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苦瓜McPDS基因克隆及CRISPR/Cas9基因编辑载体构建

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中国瓜菜 2024年第3期37卷 20-27页

作者：韩鑫郭金菊张惠尧吴廷全张长远广东省农业科学院设施农业研究所广州510640 华中农业大学园艺林学学院武汉430070

以苦瓜八氢番茄红素脱氢酶(phytoene dehydrogenase,PDS)基因为靶标,构建其特异gRNA的CRISPR/Cas9基因编辑载体,以期为建立苦瓜CRISPR/Cas9基因编辑技术体系奠定基础。以苦瓜自交系B07叶片cDNA为模板,同源克隆苦瓜McPDS基因CDS序列。结... 详细信息

以苦瓜八氢番茄红素脱氢酶(phytoene dehydrogenase,PDS)基因为靶标,构建其特异gRNA的CRISPR/Cas9基因编辑载体,以期为建立苦瓜CRISPR/Cas9基因编辑技术体系奠定基础。以苦瓜自交系B07叶片cDNA为模板,同源克隆苦瓜McPDS基因CDS序列。结果表明,McPDS基因CDS序列全长1731 bp,编码576个氨基酸,蛋白质相对分子质量为64.44 kD,理论等电点(PI)为7.09。跨膜结构分析结果表明,该蛋白为亲水性非跨膜蛋白。系统进化树分析结果表明,McPDS与黄瓜、甜瓜等葫芦科植物中的PDS蛋白同源性较高。此外,以McPDS为靶标基因,在5’端筛选2个高特异性靶点,经设计引物,成功构建1个双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体,为苦瓜基因编辑体系的建立奠定了技术基础。

关键词：苦瓜 McPDS 基因克隆载体构建基因编辑

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光周期对橘小实蝇表型、肠道菌群及免疫的影响

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植物保护学报 2023年第6期50卷 1585-1592页

作者：杨雨馨赵颖睿赵紫华中国农业大学植物保护学院植物生物安全系北京100193

为了解光周期对橘小实蝇Bactrocera dorsalis的生态影响,于室内测定全光(24 L∶0 D)、全暗(0 L∶24 D)和对照(14 L∶10 D)这3种光周期处理下橘小实蝇的表型、肠道菌群以及免疫变化。结果显示,全光和全暗处理后橘小实蝇幼虫的发育历期分... 详细信息

为了解光周期对橘小实蝇Bactrocera dorsalis的生态影响,于室内测定全光(24 L∶0 D)、全暗(0 L∶24 D)和对照(14 L∶10 D)这3种光周期处理下橘小实蝇的表型、肠道菌群以及免疫变化。结果显示,全光和全暗处理后橘小实蝇幼虫的发育历期分别为5.51 d和5.40 d,单头蛹重分别为14.47 mg和10.82 mg,均较对照显著降低;全光和全暗处理后橘小实蝇雌成虫的卵巢面积分别较对照显著减小;全光和全暗处理后橘小实蝇肠道微生物Shannon指数、Ace指数和Chao指数分别较对照显著降低,而Simpson指数分别较对照显著增加;3个光周期处理后橘小实蝇肠道微生物共有36个门,处理后橘小实蝇肠道微生物物种组成较对照减少;3个光周期处理后橘小实蝇肠道微生物样本组内集中,组间无重叠,全光样本、全暗样本均与对照样本距离较远;全光和全暗处理后橘小实蝇肠道微生物类群分别与对照组有明显差异;全光和全暗处理后橘小实蝇被线虫侵染的死亡率显著增加,分别为80%和90%。

关键词：橘小实蝇光周期肠道微生物表型线虫侵染免疫

稻瘟菌诱导的水稻WRKY基因OsWRKY52的分离和鉴定(英文)

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生物化学与生物物理进展 2005年第10期32卷 937-946页

作者：王海华谢科吴坤陆郭泽建浙江大学农业与生物技术学院中国农业大学植物病理系北京100094 中国农业大学植物病理系

WRKY蛋白参与植物对生物或非生物胁迫反应和一些发育、代谢过程,在植物中组成一个转录因子大家族.从水稻cDNA文库中分离到一个新的WRKY基因——OsWRKY52cDNA,包括一个1719bp的开放读码框,推测编码一个由572个氨基酸组成的蛋白质,与燕麦(... 详细信息

