 南京农业大学动物健康与食品安全国际合作实验室江苏南京210095

通过DNAStar Protean软件对猪德尔塔冠状病毒(porcine Deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白氨基酸序列进行分析,选取抗原性较强的区段(265~342 aa),根据大肠杆菌密码子使用的偏嗜性进行优化设计并人工合成了对应的基因片段N-Opti。利用融合表... 详细信息

通过DNAStar Protean软件对猪德尔塔冠状病毒(porcine Deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白氨基酸序列进行分析,选取抗原性较强的区段(265~342 aa),根据大肠杆菌密码子使用的偏嗜性进行优化设计并人工合成了对应的基因片段N-Opti。利用融合表达载体pET-32a进行原核表达,获得的融合蛋白携带His标签,命名为PDCoV-N-His,且呈可溶性表达。Western blot鉴定结果显示,该重组N蛋白约为31 kDa,与预期相符。利用Ni-NTA亲和层析介质纯化重组N蛋白作为包被抗原进行ELISA检测,并对反应条件进行摸索、优化,建立了检测PDCoV特异性抗体的间接ELISA方法。经测定,该方法具有良好的特异性且重复性良好,与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRoV)特异性阳性血清无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%。应用该方法对20份已知阳性血清和20份阴性血清分别进行检测,结果显示阳性符合率为100%(20/20),阴性符合率为100%(20/20)。结果表明,该方法的特异性良好,可以进一步用于PDCoV感染的快速诊断和流行病学调查。

关键词：猪德尔塔冠状病毒核衣壳(N)蛋白原核表达间接ELISA