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细胞因子组合对体外扩增造血干/祖细胞分裂模式选择的影响

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高校化学工程学报 2022年第5期36卷 702-707页

作者：朱雪君蔡海波谭文松华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237

造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cells,HSPCs)体外扩增过程中,HSPCs的命运取决于HSPCs的对称或不对称分裂,而HSPCs分裂模式的选择与细胞因子有关。为此,以脐带血CD34^(+)细胞为研究对象,采用SCF+TPO+FL(STF)、SCF+IL-3+IL-6(S36)和SCF+TPO+FL+IL-6(STF6)三种细胞因子组合进行体外扩增,分析了CD34^(+)细胞扩增倍数、扩增后CD34^(+)细胞的集落形成能力等HSPCs扩增特性;并以CD34^(+)CD48-细胞的含量、Numb在子细胞中的分布以及numb和musashi-2的基因表达水平为评价指标,多角度评价细胞因子组合对HSPCs的分裂模式的影响。结果发现,与S36相比,STF和STF6均能够通过显著增加HSPCs自我更新的对称分裂比例提高HSPCs的体外扩增效果和集落形成能力。该研究结果可为HSPCs体外扩增过程的优化提供技术支持。

关键词：造血干/祖细胞细胞因子体外扩增分裂模式

三维预血管化微组织中成纤维细胞促进内皮细胞出芽及迁移的研究

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中国修复重建外科杂志 2022年第7期36卷 881-888页

作者：唐珺谈金女叶朝阳周燕谭文松华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237

目的构建三维预血管化微组织,探索三维共培养体系中人成纤维细胞(human fibroblasts,HFs)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)出芽和迁移的促进作用。方法取HUVECs和HFs培养传代至3~5代进行实验。在... 详细信息

目的构建三维预血管化微组织,探索三维共培养体系中人成纤维细胞(human fibroblasts,HFs)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)出芽和迁移的促进作用。方法取HUVECs和HFs培养传代至3~5代进行实验。在二维共培养体系中,将HFs行PKH26染色且固定细胞密度后,与HUVECs以不同比例(1∶4、1∶1、4∶1)以及不同接种方式(两种细胞间隔48 h顺序接种、直接混合接种)共培养,荧光显微镜下观察血管网络形成情况。构建三维共培养体系,通过慢病毒转染分别用绿色和红色荧光蛋白标记HUVECs和HFs,将标记细胞接种于多孔微载体上,采用转瓶动态培养,分别制备HF微组织、HUVEC微组织、HF-EC微组织和HF&EC微组织;低渗结晶紫染色法观测微组织中细胞生长情况。将各微组织包埋于纤维蛋白凝胶中,激光共聚焦显微镜下观察HF微组织和HUVEC微组织中细胞生长贴附情况,4种微组织出芽情况以及HF-EC微组织、HF&EC微组织芽体细胞组成、出芽数量及芽体长度。制备HFs条件培养基,观察其对HUVEC微组织出芽的影响,以正常培养基培养作为对照。结果二维共培养时HFs预培养有助于血管网状结构形成与稳定,且当两种细胞比例为1∶1时效果最佳。三维共培养时各微组织上细胞生长良好,HUVEC微组织无出芽,HF微组织、HF-EC微组织、HF&EC微组织均能出芽,具备良好血管化能力。HF-EC微组织芽体长度及出芽数目均优于HF&EC微组织(P<0.05)。共培养微组织中HF微组织先于HUVEC微组织出芽,两者出芽轨迹一致,芽体由HFs和HUVECs组成。在HFs条件培养基中,HUVEC微组织也能出芽。结论在转瓶中按1∶1比例顺序接种HFs和HUVECs可制备HF-HUVEC预血管化微组织,且在三维共培养中HFs能够引导和促进HUVECs出芽及迁移。

关键词：组织工程微组织预血管化转瓶动态培养三维共培养

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固定床生物反应器中慢病毒生产工艺的优化

过程工程学报 2024年第6期 734-745页

作者：陶思然程俊曹磊周燕谭文松华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室

慢病毒载体能将外源基因稳定整合至多种细胞的基因组，在基因治疗领域中具有广泛应用。固定床反应器可规模化培养贴壁细胞并通过质粒瞬时转染的方式生产慢病毒，但其慢病毒产量受到各种操作参数的影响。本研究对慢病毒生产过程中质粒转... 详细信息