WRKY蛋白参与植物对生物或非生物胁迫反应和一些发育、代谢过程,在植物中组成一个转录因子大家族.从水稻cDNA文库中分离到一个新的WRKY基因——OsWRKY52cDNA,包括一个1719bp的开放读码框,推测编码一个由572个氨基酸组成的蛋白质,与燕麦(Avenasativa)AsWRKY1具有54%的氨基酸一致性.该基因被非亲和性稻瘟菌快速诱导.凝胶阻滞实验结果表明,原核表达的OsWRKY52能与水稻PR1a启动子上的W盒元件特异结合.采用酵母单杂交体系的方法证明了OsWRKY52具有转录激活活性,其丝氨酸岛、苏氨酸岛和C端的富酸性氨基酸区是负责转录激活的区域.这些结果提示OsWRKY52作为一个转录激活子,可能参与植物对稻瘟菌的应答反应.

关键词： DNA结合稻瘟菌(Magnaporthe grisea) 水稻(Oryza sativa) 转录激活转录因子 WRKY

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马铃薯线粒体靶向表达载体的构建与应用

生物技术通报 2024年第5期40卷 66-73页

作者：张震李清徐菁陈凯园张春芝祝光涛云南师范大学马铃薯科学研究院昆明650500 中国农业科学院农业基因组研究所深圳518124

【目的】植物线粒体基因变异是产生细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS)的主要原因,利用生物技术是创造CMS不育系的重要手段。通过比较启动子、线粒体转运信号肽(mitochondrial targeting signal peptides,MTS)的不同组合... 详细信息

【目的】植物线粒体基因变异是产生细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS)的主要原因,利用生物技术是创造CMS不育系的重要手段。通过比较启动子、线粒体转运信号肽(mitochondrial targeting signal peptides,MTS)的不同组合对下游eGFP的表达强弱,来探究最佳马铃薯线粒体靶向表达载体。【方法】选择3个启动子AtUBI10、StUBI10、2×35S和两个线粒体转运信号肽ATPγ与Rf1b进行试验,利用烟草叶片瞬时表达系统和PEG介导马铃薯原生质体转化体系进行靶向载体的表达验证。【结果】六个线粒体靶向表达载体中AtUBI10::ATPγ-eGFP在烟草瞬时表达效果最佳,可准确定位到线粒体,其次为StUBI10::ATPγ-eGFP和2×35S::ATPγ-eGFP;在马铃薯原生质体中载体AtUBI10::ATPγ-eGFP有最佳的表达效果,与烟草中表达结果一致,其次是StUBI10::Rf1b-eGFP和AtUBI10::Rf1b-eGFP,而2×35S启动子的两个载体在原生质体均表达较弱。【结论】启动子AtUBI10与线粒体转运信号肽ATPγ所构建的靶向线粒体载体为最佳组合,可用于马铃薯线粒体基因的相关研究中。

关键词：马铃薯线粒体转运信号肽靶向表达载体亚细胞定位细胞质雄性不育

一株ILTV田间弱毒株的分离鉴定与生物学特性评价

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一株ILTV田间弱毒株的分离鉴定与生物学特性评价

作者：徐鸣荷河南农业大学

学位级别：硕士

传染性喉气管炎（Infectious laryngotracheitis,ILT）是由传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus,ILTV）引起的一种鸡的急性、高度接触性呼吸道传染病,在全球范围内广泛流行。发病鸡以呼吸困难、咳嗽、咳出带血黏液... 详细信息

