分段DNA shuffling:一种大分子海藻糖合酶有效的定向进化方法

作     者：刘艳超 王宇凡 钱柯帆 张峻 肖辰鹏 邢来君 李明春 

作者机构：南开大学微生物学系分子微生物学与技术教育部重点实验室天津300071 天津市林业果树研究所天津300112 

出 版 物：《微生物学通报》 (Microbiology China)

年 卷 期：2013年第40卷第2期

页      面：362-372页

核心收录：

学科分类：08[工学] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

基　　金：天津市应用基础及前沿技术研究计划(No.10JCYBJC09600 10JCYBJC05000) 国家自然科学基金项目(No.21076162) 

主　　题：红色亚栖热菌 海藻糖合酶 定向进化 易错PCR 分段DNA shuffling 

摘      要：【目的】红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)海藻糖合酶(Trehalose synthase,M-TreS)将麦芽糖转化生成海藻糖只需一步反应,且具有很好的热稳定性及pH耐受性,是潜在的工业生产海藻糖的酶源。为了提高该酶的性能,有必要对其进行定向进化。【方法】M-TreS基因(M-treS)大小为2 889 bp。该蛋白质分子本身具有很大的进化空间,但是却不宜进行全长基因Shuffling。分段DNA shuffling是为大分子蛋白质(基因≥2 000 bp)的进化而设计的一种方法。该方法分为三步:(1)用两对引物分别扩增目的基因的上游片段和下游片段;(2)上下游片段各自进行Shuffling;(3)利用重叠延伸PCR连接上下游突变群,建立完整基因的突变文库。【结果】结合易错PCR,通过该方法经一轮进化获得一株酶活力是野生型1.6倍、催化效率是野生型2倍的突变株。序列分析表明,该突变株共有6个位点发生了氨基酸的替代,其中一个来自易错突变,2个来自同源重组,3个为随机突变。【结论】分段DNA shuffling是进化大分子蛋白质的有效方法。