慢病毒载体能将外源基因稳定整合至多种细胞的基因组，在基因治疗领域中具有广泛应用。固定床反应器可规模化培养贴壁细胞并通过质粒瞬时转染的方式生产慢病毒，但其慢病毒产量受到各种操作参数的影响。本研究对慢病毒生产过程中质粒转染条件和细胞培养参数进行优化，并在国产固定床反应器中验证了优化后的工艺。结果表明，在质粒转染过程中，当PEI与DNA混合时质量比在2:1及以上、转染时的DNA浓度等于或高于2μg/mL、转染6 h及以上时可显著提高质粒转染效率；而混合时的DNA浓度和混合时间对转染效率的影响较小，其主要影响外源基因在细胞中的表达。在HEK293T细胞培养中，在5.0×104cells/cm2的高接种密度下细胞在固定床载体表面均匀分布并较快进入指数生长期；而转染时过高或过低的细胞密度均不利于慢病毒生产，当细胞密度为1.0×106cells/cm2时，可获得较高的慢病毒滴度。采用上述优化的工艺条件，在表面积为2.0 m2的国产固定床反应器中收获的慢病毒产量达2.4×1010TU。本研究结果为建立基于固定床反应器的慢病毒载体高效生产工艺提供数据支撑。

关键词：固定床生物反应器慢病毒转染条件细胞培养参数

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NADH扰动对酿酒酵母葡萄糖效应的影响

华东理工大学学报（自然科学版） 2023年第2期49卷 227-235页

作者：徐亚英李志敏华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237

利用不同拷贝数的载体在酿酒酵母中表达还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化酶(NOX)和可替代氧化酶(AOX1),并通过线粒体定位信号减少AOX1对胞质NADH的影响,从而考察NOX和AOX1在分批发酵中对酿酒酵母葡萄糖效应的作用及其对葡萄糖生产... 详细信息

利用不同拷贝数的载体在酿酒酵母中表达还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化酶(NOX)和可替代氧化酶(AOX1),并通过线粒体定位信号减少AOX1对胞质NADH的影响,从而考察NOX和AOX1在分批发酵中对酿酒酵母葡萄糖效应的作用及其对葡萄糖生产衣康酸的影响。结果表明,高拷贝载体表达nox、aox1基因的菌株均有明显的代谢变化,高拷贝表达nox菌株能够氧化胞质NADH,培养基中甘油分泌减少43.94%,衣康酸生产不受影响。而高拷贝表达aox1的菌株存在胞质残留AOX1,会氧化胞质NADH而减少甘油积累。利用线粒体定位信号AAC2和BCS1p将AOX1进一步定位至酿酒酵母线粒体,120 h时衣康酸产量增加至116.98 mg/L。但是AOX1、AAC2-AOX1和BCS1p-AOX1表达菌株都没有明显减少分批发酵中乙醇的积累。在高糖培养基中进行分批发酵,NOX能够减少葡萄糖效应甘油的积累,而AOX1、AAC2-AOX1和BCS1p-AOX1不能减少葡萄糖效应副产物乙醇的积累。

关键词：酿酒酵母甘油乙醇 NOX AOX1 线粒体定位信号

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一种新型的曲霉属洁净可逆性诱导表达系统

华东理工大学学报（自然科学版） 2023年第4期49卷 536-545页

作者：李宝意周胜敏华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200037

构建了一种以构巢曲霉为表达宿主、过氧化氢(H_(2)O_(2))抗性酶Peroxiredoxin(PRX)的编码基因AnPrxA的启动子P_(PRX)为表达用启动子、H_(2)O_(2)为表达诱导剂的新型、高效的曲霉表达体系。在双氧水诱导和非诱导条件下,评估P_(PRX)的上... 详细信息