传染性喉气管炎（Infectious laryngotracheitis,ILT）是由传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus,ILTV）引起的一种鸡的急性、高度接触性呼吸道传染病,在全球范围内广泛流行。发病鸡以呼吸困难、咳嗽、咳出带血黏液、眼睑肿胀、产蛋量下降为特征。近年来ILT在我国流行严重,给养禽业带来巨大经济损失。ILT的防控目前主要采用弱毒活疫苗对易感鸡进行免疫,我国目前使用的商品化疫苗有鸡胚源活疫苗（CEO）、组织细胞源活疫苗（TCO）及基因工程活载体疫苗。CEO和TCO弱毒活疫苗由强毒株连续传代致弱获得,遗传背景通常不清晰,免疫后副反应大,且疫苗株在鸡群中的连续传代存在毒力返强的风险;利用鸡痘病毒作为载体表达ILTV强毒株的g B抗原基因的活载体疫苗与弱毒活疫苗相比安全性较好,但对ILT的免疫效果不够理想。无论是鸡自然感染还是疫苗免疫,ILTV均会在鸡的中枢神经系统特别是三叉神经节建立终身潜伏感染。当机体受到应激因素刺激时,潜伏的ILTV会被重新激活向外界散毒,从而感染其他易感鸡,这使得ILT的防控与净化难度增大。筛选安全性更好的ILTV疫苗株和开发新型安全高效的ILT疫苗是养禽业的迫切需求。本研究于2022年在河南省一未接种ILT疫苗的蛋鸡场常规送检样品中分离到一株ILTV,并命名为ILTV CH/HN/2022。测定了该分离株的全基因组序列并进行了遗传进化分析,研究了其在体外的复制特性、对易感鸡的致病性,以及其作为弱毒活疫苗的免疫原性和免疫效力。研究结果丰富了我国ILTV的流行病学信息,为我国ILT防控及疫苗株的选择提供了参考。本研究包括以下几方面内容:***分离株的鉴定与遗传进化分析本研究在河南某蛋鸡场采集的咽拭子样品中检测到ILTV阳性,并通过9日龄SPF鸡胚成功分离到一株ILTV,命名为ILTV CH/HN/2022。基于传代细胞系的优势,将分离毒株接种LMH细胞,验证分离毒株能否在LMH上增殖,传到第3代出现明显合胞体病变,且PCR检测为阳性。透射电镜结果显示该分离株可以在LMH上有效增殖。对分离株进行高通量测序,测序结果显示分离株CH/HN/2022的基因组全长为152 218 bp,G+C含量为48%,共编码79个推定的开放阅读框,基因组的结构与已报道的ILTV高度一致。遗传进化分析显示该分离株与美国毒株81658的全基因组核苷酸序列同源性为98.8%;与中国国内已发表的其余15株全基因组核苷酸序列同源性在95.8%-96.5%,在UL区有约3 340 bp的缺失,在末端重复序列（TR）和内部重复序列（IR）有855 bp核苷酸的增加。本研究毒株的分离鉴定丰富了中国ILTV流行病学信息。***分离株CH/HN/2022培养特性与致病性研究为了进一步探究ILTV分离株CH/HN/2022的体外增殖和对SPF易感鸡的致病特性,将分离株在LMH细胞上传代,测定病毒的一步生长曲线。接种12 h后病毒滴度开始上升,108 h滴度达到顶峰104.93 TCID50/100μL。将分离毒株通过单侧点眼、滴喉两种不同途径分别感染4周龄SPF鸡研究其致病性,感染后逐日观察鸡的临床表现,连续观察21 d。结果显示,单侧点眼感染鸡临床不表现任何症状,滴喉途径感染鸡只有1/10鸡在感染后72 h出现轻微的张口呼吸症状,48 h后症状消失;在观察期结束后剖检所有实验鸡,感染鸡的喉头、气管、肺脏均未发现肉眼可见的病变;病理组织学检查发现感染组气管粘膜层增厚,炎性细胞浸润,对照组未发现肉眼可见病变。喉头拭子排毒检测结果显示,两种途径感染鸡在感染后第4 d均有排毒,感染后第8 d通过单侧点眼途径感染有2/10鸡排毒,至第12 d所有感染鸡均不排毒。试验结果显示,ILTV分离株CH/HN/2022是一株弱毒株。***分离株CH/HN/2022作为弱毒疫苗的免疫原性和免疫效力评价在证明ILTV分离株CH/HN/2022是一株弱毒株的基础上,为了评估其作为防控ILT的弱毒疫苗的潜力,本研究评估了CH/HN/2022的免疫原性和免疫效力。对4周龄SPF鸡通过单侧点眼的方式进行免疫,免疫后每周采集血清检测抗体效价。结果显示,ILTV分离株CH/HN/2022可诱导机体产生针对ILTV的特异性抗体。免疫3周后利用ILTV强毒WG株通过滴喉途径攻毒,攻毒剂量为2×104.3EID50,逐日观察各组鸡的临床表现,连续观察14 d。试验结果显示,在整个观察期内,免疫组在攻毒后未表现任何临床症状;未免疫攻毒组均出现呼吸困难、咳出带血黏液等临床症状,并在攻毒后6 d内全部死亡。喉头拭子排毒检测结果显示,免疫攻毒组鸡在攻毒第4 d有3/10鸡排毒,但排毒量

