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Screening and breeding of high taxol producing fungi by genome shuffling

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Science China(Life Sciences) 2008年第3期51卷 222-231页

作者： ZHAO Kai, PING WenXiang, ZHANG LiNa, LIU Jun, LIN Yan, JIN Tao & ZHOU DongPo Laboratory of Microbiology, College of Life Science, Heilongjiang University, Harbin 150080, China 1. Laboratory of Microbiology College of Life Science Heilongjiang University Harbin 150080 China

To apply the fundamental principles of genome shuffling in breeding of taxol-producing fungi, Nodulisporium sylviform was used as starting strain in this work. The procedures of protoplast fusion and genome shuffling were studied. Three hereditarily stable strains with high taxol production were obtained by four cycles of genome shuffling. The qualitative and quantitative analysis of taxol produced was confirmed using thin-layer chromatography (TLC), high performance liquid chromatography (HPLC) and LC-MS. A high taxol producing fungus, Nodulisporium sylviform F4-26, was obtained, which produced 516.37 μg/L taxol. This value is 64.41% higher than that of the starting strain NCEU-1 and 31.52%―44.72% higher than that of the parent strains.

关键词： taxol taxol-producing fungi protoplast fusion genome shuffling

利用DNA shuffling技术构建重组PRRSV ORF5基因

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生物工程学报 2018年第6期34卷 888-896页

作者：刘建奎魏春华黄春芳陈小燕戴爱玲杨小燕龙岩学院生命科学学院福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室福建省生猪疫病防控工程技术研究中心福建龙岩364000

通过DNA shuffling技术对PRRSV ORF5基因进行改组,研究其对异源毒株交叉中和能力。将获得的嵌合基因△2ORF5与载体pET-32a连接,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21中,经诱导表达获得约42 kDa重组蛋白。将纯化的重组△2ORF5蛋白免疫BAL... 详细信息

通过DNA shuffling技术对PRRSV ORF5基因进行改组,研究其对异源毒株交叉中和能力。将获得的嵌合基因△2ORF5与载体pET-32a连接,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21中,经诱导表达获得约42 kDa重组蛋白。将纯化的重组△2ORF5蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,Western blotting试验表明其与4株亲本毒株重组ORF5蛋白具有良好的反应性。病毒感染抑制试验结果表明,多克隆抗体对4株亲本毒株具有较高的抑制率(>53%)。研究结果为研制新型PRRSV疫苗奠定了基础。

关键词： PRRSV ORF5基因 DNA shuffling 多克隆抗体病毒感染抑制试验

Genome shuffling筛选ε-聚赖氨酸高产菌及其对代谢流量分配的影响

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微生物学通报 2016年第12期43卷 2568-2577页

作者：李双颜鹏曾晨张宏建毛忠贵唐蕾江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

【目的】从代谢流量分配的角度,探讨Genome shuffling导致链霉菌ε-聚赖氨酸合成量提升的原因。【方法】从葡萄糖耐受型的亲本菌株Streptomyces ***32和ε-聚赖氨酸耐受型的亲本菌株Streptomyces albulus F15出发,进行三轮Genome shuffl... 详细信息

【目的】从代谢流量分配的角度,探讨Genome shuffling导致链霉菌ε-聚赖氨酸合成量提升的原因。【方法】从葡萄糖耐受型的亲本菌株Streptomyces ***32和ε-聚赖氨酸耐受型的亲本菌株Streptomyces albulus F15出发,进行三轮Genome shuffling,筛选得到ε-聚赖氨酸产量提高的链霉菌株Streptomyces ***3-44,采用通量分析方法构建链霉菌ε-聚赖氨酸合成代谢网络,并对上述3株菌的代谢通量进行比较。【结果】AF3-44的ε-聚赖氨酸摇瓶产量为3.1 g/L,较AS32和F15分别提高了34%和29%。3株菌株中AS32三羧酸循环(TCA)的代谢通量最高;F15磷酸戊糖途径(PPP)代谢通量最高;AF3-44流向赖氨酸合成前体天冬氨酸以及ε-聚赖氨酸的通量最高,TCA和PPP通量位于两亲本菌株的中间水平,其中TCA中流向异柠檬酸的通量分别为AS32和F15的77%和116%,PPP中流向5-磷酸核酮糖的通量分别为AS32和F15的149%和92%。【结论】Genome shuffling导致了代谢流的重新分布,流向前体赖氨酸和ε-聚赖氨酸通量的增加,以及PPP和TCA通量配比的改变是链霉菌ε-聚赖氨酸合成量增加的重要因素。