构建了一种以构巢曲霉为表达宿主、过氧化氢(H_(2)O_(2))抗性酶Peroxiredoxin(PRX)的编码基因AnPrxA的启动子P_(PRX)为表达用启动子、H_(2)O_(2)为表达诱导剂的新型、高效的曲霉表达体系。在双氧水诱导和非诱导条件下,评估P_(PRX)的上游调控区介导绿色荧光蛋白(GFP)表达的特征。利用基因工程构建了4个含不同长度启动子表达盒的克隆载体并转化至尿嘧啶生物合成缺陷型构巢曲霉宿主;分析了AnPrxA基因上游2033 bp序列中潜在的转录调控元件;利用荧光定量PCR测定表达盒拷贝数;考察与P_(PRX)融合的GFP表达情况;并且探讨了双氧水诱导浓度和作用时间与蛋白表达量的关系。结果表明,AnPrxA基因的5'-非编码区2033 bp序列中至少包含9种基因表达调控元件,大都呈多拷贝排列;虽然该2033 bp的非编码区域对gfp的转录均有贡献,但是非编码区缩短至500 bp也可以维持GFP蛋白的正常表达;在双氧水浓度为0.5~2.0 mmol/L的诱导条件下,P_(PRX)介导的GFP表达量提高3倍,与先前鉴定的2种曲霉属双氧水诱导型启动子的诱导率相似,但目标蛋白的绝对表达强度更高。研究还发现P_(PRX)介导gfp转录水平在H_(2)O_(2)诱导条件下提高30倍,显著高于其蛋白表达的诱导率(3倍),因此今后进一步提升蛋白翻译效率将有望大幅提高目标蛋白的合成水平。

关键词： PRX 蛋白表达构巢曲霉过氧化氢表达调控

偏最小二乘法预测头孢菌素C工业发酵过程中发酵液流变特性

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华东理工大学学报（自然科学版） 2023年第1期49卷 62-68页

作者：杨倚铭陈震田锡炜储炬华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237

在头孢菌素C工业发酵过程中,发酵液表现出典型的非牛顿流体性质,并可用幂律模型充分描述。传统经验型模型并不能很好地预测头孢菌素C工业发酵过程的流变特性,原因在于模型过于简化,忽略了潜在因素如底物浓度、进料方式、培养基组成等对... 详细信息

在头孢菌素C工业发酵过程中,发酵液表现出典型的非牛顿流体性质,并可用幂律模型充分描述。传统经验型模型并不能很好地预测头孢菌素C工业发酵过程的流变特性,原因在于模型过于简化,忽略了潜在因素如底物浓度、进料方式、培养基组成等对流变特性的影响,但更多变量的引入会显著增加模型复杂度,且这些参数的动态变化存在相关性,为了解决这个问题,采用了偏最小二乘法进行建模。标准偏回归系数可以量化不同因素对流变参数的作用,其中节孢子比率和菌丝平均分支长度对流变学特性的影响最大。使用偏最小二乘回归(PLSR)模型,可以很好地预测头孢菌素C发酵液的流动行为指数和稠度指数,其相关系数分别为0.94和0.91,具有较好的实用性。

关键词：顶头孢霉偏最小二乘回归流变特性菌体形态头孢菌素C

赖氨酰内切酶在大肠杆菌中的重组表达、复性及纯化

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华东理工大学学报（自然科学版） 2023年第5期49卷 702-711页

作者：朱奕徐名强任燕娜蔡孟浩华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237

首先在产酶溶杆菌来源的赖氨酰内切酶(Lys-C)成熟肽序列的N端和C端分别融合人工前肽(MGSK)和6×His标签,将密码子优化后的序列插入表达载体pET-28a;其次以IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导型启动子PT7控制Lys-C的高效表达,并针对重组菌株JM... 详细信息

