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Molecular cloning of virb12 gene of Brucella melitensis 16M strain in pET28a vector

Asian Pacific Journal of Tropical Medicine 2012年第7期5卷 511-513页

作者： Shiva Mirkalantari Nour Amirmozafari Bahram Kazemi Gholamreza Irajian Tehran University of Medical Sciences School of MedicineMicrobiology DepartmentTehranIran Shahid Beheshli University of Medical Sciences Department of BiotechnologyTehranIran

Objective:To clone the virb12 gene in pET28a expression vector for production of recombinant protein to be used as antigenic component for future serological test ***: Brucella melitensis(***) 16M strain was cultured and bacterial DNA was extracted by Bioneer AccuPrep~ Genomic DNA Extraction *** primer pair was designed based on Brucella virb12 gene sequence with BamHI and HindIII restriction site at 5’ end of the forward and reverse primers,*** amplification was performed using PrimSTAR~ HS DNA polymerase and the PCK product was purified by DNA AccuPrepGel Purification *** DNA was cloned into pJET1.2 cloning ***12 gene fragment was excised from pJET1.2 asing BamHI/HindIII and subsequendy subcloned into pET28a(+).Results:Brucella virb12 gene was successfully cloned in pJET1.2 and then in pET28a(+) *** and restriction enzyme digestion confirms the ***:We cloned and expressed the Brucella virb12 gene which could be used as antigenic component for specific serological assay development.

关键词： Brucella Cloning virb12 pET28a pJE1.2

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布鲁氏菌virb12的重组表达及其用于标记疫苗细胞免疫鉴别研究

布鲁氏菌VirB12的重组表达及其用于标记疫苗细胞免疫鉴别研究

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作者：李宏艳沈阳农业大学

学位级别：硕士

研究背景:布鲁氏菌病(简称布病)是一种严重危害畜牧业的人兽共患病,动物布病主要依赖疫苗免疫来预防和控制。目前,国内疫苗株主要有3种,分别是S2(主要用于猪布鲁氏防疫)、A19(用于牛布鲁氏防疫)、M5-90(用于绵羊布鲁氏防疫)。这些疫苗... 详细信息

研究背景:布鲁氏菌病(简称布病)是一种严重危害畜牧业的人兽共患病,动物布病主要依赖疫苗免疫来预防和控制。目前,国内疫苗株主要有3种,分别是S2(主要用于猪布鲁氏防疫)、A19(用于牛布鲁氏防疫)、M5-90(用于绵羊布鲁氏防疫)。这些疫苗在预防和控制动物布鲁氏菌传播中发挥了重要作用。在这些疫苗的实际应用中,也存在一些问题。而血清学监测是动物布病诊断最主要的技术手段,主要有常用的虎红平板凝集、试管凝集等方法,但是这些方法无法区分哪些是自然感染抗体,哪些是免疫抗体,给防疫工作的开展带来很大困难。基因标记疫苗被认为是解决布病疫苗免疫与自然感染鉴别诊断难题的新型疫苗形式。由天康生物股份有限公司研发的A19-Δvirb12基因标记疫苗,其毒力与母本株相比降低,具有良好的保护作用。利用virb12蛋白能够进行血清学诊断。本研究旨在通过体外重组表达virb12蛋白,分析virb12蛋白的细胞免疫特性,并探讨其在疫苗免疫与自然感染中鉴别的可行性。研究方法:提取细菌基因组DNA,根据NCBI上登录的布鲁氏菌A19菌株virb12基因序列,使用分子生物学软件prime premier 5.0设计并合成了1对扩增virb12基因的引物。利用PCR方法扩增出virb12基因,并克隆到pET-28a质粒载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,表达产物经镍柱纯化,并对纯化后的表达产物进行免疫印迹鉴定。布鲁氏菌A19-Δvirb12菌株与亲本株布鲁氏菌A19株及牛种强毒2308株相比缺少了virb12基因,A19-Δvirb12菌株在生长过程中不表达对应的virb12蛋白,动物在免疫接种后无法产生virb12抗体及对应的免疫记忆,本实验通过体外提取A19菌株和A19-Δvirb12菌株免疫后试验动物的外周血淋巴细胞,培养后用virb12蛋白作为抗原刺激淋巴细胞,然后检测IFN-γ,对A19菌株和A19-Δvirb12菌株进行免疫鉴别。研究结果:本试验成功构建了布鲁氏菌A19菌株virb12基因的原核表达载体,诱导表达的virb12蛋白经纯化后获得了纯度较高的重组蛋白,免疫印记试验显示该重组蛋白有较好的反应原性,与布鲁氏菌野毒阳性血清有反应,与A19-Δvirb12菌株免疫血清无反应。采用纯化的virb12蛋白进行的体外IFN-γ检测,结果显示,A19菌株免疫组与A19-Δvirb12菌株免疫组的外周血淋巴细胞(PBMC)经virb12刺激后产生的IFN-γ存在显著差异(Pvirb12蛋白刺激可以鉴别区分A19菌株与A19-Δvirb12菌株免疫。结论:本研究成功构建了virb12蛋白的原核表达菌株,经纯化后的virb12蛋白可以作为刺激抗原,在体外IFN-γ水平上可实现对A19菌株免疫与A19-Δvirb12菌株免疫进行区分,为布氏菌病的防控及净化提供新的方法和思路。

