基于DNA条形码技术的中成药五虎散生物组分鉴定研究

作     者：穆威杉 

作者单位：承德医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：刘金欣

授予年度：2022年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：五虎散 原料药材 DNA条形码 DNA metabarcoding shotgun metabarcoding 生物组分 物种鉴定 

摘      要：中成药多为复方制剂,化学成分复杂,原料药材经粉碎加工后鉴定难度增加,现有的传统中药鉴定方法在中成药原料错误投料及真菌杂质等外源污染物的监管方面仍具有一定挑战性。中成药五虎散5种原料药材中,同时包含3个伞形科物种,基于传统方法的鉴定难度增加,同时还包含有毒物种天南星。五虎散投料的准确性问题关系着其临床使用的疗效与安全,积极开展中成药五虎散生物组分鉴定的相关研究刻不容缓。目的:本研究以原粉入药的中成药五虎散为研究对象,基于DNA barcoding技术获取5种原料药材及阳性对照药材的参考序列。再通过DNA metabarcoding和shotgun metabarcoding两种方法,对中成药五虎散自制样品和市售样品的生物组分进行检测。旨在为中成药五虎散的生物组分鉴定提供不同的策略和技术手段,作为中成药传统鉴定方法的有效补充,形成更全面的生物组分鉴定体系。方法:1.收集五虎散的5种原料药材或基原植物以及阳性对照药材西洋参,首先采用形态学及性状鉴定方法对药材的真伪进行初步鉴定,并采用传统的Sanger测序技术对各药材进行DNA条形码分析,经与标准序列进行复查核对,确保药材基原的准确性,获取各药材ITS2、psb A-trn H、mat K和rbc L片段的参考序列。最终基于DNA barcoding技术保证五虎散各原料药材及阳性对照药材的准确性并获取参考序列。2.按中国药典五虎散项下的制备方法自制2份五虎散参考样品(HSZY160和HSZY172),其中HSZY172中加入与五虎散中最小入药量等量的西洋参作为阳性对照。从药店收集4份五虎散市售样品(WHS001、WHS002、WHS003和WHS004),使用优化后的DNA提取方法提取6份中成药的总DNA,基于ITS2片段选择MS2F/MS2R和MS3F/MS3R两对引物进行PCR扩增,利用Illumina Miseq测序平台进行高通量测序。经序列拼接、质控、过滤、去冗余、OTU聚类及BLAST比对等生物信息学分析,最终基于DNA metabarcoding技术对中成药五虎散的生物组分进行鉴定。3.以2份五虎散自制样品(HSZY160和HSZY172)和3份五虎散市售样品(WHS001、WHS002和WHS003)为研究对象,使用优化后的DNA提取方法提取中成药的总DNA,利用Illumina测序平台直接对5个样品的DNA进行shotgun测序。原始数据经Trimmonmatic去除接头和低质量序列、MEGAHIT和Meta SPAdes组装序列、Cutadapt软件去除引物,bowtie2短序列Mapping等生物信息学分析,获得ITS2、psb A-trn H、rbc L和mat K序列。将自制样品获得的组装序列与Sanger测序获得的参考序列进行比较以确定组装序列的准确性,利用自制样品考察shotgun metabarcoding的可行性,并将该方法用于市售样品中以验证方法的适用性。最终基于shotgun metabarcoding技术对中成药五虎散生物组分进行分析。结果:1.基于DNA barcoding技术五虎散原料药材参考序列获取:在形态学鉴定的基础上,使用DNA barcoding技术成功获取了除天南星的psb A-trn H片段和白芷的rbc L片段外,各处方成分及阳性对照药材的ITS2、psb Atrn H、mat K和rbc L片段的序列,经与《中国药典中药材DNA条形码标准序列》中相关标准序列复核,表明5种原料药材和西洋参药材均为正品,为保障后续自制样品的准确性奠定了基础,所获序列可作为参考序列使用。2.基于DNA metabarcoding技术中成药五虎散生物组分鉴定:经高通量测序两对引物获得的总pair-end数分别为564574和622926条。去除reads数10的序列后,两对引物最终获得25个和18个OTU。结合两对引物分析结果,在2份自制样品中成功获得除天南星外其余4种处方成分及阳性对照西洋参的OTU序列。4份市售样品中均可获得处方成分当归、防风、红花的OTU序列,均未检测到天南星的OTU序列,仅在2份市售样品(WHS003和WHS004)中检测到白芷的OTU序列。此外,市售样品中还检测出硬阿魏、田葛缕子、根霉菌等混伪品或外源污染物的存在。3.基于shotgun metabarcoding技术中成药五虎散生物组分鉴定:5份样品共获得37.14 G的测序数据,共1421013条paired-end reads。经组装、注释,ITS2、psb A-trn H、mat K和rbc L区域分别获得80、11、9和8个OTU。基于4种DNA条形码序列,在2份自制样品中,所有处方成分的组装序列均成功获得,在HSZY172样品中获得到阳性对照西洋参的OTU,且组