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基于shotgun metabarcoding技术的养阴清肺丸物种鉴定研究

基于shotgun metabarcoding技术的养阴清肺丸物种鉴定研究

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作者：赵红烨承德医学院

学位级别：硕士

中成药成分复杂,其物种成分鉴定是中药鉴定中的一大难点。中成药原料药材错误或虚假投料严重影响了中成药临床使用的安全性、有效性和在国际市场的发展。传统鉴定方法基于单一或几个指标性成分的质量控制模式存在专属性差的问题,难以反... 详细信息

中成药成分复杂,其物种成分鉴定是中药鉴定中的一大难点。中成药原料药材错误或虚假投料严重影响了中成药临床使用的安全性、有效性和在国际市场的发展。传统鉴定方法基于单一或几个指标性成分的质量控制模式存在专属性差的问题,难以反映中成药的整体质量,仍然需要更为有效的鉴定方法以解决中成药处方成分物种鉴定的难题。中成药养阴清肺丸含地黄、麦冬、牡丹皮、薄荷、川贝母、白芍、玄参、甘草八味原料药材,较多的药材味数使鉴定难度增加。此外,养阴清肺丸蜜丸含有淀粉和蜂蜜给DNA提取增加了难度,且药品在加工过程中存在DNA降解问题,给分子鉴定技术带来困难。因此,本论文在完成2020版《中国药典》规定的养阴清肺丸传统鉴定方法的基础上,基于磁珠法优化中成药养阴清肺丸DNA提取流程,建立了高通量测序结合四种条形码(ITS2,psb A-trn H,mat K和rbc L)的shotgun metabarcoding方法,为养阴清肺丸的物种鉴定提供了新方法。目的:本论文选取中成药养阴清肺丸为研究对象,基于磁珠法优化中成药的DNA提取流程,结合传统鉴定和shotgun metabarcoding方法对中成药养阴清肺丸进行物种鉴定,旨在为中成药建立一种更加全面、准确的鉴定体系。方法:1.采用《中国药典》2020版规定的传统鉴定方法,即显微鉴定、薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)对市售养阴清肺丸样品进行鉴定。在光学显微镜下观察养阴清肺丸的内部组织结构及细胞形态。TLC中以丹皮酚、芍药苷和玄参药材为化学对照品,其中丹皮酚以环己烷-乙酸乙酯(13:2)为展开剂,芍药苷和玄参药材以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5:3:1:1)为展开剂。参照《中国药典》制备HPLC中的对照品和供试品溶液,将对照品溶液连续进样五次,检验是否满足系统适用性要求。再将对照品溶液与供试品溶液各进样10μL于液相色谱仪进行测定,分别进行两次重复,计算两次丹皮酚含量的平均值。2.