关键词：布鲁氏菌 virb12 原核表达 γ干扰素

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牛布鲁氏菌virb12的分泌表达及间接ELISA检测方法的建立

牛布鲁氏菌VirB12的分泌表达及间接ELISA检测方法的建立

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作者：张婷婷沈阳农业大学

学位级别：硕士

布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的人畜共患传染病,该病在世界各国均有发生,我国也流行严重。该病在家畜中以流产为主要症状,在人上则出现波状热、关节炎和心内膜炎等症状。目前存在几种动物布鲁氏菌疫苗,... 详细信息

布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的人畜共患传染病,该病在世界各国均有发生,我国也流行严重。该病在家畜中以流产为主要症状,在人上则出现波状热、关节炎和心内膜炎等症状。目前存在几种动物布鲁氏菌疫苗,如猪布鲁氏菌2号减毒疫苗、牛布鲁氏菌A19减毒疫苗等,在我国也被广泛应用,对预防牛布鲁氏菌病起到了重要的作用。然而它们普遍存在对动物的保护率较低、对免疫人员的毒力较高、缺乏鉴别诊断标记不能进行辨别免疫动物和野毒感染动物等缺点。近年来,科研人员进行了大量的研究,在原来疫苗的基础上开发了多种基因缺失疫苗。目前在A19疫苗基础上缺失virb12基因的A19-Δvirb12基因缺失疫苗已经进入新兽药审批阶段,有望近期获批并推广应用,这将带来在该苗免疫畜群检测virb12抗体,以检测野毒感染的巨大需求。然而现在还没有相应的检测方法得到应用,本研究旨在建立基于virb12抗原的鉴别检测方法。为获得高纯度易纯化的布鲁氏菌virb12蛋白抗原,根据Gen Bank中的virb12的基因序列设计引物并进行扩增,扩增产物连接p BIC质粒后转化到短小芽孢杆菌中,得到了virb12蛋白的分泌型表达菌。诱导后对其进行了PAGE和Western Blotting鉴定。结果表明成功构建了virb12的分泌表达菌株,诱导后在培养上清中大量表达,蛋白含量高达80%,其能与布鲁氏菌标准阳性血清、6×His单克隆抗体发生反应,与A19-Δvirb12菌株免疫血清不发生反应。为获得高纯度布鲁氏菌virb12蛋白,对virb12分泌表达蛋白先后进行亲和纯化和离子交换纯化,将高纯度的virb12重组蛋白包被ELISA板,对其进行条件优化后初步建立了检测布鲁氏菌抗体的ELISA方法。研究结果表明,两步法纯化的virb12重组蛋白的效果很好,virb12重组蛋白的纯度可至98%以上。在建立的ELISA中,纯化重组蛋白的最适包被浓度为1mg·m L,最适封闭液为含5%脱脂奶粉的PBST溶液,血清最适稀释浓度为1:25,酶标抗体的最佳稀释浓度为1:1500。对20份阳性血清及12份阴性血清的检测结果表明,其与SUANOVIR Brucella-Ab C-ELISA试剂盒的总体符合率达到90.6%。为分析virb12蛋白的特异性抗原表位,发挥特异多肽易合成纯度高的优点,进行了virb12多肽ELISA的研究。根据virb12基因序列设计并合成了10条多肽。将合成的10条多肽分别作为抗原,通过dot-blotting实验进行初步筛选,再经过ELISA实验验证,最终确定了有反应原性的两条多肽P07和P08号多肽。将P07和P08这两条多肽进行生物素标记,分别将其作为抗原,与亲和素包被的酶标板进行ELISA实验,发现P07B多肽比P08B多肽的反应原性好。将P07B多肽作为抗原进行条件优化后,初步确立了检测布鲁氏菌抗体的ELISA试验方法。在建立的ELISA中,亲和素的最佳包被浓度为10mg·m L,P07B多肽的最佳包被浓度为1mg·m L,最佳封闭液为含10%猪血清的PBST溶液,血清最适稀释浓度为1:100,酶标抗体的最佳稀释浓度为1:3000。对19份阳性血清及13份阴性血清的检测结果表明,其与SUANOVIR Brucella-Ab C-ELISA试剂盒的总体符合率达到87.5%。上述实验的结果表明,本试验建立的以分泌表达纯化的virb12和P07B多肽为抗原的ELISA方法可以检测布鲁氏菌感染抗体,能从A19-Δvirb12免疫畜群检出野毒感染,有望研制成检测试剂盒用于养殖场布病的检测和净化。