关键词： Genome shuffling 代谢通量代谢网络 ε-聚赖氨酸

Online shuffling with Task Duplication in Cloud

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ZTE Communications 2017年第4期15卷 38-42页

作者： ZANG Qimeng GUO Song School of Computer Science and Engineering The University of Aizu Department of Computing The Hong Kong Polytechnic University

Task duplication has been widely adopted to mitigate the impact of stragglers that run much longer than normal tasks. However,task duplication on data pipelining case would generate excessive traffic over the datacenter networks. In this paper, we study minimizing the traffic cost for data pipelining task replications and design a controller that chooses the data generated by the first finished task and discards data generated later by other replications belonging to the same task. Each task replication communicates with the controller when it finishes a data processing, which causes additional network overhead. Hence, we try to reduce the network overhead and make a trade-off between the delay of data block and the network overhead. Finally, extensive simulation results demonstrate that our proposal can minimize network traffic cost under data pipelining case.

关键词： cloud computing big data shuffling task duplication traffic

分段DNA shuffling:一种大分子海藻糖合酶有效的定向进化方法

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微生物学通报 2013年第2期40卷 362-372页

作者：刘艳超王宇凡钱柯帆张峻肖辰鹏邢来君李明春南开大学微生物学系分子微生物学与技术教育部重点实验室天津300071 天津市林业果树研究所天津300112

【目的】红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)海藻糖合酶(Trehalose synthase,M-TreS)将麦芽糖转化生成海藻糖只需一步反应,且具有很好的热稳定性及pH耐受性,是潜在的工业生产海藻糖的酶源。为了提高该酶的性能,有必要对其进行定向进化。... 详细信息

【目的】红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)海藻糖合酶(Trehalose synthase,M-TreS)将麦芽糖转化生成海藻糖只需一步反应,且具有很好的热稳定性及pH耐受性,是潜在的工业生产海藻糖的酶源。为了提高该酶的性能,有必要对其进行定向进化。【方法】M-TreS基因(M-treS)大小为2 889 bp。该蛋白质分子本身具有很大的进化空间,但是却不宜进行全长基因shuffling。分段DNA shuffling是为大分子蛋白质(基因≥2 000 bp)的进化而设计的一种方法。该方法分为三步:(1)用两对引物分别扩增目的基因的上游片段和下游片段;(2)上下游片段各自进行shuffling;(3)利用重叠延伸PCR连接上下游突变群,建立完整基因的突变文库。【结果】结合易错PCR,通过该方法经一轮进化获得一株酶活力是野生型1.6倍、催化效率是野生型2倍的突变株。序列分析表明,该突变株共有6个位点发生了氨基酸的替代,其中一个来自易错突变,2个来自同源重组,3个为随机突变。【结论】分段DNA shuffling是进化大分子蛋白质的有效方法。

关键词：红色亚栖热菌海藻糖合酶定向进化易错PCR 分段DNA shuffling

通过DNA shuffling技术获得初步解除苯丙氨酸反馈抑制的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(AroG)突变株

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复旦学报（自然科学版） 2010年第3期49卷 287-292页

作者：郝瑞昕边英男李晓萍管栋印江培翃黄伟达复旦大学生物化学系上海200433

aroG基因编码的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase,AroG)是苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)合成途径中的关键酶之一,受到苯丙氨酸的反馈抑制.为得到解除苯丙氨酸反馈抑制的突变AroG,分别以Escherichia coli(***)野生型和突变型aroG基因以及Sal monella typhi mnrium(*** mnrium)野生型aroG基因为亲本,通过DNA suffling技术对aroG进行改组,获得的改组分子与载体pET30a连接得到改组文库,转化到***21(DE3)中,在含有Phe类似物对氟苯丙氨酸(p-FP)的培养基上筛选转化子,获得4个解除Phe反馈抑制的克隆.