参考2020版《中国药典》收集养阴清肺丸中八味原料药材,另外收集一份西洋参药材作为阳性对照。首先对所有原料药材进行形态学、性状鉴定,再采用DNA条形码技术获取原料药材的ITS2、psb A-trn H、mat K和rbc L四种片段的参考序列并进行BLAST比对。将参考序列与Genbank中下载的序列一起构建系统发育树,进一步确保原料药材基原的准确性。3.通过筛选前处理阶段、裂解阶段、沉淀阶段的条件,优化基于磁珠法的养阴清肺丸DNA提取流程。前处理阶段分别考察DD水和核分离液的洗涤效果;裂解阶段分别考察CTAB、SDS、CTAB-SDS三种裂解液的裂解效果以及56°C水浴八小时、65°C水浴两小时和65°C水浴四小时三种水浴条件对DNA浓度的影响;沉淀阶段分别考察甲醇、乙醇、异丙醇、甲醇-醋酸钠、乙醇-醋酸钠、异丙醇-醋酸钠六种方式的沉淀效果及10、20和30μL不同磁珠用量对DNA纯度的影响。将基于磁珠优化后的DNA提取流程与植物试剂盒进行对比,从而确定养阴清肺丸最佳DNA提取方案,获取高质量的养阴清肺丸DNA。4.参照2020版《中国药典》制备两份养阴清肺丸自制样品HSZY166和HSZY178,在HSZY178中添加与养阴清肺丸中最小入药量相等的西洋参药材;收集四份市售养阴清肺丸样品并分别编号为A17、HSZY007、HSZY141和HSZY142。基于磁珠法优化的DNA提取流程,对两份自制样品和四份市售样品进行DNA提取和shotgun测序,所得序列经数据质控、富集、组装、注释和mapping等步骤,将筛选后可靠的OTUs通过BLAST进行物种比对,并选择相应的具有代表性的OTU制作系统发育树,对中成药的物种组成进行注释和可视化分析。将自制样品获得的组装序列与一代参考序列进行对比,以验证shotgun metabarcoding方法的准确性;通过检测HSZY178中加入的西洋参以验证该技术的灵敏性。并将shotgun metabarcoding方法用于检测市售养阴清肺丸中的处方成分,以验证该技术在市售样品中的适用性。从而建立基于shotgun metabarcoding技术的中成药养阴清肺丸物种鉴定方法。结果:1.使用显微鉴定发现市售养阴清肺丸样品可以观察到薄壁细胞呈黑棕色(地黄)、草酸钙针状晶体成束聚集(麦冬)、纤维束周围的薄壁细胞含有草酸钙方晶(甘草)、棕色的石细胞呈矩形形状(玄参)和扁平球形腺鳞(薄荷),符合2020版《中国药典》中养阴清肺丸的显微特征。TLC结果表明,四份养阴清肺丸市售样品均可检测到丹皮酚、玄参和芍药苷的斑点。HPLC的结果表明市售养阴清肺丸样品A17、HSZY007、HSZY141、HSZY142每丸中丹皮酚含量分别为8.2 mg、9.1 mg、6.7 mg和6.2 mg,均大于药典中规定的5.8 mg,符合养阴清肺丸质量标准。2.通过形态学、性状鉴定初步确定所有原料药材及阳性对照