关键词：布鲁氏菌 virb12 蛋白纯化生物素-亲和素 ELISA

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抗布氏杆菌Ⅳ型分泌系统表面蛋白virb12纳米抗体的制备

抗布氏杆菌Ⅳ型分泌系统表面蛋白VirB12纳米抗体的制备

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作者：熊婧璠新疆大学

学位级别：硕士

布鲁氏菌(Brucella spp)是一种兼性胞内寄生的革兰氏阴性短小杆菌,其感染累及多种组织和器官,是导致人畜共患病布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)的病原体。动物布病可导致流产和其他疾病发生。人类布病通常表现为高热、波状热,并且常... 详细信息

布鲁氏菌(Brucella spp)是一种兼性胞内寄生的革兰氏阴性短小杆菌,其感染累及多种组织和器官,是导致人畜共患病布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)的病原体。动物布病可导致流产和其他疾病发生。人类布病通常表现为高热、波状热,并且常并发关节炎。其对畜牧业有较大危害,其大面积感染可导致重大经济损失,因此对布病的预防和检测尤为重要。当前对布鲁氏菌感染和疫苗效果检测主要采用细菌培养和分离鉴别、凝集实验、血清学检查等方法,但这些方法均存在特异性和敏感性不高的缺点,因此需要开发特异性更高的检测方法和试剂。布鲁氏菌IV型分泌系统是贯穿细菌壁和外膜的一个多蛋白复合体,是布鲁氏菌的重要毒力因子。在Vir B的12个蛋白(Vir B1-Vir B12)中,Vir B12在Brucella IV型分泌系统中细菌与宿主的相互作用发挥重要作用,可作为一种布鲁氏菌血清学检测标记抗原。纳米抗体(nanobody)是源自骆驼重链抗体可变区(VHH)的一种新型小分子抗体。具有结构简单、易进行改造和性质稳定、生产成本低等优点,在疾病诊断治疗、病原检测等领域具有良好的应用潜力。本研究通过噬菌体展示技术筛选抗Vir B12的纳米抗体,并研究其性质,为今后开发基于纳米抗体的布病检测方法提供实验基础。研究内容分为以下两部分:***噬菌体展示文库的构建和Vir B12纳米抗体的筛选鉴定采用Vir B12重组蛋白六次免疫新疆双峰驼,从外周血中分离得到的淋巴细胞中提取总RNA,反转录得到c DNA,以VHH特异性引物,通过巢式PCR扩增VHH基因片段。将获得的VHH片段连接到p MECS噬菌粒载体,电转化大肠杆菌TG1感受态细胞,形成VHH基因文库。根据转化子数计算容为2.8×10cfu/m L。菌液PCR鉴定阳性插入率为100%,对随机挑选的克隆进行DNA测序,表明构建的文库库容较高、多样性较好。采用M13K07辅助噬菌体感染文库TG1菌,形成M13噬菌体VHH展示文库。抗Vir B12纳米抗体采用ELISA固相亲和富集方法进行筛选,共进行三轮富集。随机挑取第2和3轮富集的克隆,采用单克隆ELISA分析可溶性表达的纳米抗体与Vir B12的结合情况,与无关抗原BSA结合ODnm比值大于3判定为阳性克隆。共获得46个阳性克隆,序列测定和多重比对去除重复序列,最后得到个5非冗余序列,分别命名为D1、E6、H8、H9和H10。这些克隆在进化分析中显示分属5个不同家族。*** B12纳米抗体的原核表达、亲和力和热稳定性分析为了获得高效表达,将筛选鉴定的五个纳米抗体基因转化WK6菌株,在16°C下进行胞间质可溶性表达,采用Ni柱亲和层析纯化表达的重组蛋白。结果表明,五株纳米抗体均可以在WK6菌中以可溶形式表达,表达量均达到45mg/L以上。SDS-PAGE结果表明,获得了纯度接近90%的5株抗Vir B12纳米抗体D1、E6、H8、H9和H10。采用Western Blot和间接ELISA检测5株纳米抗体与Vir B12蛋白的结合活性;热稳定性采用系列温度(4℃、16℃、22℃、37℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃)处理,ELISA检测纳米抗体保留的抗原结合活性。结果表明,5株纳米抗体均具有较高的抗原结合活性,且存在较明显的抗原-抗体浓度依赖性。其中,D1在0.0001μg/m L仍有较好的抗原结合活性,表明该抗体为高亲和力抗体。在稳定性的测定中,4株纳米抗体均表现出较高的热稳定性,在90℃温度处理后,仍能保留60%以上的结合活性,其中D1在90℃后的抗原结合活性基本未受影响,显示出极高的热稳定性。五株抗体中,H8的热稳定最低。综上结果,本研究从Vir B12重组蛋白免疫的新疆双峰驼淋巴细胞中构建获得了库容为2.8×10cfu的VHH噬菌体展示文库,通过固相筛选富集和可溶性单克隆ELISA检测鉴定获得了5株具有较高亲和力的抗Vir B12纳米抗体,这些抗体均可以在细菌中高效表达,并具有很高的热稳定性,这些结果为Vir B12纳米抗体的进一步开发奠定了基础。