关键词：传染性喉气管炎病毒病毒分离鉴定遗传进化致病性弱毒活疫苗

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苦瓜种质资源农艺和品质性状遗传多样性分析

中国蔬菜 2024年第3期 104-110页

作者：汪自松李兆佳罗厚仟沈伟王涛涛杨静刘正鲁百色学院农业与食品工程学院广西百色533000 华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室湖北武汉430070 贵州大学精细化工研究开发中心贵州贵阳550025

以48份苦瓜种质资源为试材,对与果实相关的10个农艺性状和5个品质性状进行变异性和相关性研究,并进行主成分分析和聚类分析。结果表明:农艺性状平均变异系数为33.9%,瓜棱变异系数最大,瓜长最小,变异范围为18.0%~49.6%,表明苦瓜的遗传基... 详细信息

以48份苦瓜种质资源为试材,对与果实相关的10个农艺性状和5个品质性状进行变异性和相关性研究,并进行主成分分析和聚类分析。结果表明:农艺性状平均变异系数为33.9%,瓜棱变异系数最大,瓜长最小,变异范围为18.0%~49.6%,表明苦瓜的遗传基础较宽。相关性分析与主成分分析表明,与果实相关的10个农艺性状间呈极显著相关,农艺性状与品质性状之间的相关性不高,且品质性状之间不存在显著相关关系,表明农艺性状与品质性状的遗传选择相对独立。农艺性状主成分分析中4个主成分累计贡献率为75.51%,单瓜鲜质量与单瓜干质量、瓜上径粗和瓜下径粗呈极显著正相关,表明选育瓜径粗较大的材料有利于配制单瓜鲜质量适中的高产杂交组合。聚类分析在D2=5时,将48份苦瓜材料分为特征不同的三大类,并筛选出早熟材料131-1、2101-2、2116,晚熟材料2106-4,综合性状较好的材料46-1-1、67-1、80-1,以及雌性系168-1,这8份苦瓜种质可作为优异目标亲本选择。

关键词：苦瓜遗传多样性主成分分析聚类分析

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基于叶绿体基因片段的井冈寒竹属系统发育关系研究

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江西农业大学学报 2024年第4期46卷 954-968页

作者：刘恒汪城坤冀雪楠杨光耀国春策张文根江西农业大学林学院/江西省竹子种质资源与利用重点实验室江西南昌330045

【目的】井冈寒竹属(Gelidocalamus Wen)属于禾本科(Poaceae)竹亚科(Bambusoideae)青篱竹族(***),是中国亚热带地区的特产散生竹属。该属植物为灌木状木本竹,地下茎呈复轴型,秆细长,每节多分枝,当年不再产生次级分枝,小枝末端通常仅有1... 详细信息