关键词：中成药养阴清肺丸 shotgun metabarcoding 显微鉴定薄层色谱高效液相色谱物种鉴定

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基于DNA条形码技术的中成药五虎散生物组分鉴定研究

基于DNA条形码技术的中成药五虎散生物组分鉴定研究

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作者：穆威杉承德医学院

学位级别：硕士

中成药多为复方制剂,化学成分复杂,原料药材经粉碎加工后鉴定难度增加,现有的传统中药鉴定方法在中成药原料错误投料及真菌杂质等外源污染物的监管方面仍具有一定挑战性。中成药五虎散5种原料药材中,同时包含3个伞形科物种,基于传统方... 详细信息

中成药多为复方制剂,化学成分复杂,原料药材经粉碎加工后鉴定难度增加,现有的传统中药鉴定方法在中成药原料错误投料及真菌杂质等外源污染物的监管方面仍具有一定挑战性。中成药五虎散5种原料药材中,同时包含3个伞形科物种,基于传统方法的鉴定难度增加,同时还包含有毒物种天南星。五虎散投料的准确性问题关系着其临床使用的疗效与安全,积极开展中成药五虎散生物组分鉴定的相关研究刻不容缓。目的:本研究以原粉入药的中成药五虎散为研究对象,基于DNA barcoding技术获取5种原料药材及阳性对照药材的参考序列。再通过DNA metabarcoding和shotgun metabarcoding两种方法,对中成药五虎散自制样品和市售样品的生物组分进行检测。旨在为中成药五虎散的生物组分鉴定提供不同的策略和技术手段,作为中成药传统鉴定方法的有效补充,形成更全面的生物组分鉴定体系。方法:1.收集五虎散的5种原料药材或基原植物以及阳性对照药材西洋参,首先采用形态学及性状鉴定方法对药材的真伪进行初步鉴定,并采用传统的Sanger测序技术对各药材进行DNA条形码分析,经与标准序列进行复查核对,确保药材基原的准确性,获取各药材ITS2、psb A-trn H、mat K和rbc L片段的参考序列。最终基于DNA barcoding技术保证五虎散各原料药材及阳性对照药材的准确性并获取参考序列。2.按中国药典五虎散项下的制备方法自制2份五虎散参考样品(HSZY160和HSZY172),其中HSZY172中加入与五虎散中最小入药量等量的西洋参作为阳性对照。从药店收集4份五虎散市售样品(WHS001、WHS002、WHS003和WHS004),使用优化后的DNA提取方法提取6份中成药的总DNA,基于ITS2片段选择MS2F/MS2R和MS3F/MS3R两对引物进行PCR扩增,利用Illumina Miseq测序平台进行高通量测序。经序列拼接、质控、过滤、去冗余、OTU聚类及BLAST比对等生物信息学分析,最终基于DNA metabarcoding技术对中成药五虎散的生物组分进行鉴定。3.以2份五虎散自制样品(HSZY160和HSZY172)和3份五虎散市售样品(WHS001、WHS002和WHS003)为研究对象,使用优化后的DNA提取方法提取中成药的总DNA,利用Illumina测序平台直接对5个样品的DNA进行shotgun测序。原始数据经Trimmonmatic去除接头和低质量序列、MEGAHIT和Meta SPAdes组装序列、Cutadapt软件去除引物,bowtie2短序列Mapping等生物信息学分析,获得ITS2、psb A-trn H、rbc L和mat K序列。将自制样品获得的组装序列与Sanger测序获得的参考序列进行比较以确定组装序列的准确性,利用自制样品考察shotgun metabarcoding的可行性,并将该方法用于市售样品中以验证方法的适用性。最终基于shotgun metabarcoding技术对中成药五虎散生物组分进行分析。结果:1.基于DNA barcoding技术五虎散原料药材参考序列获取:在形态学鉴定的基础上,使用DNA barcoding技术成功获取了除天南星的psb A-trn H片段和白芷的rbc L片段外,各处方成分及阳性对照药材的ITS2、psb Atrn H、mat K和rbc L片段的序列,经与《中国药典中药材DNA条形码标准序列》中相关标准序列复核,表明5种原料药材和西洋参药材均为正品,为保障后续自制样品的准确性奠定了基础,所获序列可作为参考序列使用。2.基于DNA metabarcoding技术中成药五虎散生物组分鉴定:经高通量测序两对引物获得的总pair-end数分别为564574和622926条。去除reads数shotgun metabarcoding技术中成药五虎散生物组分鉴定:5份样品共获得37.14 G的测序数据,共1421013条paired-end reads。经组装、注释,ITS2、psb A-trn H、mat K和rbc L区域分别获得80、11、9和8个OTU。基于4种DNA条形码序列,在2份自制样品中,所有处方成分的组装序列均成功获得,在HSZY172样品中获得到阳性对照西洋参的OTU,且组装序列准确度较高,表明该方法具有良好的重复性,准确性和灵敏性。在3份市售样品中,均可检测到处方成

关键词：五虎散原料药材 DNA条形码 DNA metabarcoding shotgun metabarcoding 生物组分物种鉴定

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基于叶绿体及线粒体基因组全长的中成药铁笛丸生物成分鉴定方法构建

基于叶绿体及线粒体基因组全长的中成药铁笛丸生物成分鉴定方法构...

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作者：张召雷承德医学院

学位级别：硕士

中成药的生物成分鉴定是中药鉴定中的一大难点。由于中成药原料药材的错误投料或虚假投料,严重损害了中成药的安全性、有效性和在国际市场的发展,因此,有必要采取更加有效的技术手段来解决中成药处方成分的物种鉴定问题,以确保中成药的... 详细信息