关键词：布鲁氏菌噬菌体展示纳米抗体 virb12 热稳定性

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抗布鲁氏杆菌Ⅳ型分泌系统表面蛋白virb12纳米抗体的制备

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国际生物医学工程杂志 2022年第4期45卷 287-293页

作者：熊婧璠谢媛张鑫王飞陈媛媛李江伟新疆大学生命科学与技术学院乌鲁木齐830046 新疆优迈生物技术有限公司乌鲁木齐830026

目的制备能与virb12抗原高亲和力结合的新疆双峰驼纳米抗体,为后续研究奠定基础。方法采用virb12重组蛋白6次免疫新疆双峰驼,从外周血中分离得到淋巴细胞后提取总RNA,通过巢式PCR扩增VHH基因片段构建噬菌体VHH展示文库。采用酶联免疫吸... 详细信息

目的制备能与virb12抗原高亲和力结合的新疆双峰驼纳米抗体,为后续研究奠定基础。方法采用virb12重组蛋白6次免疫新疆双峰驼,从外周血中分离得到淋巴细胞后提取总RNA,通过巢式PCR扩增VHH基因片段构建噬菌体VHH展示文库。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)固相亲和富集方法进行筛选。进行3轮亲和筛选后随机挑取出第2、3轮富集的克隆,ELISA分析可溶性表达的纳米抗体与virb12蛋白的结合情况。经过序列测定和多重比对去除重复序列,最后得到个5非冗余序列,分别命名为D1、E6、H8、H9和H10。将筛选鉴定的5个纳米抗体基因转化WK6菌株,在16℃下进行胞间质可溶性表达,经Ni亲和柱纯化表达后,Western Blot和ELISA法检测纳米抗体与virb12抗原的结合能力与热稳定性。结果经virb12蛋白免疫后的血清抗体效价最少为1∶24000。从virb12抗原免疫的新疆双峰驼淋巴细胞中获得了滴度为2.8×108 cfu/ml的VHH噬菌体展示文库。5株纳米抗体在WK6菌中以可溶形式表达。结果表明,5株抗virb12纳米抗体质量分数接近90%,且具有较高的抗原结合活性与明显的抗原-抗体浓度相关性;4株纳米抗体均表现出较高的热稳定性,在90℃处理后,仍能保留60%以上的结合活性。结论通过固相筛选富集和可溶性单克隆检测鉴定获得了5株具有较高亲和力和热稳定性的抗virb12纳米抗体,为virb12纳米抗体的进一步开发奠定了基础。

关键词：布鲁氏杆菌 virb12 纳米抗体噬菌体展示文库热稳定性

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