【目的】井冈寒竹属(Gelidocalamus Wen)属于禾本科(Poaceae)竹亚科(Bambusoideae)青篱竹族(***),是中国亚热带地区的特产散生竹属。该属植物为灌木状木本竹,地下茎呈复轴型,秆细长,每节多分枝,当年不再产生次级分枝,小枝末端通常仅有1片叶子,花序为圆锥型,雄蕊为3枚,秋冬季节发笋。井冈寒竹属植物主要产自中国长江以南的低海拔地区,其中南岭地区是该属植物物种多样性的分布中心,其栖息在林下、沟涧的阴凉潮湿处,呈现片状分布,具有观赏价值、食用价值和生态平衡效应。目前,该属植物的系统发育关系仍存在较大争议。本研究旨在对叶绿体基因片段的系统发育重建,初步探讨该属植物种间的亲缘关系,为深入理解竹类植物的演化历史提供一定的参考资料。【方法】试验广泛采用青篱竹族11个支系26属82种以及簕竹属(Bambusa)和牡竹属(Dendrocalamus)外类群6种作为样品。利用7个叶绿体基因片段,即rpl32-trnL、rps16-trnQ、trnC-rpoB、trnD-trnT、trnT-trnL、trnG-trnT(t)和matK,对井冈寒竹属及其近缘类群的系统发育关系进行重建。结合通过分子钟估算,探究其起源和类群间的分化时间。【结果】(1)系统发育分析结果表明,井冈寒竹属(Gelidocalamus)为复系类群,成员分别聚在青篱竹族的Shibataea clade(IV)和Phyllostachys clade(V)两个分支中;(2)分化时间估算结果表明,IV、V分支分别在5.44 Mya和3.41 Mya分化出来,除小蒙竹(***)外,井冈寒竹属其余种在约3 Mya间陆续分化出来。【结论】井冈寒竹属不是一个自然的单系类群;红壳寒竹(***)应归于箬竹属下;亮竿竹(***)可能为井冈寒竹属和箬竹属的杂交起源;冬顶寒竹(***)与同春箬竹(***)近缘,或为箬竹属成员,或为一独立分支。本研究通过重建井冈寒竹属的系统发育关系,对该属内成员的系统位置进行了初步阐述,为争议类群的归属问题提供了参考依据。

关键词：温带木本竹井冈寒竹属系统发育关系分化时间估算

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应用昆虫生命表定量评价外来实蝇入侵力

植物保护学报 2023年第3期50卷 839-840页

作者：贾筱沄王祎丹赵紫华中国农业大学植物保护学院植物生物安全系北京100193 三亚中国农业大学研究院海南三亚572025

昆虫生命表是对昆虫种群系统研究过程中的一套重要技术,生命表主要利用存活率、瞬时死亡率、死亡分布和生命期望等参数描述昆虫的生活史,生命表可广泛用于昆虫发育、生物防治、进化、入侵等研究(Hong et al.,2022)。实蝇广泛分布于世界... 详细信息

昆虫生命表是对昆虫种群系统研究过程中的一套重要技术,生命表主要利用存活率、瞬时死亡率、死亡分布和生命期望等参数描述昆虫的生活史,生命表可广泛用于昆虫发育、生物防治、进化、入侵等研究(Hong et al.,2022)。实蝇广泛分布于世界各地,是为害果蔬的重要害虫之一,其中约250种具有重要经济意义(Leonardo et al.,2017)。

关键词：昆虫生命表实蝇生物防治昆虫种群参数描述定量评价生活史瞬时死亡率

稻瘟菌侵染诱导水稻凝集素基因的表达(英文)

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Acta Botanica Sinica 2003年第1期45卷 76-81页

作者：秦庆明张全赵文生王云月彭友良中国农业大学植物病理系北京100094 云南农业大学植物病理系昆明650201

利用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR),从非亲和性稻瘟菌生理小种131侵染的水稻品种爱知旭(Oryza smti-va *** Aichi-asahi)叶片中分离了8个诱导差异表达的cDNA片段。对这8个差示片段进行了回收、重扩增和克隆,以其中一个长度为321碱基并与... 详细信息

利用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR),从非亲和性稻瘟菌生理小种131侵染的水稻品种爱知旭(Oryza smti-va *** Aichi-asahi)叶片中分离了8个诱导差异表达的cDNA片段。对这8个差示片段进行了回收、重扩增和克隆,以其中一个长度为321碱基并与甘露糖结合水稻凝集素和水稻盐诱导蛋白基因高度同源的差示片段为探针,筛选水稻非亲和性cDNA文库,获得12个阳性克隆。序列测定和数据库查询表明该基因的cDNA与水稻凝集素基因的cDNA及盐诱导蛋白基因的cDNA核苷酸同源性高达96％,推定的氨基酸序列与甘露糖结合水稻凝集素的氨基酸序列一致,与水稻盐诱导蛋白仅相差2个氨基酸。Southem杂交显示该基因在水稻基因组中有两个同源拷贝数,North杂交表明非亲和性稻瘟菌侵染可强烈诱导该基因表达。因此推测该基因参与了水稻对稻瘟菌侵染的防御反应。

关键词： mRNA差异显示防御反应稻瘟菌侵染诱导水稻凝集素基因表达