中成药的生物成分鉴定是中药鉴定中的一大难点。由于中成药原料药材的错误投料或虚假投料,严重损害了中成药的安全性、有效性和在国际市场的发展,因此,有必要采取更加有效的技术手段来解决中成药处方成分的物种鉴定问题,以确保中成药的安全性和有效性。铁笛丸对慢性咽炎有较好的临床疗效,是历史上的名验方。铁笛丸是由植物药(诃子肉、浙贝母、桔梗、麦冬、玄参、瓜蒌皮、青果、甘草)、动物药(凤凰衣)、和真菌药(茯苓)等10味中药制成的大蜜丸。目前2020版《中国药典》针对铁笛丸的鉴定只有7味药材的显微鉴定,以没食子酸和贝母素甲为对照的薄层色谱法和以检测甘草酸含量的高效液相色谱法。传统检测方法对于物种与成分的关系不能一一对应,且只能检测部分物种的成分,不能对全部处方成分鉴定。分子鉴定以遗传物质DNA为研究对象,不受药材形态结构和化学成分影响,准确性高,该技术已在中药材鉴定中广泛应用。基于DNA条形码鉴定的DNA metabarcoding技术和shotgun metabarcoding技术可对中成药的生物成分进行检测,但由于条形码序列长度短,片段变异位点少,存在对某些物种检不全的问题。随着研究进入基因组时代,叶绿体和线粒体全基因组作为“super barcode”具有丰富的遗传信息,其结构、基因顺序和基因含量比较保守等特点,可用于中成药全成分物种鉴定。因此本论文以中成药铁笛丸为例,建立10种原料药材及其近缘物种的叶绿体基因组及线粒体基因组数据库,通过shotgun测序,去除低质量数据,将reads mapping到叶绿体及线粒体基因组数据库,使用python脚本进行物种构成分析,尝试构建基于叶绿体及线粒体基因组全长的中成药铁笛丸生物成分鉴定方法,为中成药的鉴定提供新的方法,也为中成药在市场上的安全流通提供一种新的监管手段。目的:本研究以含有植物药、动物药及真菌药10种原料药材的铁笛丸为例,建立基于叶绿体及线粒体全长的中成药鉴定分析流程,并结合传统鉴定方法系统全面地对铁笛丸基原物种鉴定,从而为中成药提供更加全面的鉴定方法。方法:1.从药店收集铁笛丸中的诃子肉、浙贝母、茯苓、桔梗、麦冬、玄参、瓜蒌皮、青果、凤凰衣、甘草各药材饮片及阳性对照药材西洋参,根据《中国药典》进行形态学鉴定,之后提取各原料药材的DNA,植物药采用ITS2、psb A-trn H、mat K、rbc L 4种DNA条形码,动物药采用COI条形码扩增测序,去除引物后与NCBI的Gen Bank数据库比对,鉴定原料药材及对照药材的准确。2.按照2020版《中国药典》中铁笛丸组方规定在实验室制作2份自制样品并在其中1份加入西洋参药材粉末作阳性对照。收集不同批次的市售铁笛丸样品3份,采用传统鉴定方法检测。在生物显微镜下观察市售中成药铁笛丸粉末的7种显微特征。薄层色谱法(TLC)以没食子酸和贝母素甲作为对照品,通过层析观察市售样品与对照品的斑点位置和颜色。高效液相色谱法(HPLC)以甘草酸的含量为指标,对市售样品溶液和甘草酸对照品溶液在相同液相系统下进行含量检测。3.采用DNA提取试剂盒法中的提取步骤提取DNA,使用Illumina Nova Seq测序平台对这5个样本的DNA进行高通量测序。使用shotgun metabarcoding方法,从高通量数据集中生成了ITS2、psb A-trn H、mat K、rbc L和COI序列。每个条形码的Taxa通过blast分配给NCBI的Gen Bank库,对中成药中的正品物种精确鉴定。最后,使用Megan软件将中成药的物种组成进行可视化分析。4.通过公共数据库,整合现有的铁笛丸组方成分及近缘物种的叶绿体及线粒体基因组,构建铁笛丸组方成分及近缘物种的叶绿体及线粒体基因组数据库。基于mapping的策略分析叶绿体及线粒体基因组高通量数据鉴定铁笛丸的生物成分。通过数据库中的序列作为参考基因组,使用bowtie2 v2.***.4.3进行mapping,使用samtools v1.10计算测序深度和覆盖度。采用seqtk v1.3提取mapping到基因组的reads,统计数据。通过python脚本对mapping到的reads进行回溯到基因及基因间隔区。筛选可信度高的基因及基因间隔区,对物种构成分析。通过Megan v6.21对各样品的数据进行可视化分析,比较样品间的差异。结果:1.结合药材的形态特征对收集的中成药铁笛丸原料药材进行DNA条形码鉴定,确定各药材的准确性。原料药材的DNA条形码结果显示,除了茯苓和诃子肉由于含有多糖等成分且DNA降解的原因没有提取到DNA外,ITS2、psb A-trn H、mat K、rbc L和COI序列分别成功获得了麦冬、桔梗、玄参、浙贝母、青果、瓜蒌皮、甘草、凤凰衣及阳性对照药材西洋参的序列。经过与NCBI的Genbank数据库及《中国药典中药材DNA条形码标准序列》中标准序列比对,表明8种原料药材及阳性对照西洋参

关键词：铁笛丸 shotgun metabarcoding 叶绿体基因组线粒体基因组物种鉴定

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