关键词： DNA shuffling aroG 苯丙氨酸反馈抑制

利用DNA shuffling构建部分解除对氟苯丙氨酸反馈抑制的aroG

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复旦学报（自然科学版） 2010年第5期49卷 568-574页

作者：李晓萍边英男郝瑞昕江培翃黄伟达复旦大学生物化学系上海200433

3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(DAHPs)是芳香族氨基酸生物合成途径中关键的限速酶,在大肠杆菌中有3种同工酶,分别由aroG(Phe)、aroH(Trp)和aroF(Tyr)基因编码,这3种酶分别受苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸反馈抑制.为得到解除苯丙氨酸... 详细信息

3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(DAHPs)是芳香族氨基酸生物合成途径中关键的限速酶,在大肠杆菌中有3种同工酶,分别由aroG(Phe)、aroH(Trp)和aroF(Tyr)基因编码,这3种酶分别受苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸反馈抑制.为得到解除苯丙氨酸反馈抑制的突变AroG,以Escherichia coli野生型aroG、aroH和aroF基因为亲本,通过DNAshuffling技术对aroG基因进行改组,将获得的改组aroG与载体pET30a连接得到改组文库,转化到***21(DE3)中,在含有Phe类似物对氟苯丙氨酸(p-FP)的培养基上筛选转化子,获得2个能耐受10 mg/mLp-FP的克隆.这2个克隆的测序结果显示,其中一个发生了3个点突变:C129T,A531G,A1032G;另一个发生了3个点突变T77A,G883A,A1032G和4个碱基的插入突变即922位插入A,943位插入CG,971位插入A.2个改组AroG的最适pH和最适温度与野生型AroG相比无明显变化.

关键词： DAHP合成酶 aroG aroF aroH DNA shuffling Phe反馈抑制

一种方便、无PCR过程的DNA shuffling方法

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科学通报 2004年第5期49卷 448-450页

作者：王强刘秋云李刚李宝健中山大学生命科学学院基因工程教育部重点实验室广州510275

目前大多数的DNA shuffling方法都需要PCR过程。由于一些限制内切酶的识别位点与切割位点不重叠而产生不同的黏性末端,当再连接的时候,同源片段之间就可以混合起来按照正确顺序组装成新的嵌合体分子。利用这种性质,构建了一种新的、无PC... 详细信息

目前大多数的DNA shuffling方法都需要PCR过程。由于一些限制内切酶的识别位点与切割位点不重叠而产生不同的黏性末端,当再连接的时候,同源片段之间就可以混合起来按照正确顺序组装成新的嵌合体分子。利用这种性质,构建了一种新的、无PCR过程的、简便的shuffling方法。

关键词： DNA shuffling 限制性内切酶组织型纤溶酶原激活剂基因重组嵌合体分子

利用DNA shuffling技术构建含5个cry基因的突变体库以筛选高毒力杀虫蛋白

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华中农业大学学报 2011年第1期30卷 13-17页

作者：张小琼林拥军华中农业大学生命科学技术学院武汉430070

以改造合成的5个Bt基因(cry1C*、cry2A*、cry1Ab、cry1Ac和cry9C*)为材料,利用DNAshuff-ling的体外分子进化技术构建1个含有1 000个重组基因克隆的大肠杆菌表达库;通过诱导表达重组蛋白,ELISA方法测定蛋白表达量,以棉铃虫(Helicoverpa a... 详细信息

以改造合成的5个Bt基因(cry1C*、cry2A*、cry1Ab、cry1Ac和cry9C*)为材料,利用DNAshuff-ling的体外分子进化技术构建1个含有1 000个重组基因克隆的大肠杆菌表达库;通过诱导表达重组蛋白,ELISA方法测定蛋白表达量,以棉铃虫(Helicoverpa armigera)为试验昆虫进行毒性试验。结果显示:重组克隆的蛋白毒性与阳性对照Cry1Ac相比,增强的有122个,持平的有38个,有毒性但毒性降低的有232个,失去毒性的有608个;对这1 000个重组克隆进行了测序,比较了重组基因与原始基因的序列同源性,除去55个克隆未能找到其原始基因来源,将其余的945个重组克隆从5个Cry蛋白的核苷酸编码序列的同源性出发,划分为源于cry1Ab,cry1Ac,cry1C*,cry2A*和cry9C*的5个重组克隆类型。根据毒力变化分为毒力上升、持平、下降3组。对1 000个重组基因的氨基酸序列进行分析后发现,相对于毒力上升和持平组,5个毒力下降组的重组克隆间的氨基酸序列同源性最低。

关键词： DNA shuffling Cry蛋白序列比较突变体库