一株ILTV田间弱毒株的分离鉴定与生物学特性评价

作     者：徐鸣荷 

作者单位：河南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵军

授予年度：2024年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：传染性喉气管炎病毒 病毒分离鉴定 遗传进化 致病性 弱毒活疫苗 

摘      要：传染性喉气管炎（Infectious laryngotracheitis,ILT）是由传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus,ILTV）引起的一种鸡的急性、高度接触性呼吸道传染病,在全球范围内广泛流行。发病鸡以呼吸困难、咳嗽、咳出带血黏液、眼睑肿胀、产蛋量下降为特征。近年来ILT在我国流行严重,给养禽业带来巨大经济损失。 ILT的防控目前主要采用弱毒活疫苗对易感鸡进行免疫,我国目前使用的商品化疫苗有鸡胚源活疫苗（CEO）、组织细胞源活疫苗（TCO）及基因工程活载体疫苗。CEO和TCO弱毒活疫苗由强毒株连续传代致弱获得,遗传背景通常不清晰,免疫后副反应大,且疫苗株在鸡群中的连续传代存在毒力返强的风险;利用鸡痘病毒作为载体表达ILTV强毒株的g B抗原基因的活载体疫苗与弱毒活疫苗相比安全性较好,但对ILT的免疫效果不够理想。无论是鸡自然感染还是疫苗免疫,ILTV均会在鸡的中枢神经系统特别是三叉神经节建立终身潜伏感染。当机体受到应激因素刺激时,潜伏的ILTV会被重新激活向外界散毒,从而感染其他易感鸡,这使得ILT的防控与净化难度增大。筛选安全性更好的ILTV疫苗株和开发新型安全高效的ILT疫苗是养禽业的迫切需求。 本研究于2022年在河南省一未接种ILT疫苗的蛋鸡场常规送检样品中分离到一株ILTV,并命名为ILTV CH/HN/2022。测定了该分离株的全基因组序列并进行了遗传进化分析,研究了其在体外的复制特性、对易感鸡的致病性,以及其作为弱毒活疫苗的免疫原性和免疫效力。研究结果丰富了我国ILTV的流行病学信息,为我国ILT防控及疫苗株的选择提供了参考。本研究包括以下几方面内容: ***分离株的鉴定与遗传进化分析 本研究在河南某蛋鸡场采集的咽拭子样品中检测到ILTV阳性,并通过9日龄SPF鸡胚成功分离到一株ILTV,命名为ILTV CH/HN/2022。基于传代细胞系的优势,将分离毒株接种LMH细胞,验证分离毒株能否在LMH上增殖,传到第3代出现明显合胞体病变,且PCR检测为阳性。透射电镜结果显示该分离株可以在LMH上有效增殖。对分离株进行高通量测序,测序结果显示分离株CH/HN/2022的基因组全长为152 218 bp,G+C含量为48%,共编码79个推定的开放阅读框,基因组的结构与已报道的ILTV高度一致。遗传进化分析显示该分离株与美国毒株81658的全基因组核苷酸序列同源性为98.8%;与中国国内已发表的其余15株全基因组核苷酸序列同源性在95.8%-96.5%,在UL区有约3 340 bp的缺失,在末端重复序列（TR）和内部重复序列（IR）有855 bp核苷酸的增加。本研究毒株的分离鉴定丰富了中国ILTV流行病学信息。 ***分离株CH/HN/2022培养特性与致病性研究 为了进一步探究ILTV分离株CH/HN/2022的体外增殖和对SPF易感鸡的致病特性,将分离株在LMH细胞上传代,测定病毒的一步生长曲线。接种12 h后病毒滴度开始上升,108 h滴度达到顶峰104.93 TCID50/100μL。将分离毒株通过单侧点眼、滴喉两种不同途径分别感染4周龄SPF鸡研究其致病性,感染后逐日观察鸡的临床表现,连续观察21 d。结果显示,单侧点眼感染鸡临床不表现任何症状,滴喉途径感染鸡只有1/10鸡在感染后72 h出现轻微的张口呼吸症状,48 h后症状消失;在观察期结束后剖检所有实验鸡,感染鸡的喉头、气管、肺脏均未发现肉眼可见的病变;病理组织学检查发现感染组气管粘膜层增厚,炎性细胞浸润,对照组未发现肉眼可见病变。喉头拭子排毒检测结果显示,两种途径感染鸡在感染后第4 d均有排毒,感染后第8 d通过单侧点眼途径感染有2/10鸡排毒,至第12 d所有感染鸡均不排毒。试验结果显示,ILTV分离株CH/HN/2022是一株弱毒株。 ***分离株CH/HN/2022作为弱毒疫苗的免疫原性和免疫效力评价 在证明ILTV分离株CH/HN/2022是一株弱毒株的基础上,为了评估其作为防控ILT的弱毒疫苗的潜力,本研究评估了CH/HN/2022的免疫原性和免疫效力。对4周龄SPF鸡通过单侧点眼的方式进行免疫,免疫后每周采集血清检测抗体效价。结果显示,ILTV分离株CH/HN/2022可诱导机体产生针对ILTV的特异性抗体。免疫3周后利用ILTV强毒WG株通过滴喉途径攻毒,攻毒剂量为2×104.3EID50,逐日观察各组鸡的临床表现,连续观察14 d。试验结果显示,在整个观察期内,免疫组在攻毒后未表现任何临床症状;未免疫攻毒组均出现呼吸困难、咳出带血黏液等临床症状,并在攻毒后6 d内全部死亡。喉头拭子排毒检测结果显示,免疫攻毒组鸡在攻毒第4 d有3/10鸡排毒,但排毒量