首先在产酶溶杆菌来源的赖氨酰内切酶(Lys-C)成熟肽序列的N端和C端分别融合人工前肽(MGSK)和6×His标签,将密码子优化后的序列插入表达载体pET-28a;其次以IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导型启动子PT7控制Lys-C的高效表达,并针对重组菌株JM109DE3_PT7-LysC开展生物反应器高密度发酵生产Lys-C;再次收集和溶解包涵体得到Lys-C变性液,通过Sephadex G25层析脱除DTT(二硫苏糖醇),并在Lys-C复性液中添加前导肽(pre-N-pro)辅助成熟肽蛋白折叠;进一步通过切向流过滤、Ni NTA-Sepharose亲和层析和Sephacryl S-100层析等一系列纯化步骤,获得高纯度的重组Lys-C;最后进行酶切三肽底物和门冬胰岛素前体检测,分析重组Lys-C的活性水平。结果表明:重组Lys-C的发酵产量为2.4 g/L,经复性和纯化后的终产量可达48 mg/L;添加80 mg/L pre-N-pro促进了重组Lys-C的复性,复性后酶活相比于未添加pre-N-pro时提升了4.8倍,最高可达到13.8 U/L;经过多步纯化后,重组Lys-C的比酶活为10.2 U/mg,且对于门冬胰岛素前体的酶切转化率可达93.5%。

关键词：赖氨酰内切酶重组表达复性纯化活性

三七悬浮细胞生物合成绿原酸类物质及其生物活性

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华东理工大学学报（自然科学版） 2023年第4期49卷 515-528页

作者：周倍刘楠刘泽波庄英萍王泽建郭美锦华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237

利用三七(Panax notoginseng)悬浮细胞生物合成绿原酸类物质(CGAs),并对其生物活性进行了研究。对三七细胞中CGAs进行定性分析,优化了细胞培养条件以及6种诱导模式,测定了三七细胞CGAs的抗氧化及α-葡萄糖苷酶活性抑制能力。结果表明三... 详细信息

利用三七(Panax notoginseng)悬浮细胞生物合成绿原酸类物质(CGAs),并对其生物活性进行了研究。对三七细胞中CGAs进行定性分析,优化了细胞培养条件以及6种诱导模式,测定了三七细胞CGAs的抗氧化及α-葡萄糖苷酶活性抑制能力。结果表明三七愈伤组织内含有4种CGAs;最优工艺条件为:B5+40 g/L蔗糖,pH 7.5,15%接种量;经30μmol/L茉莉酸甲酯诱导3 d后,CGAs产量(684.07 mg/L)比原工艺(475.18 mg/L)提高了0.44倍;三七细胞CGAs具有良好的抗氧化及α-葡萄糖苷酶活性抑制能力。

关键词：三七愈伤组织细胞悬浮培养绿原酸生物合成工艺优化生物活性

提升头孢菌素C发酵效率的复合碳源补料工艺开发及代谢机制

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华东理工大学学报(自然科学版) 2023年

作者：杨倚铭陈震田锡炜储炬华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室

开发了一种以葡萄糖和豆油为底物碳源的复合补料策略，能够显著提升头孢菌素C(CPC)的合成效率，产量提升了14.8%，并率先观测到碳源变化在宏观呼吸代谢、中间代谢物、细胞内通量分配和还原力NADPH利用上产生全局影响，其中二氧化碳释放... 详细信息

开发了一种以葡萄糖和豆油为底物碳源的复合补料策略，能够显著提升头孢菌素C(CPC)的合成效率，产量提升了14.8%，并率先观测到碳源变化在宏观呼吸代谢、中间代谢物、细胞内通量分配和还原力NADPH利用上产生全局影响，其中二氧化碳释放速率（CER）的巨大变化表明葡萄糖和豆油复合补料策略下细胞中心代谢网络的通量发生了明显改变，碳流向CPC的通量得到增强，同时促进了蛋氨酸和丝氨酸的胞外吸收。胞内有机酸α-酮戊二酸、丙酮酸、苹果酸的浓度明显提升，有利于谷氨酸、缬氨酸和半胱氨酸等核心氨基酸的合成，从而有利于CPC生产。主成分分析（PCA）的载荷检测表明大多数氨基酸和CPC合成呈正作用，谷氨酸的胞内含量与CPC合成的关联性最强，而α-氨基己二酸和赖氨酸浓度积累反而不利于CPC合成。细胞还原力方面，豆油和葡萄糖组合显著缓解了单独豆油利用与CPC合成之间对NADPH消耗的竞争性，使得CPC快速合成对NADPH的大量需求得到了满足。这些结果表明底物改变能够对细胞内部的代谢产生全方位的影响，体现了这一策略在优化CPC合成效率的巨大潜力。

关键词：头孢菌素C 碳源呼吸代谢代谢通量分析