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一株PEDV广东流行株s1基因遗传进化分析及其在昆虫细胞中的表达纯化

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肇庆学院学报 2024年第2期45卷 16-21页

作者：刘郁夫林晓慧谭银娟冯美莹肇庆学院生命科学学院广东肇庆526061 华农(肇庆)生物产业技术研究院有限公司广东肇庆526238

为了解猪流行性腹泻病毒广东流行株的s1基因流行变异情况,制备相应的诊断试剂,试验采用RT-PCR从猪流行性腹泻疑似发病仔猪的肠道内容物中扩增获得s1基因,利用生物信息学软件构建s1基因的遗传进化树.将s1基因克隆至杆状病毒穿梭质粒pFast... 详细信息

为了解猪流行性腹泻病毒广东流行株的s1基因流行变异情况,制备相应的诊断试剂,试验采用RT-PCR从猪流行性腹泻疑似发病仔猪的肠道内容物中扩增获得s1基因,利用生物信息学软件构建s1基因的遗传进化树.将s1基因克隆至杆状病毒穿梭质粒pFastBac1,转化至DH10Bac感受态细胞中,经抗生素筛选重组杆粒,把重组杆粒转染到昆虫细胞sf9,盲传3代后进行间接免疫荧光试验和Western blot鉴定.结果表明:该猪流行性腹泻病毒广东流行株分布于GII-b分支,与国内猪流行性腹泻病毒分离株(HN-HB1-2018、HBHA2015)的核苷酸相似性为98.0%~98.3%,而与猪流行性腹泻病毒经典毒株CV777、DR13的核苷酸相似性仅为89.9%~90.0%.且s1重组蛋白可在昆虫细胞sf9中以细胞培养分泌上清的形式表达.本研究可为猪流行性腹泻病毒的流行现状研究提供参考,以及后续猪流行性腹泻病毒诊断制品的研发提供前期基础.

关键词：猪流行性腹泻病毒 s1基因遗传进化昆虫细胞

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s1基因结构解析与分子进化分析

分子植物育种 2019年第2期17卷 458-465页

作者：马生健刘耀光岭南师范学院生命科学与技术学院湛江524048 华南农业大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室广州510642

s1是水稻(Oryza sativa L.)亚非栽培稻种间杂种不育一个最重要的基因座,对杂种的雌雄配子都有选择性杀灭作用。前期我们通过图位克隆获得s1基因座的候选基因后,NCBI查找发现‘日本晴’的s1等位基因序列全长7 kb,局倍区域有高GC分布。为... 详细信息

s1是水稻(Oryza sativa L.)亚非栽培稻种间杂种不育一个最重要的基因座,对杂种的雌雄配子都有选择性杀灭作用。前期我们通过图位克隆获得s1基因座的候选基因后,NCBI查找发现‘日本晴’的s1等位基因序列全长7 kb,局倍区域有高GC分布。为此本研究通过分多段运用有针对性的PCR方法,对所用的材料IRAT216与IRAT216s1进行了扩增并测序,获得了各自的s1全长序列,并进行了比对,发现IRAT216与‘日本晴’的序列完全相同,但IRAT216与IRAT216s1之间存在多处变异。同时针对有效变异区对s1基因进行了分子进化调查,建立了水稻的分子进化树,确定了s1在物种进化中的意义。本研究的s1基因序列测定,将为水稻分子标记辅助育种中分子标记的开发提供序列参照,同时也将为s1基因RNA的表达分析与蛋白功能研究、在各物种中的分化变异和水稻在进化中地位划分提供理论依据,并能为水稻的起源研究提供参考。

关键词：栽培稻杂种不育分子进化 s1基因

减毒沙门氏菌介导的小鼠肝炎病毒s1基因DNA疫苗的免疫特性分析

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微生物学报 2007年第1期47卷 131-135页

作者：焦红梅焦新安殷月兰潘志明孟松树王禹蒋金金扬州大学生物科学与技术学院江苏省人兽共患病学重点实验室扬州225009 不详

根据GenBank公开序列自行设计一对引物,通过RT-PCR扩增出小鼠肝炎病毒的全长s1基因,并将其插入真核表达质粒pVAX1中,构建出重组真核表达质粒pVAX1-s1。将重组质粒转染COs-7细胞,采用间接免疫荧光检测出s1蛋白的体外表达。将重组质粒转... 详细信息

根据GenBank公开序列自行设计一对引物,通过RT-PCR扩增出小鼠肝炎病毒的全长s1基因,并将其插入真核表达质粒pVAX1中,构建出重组真核表达质粒pVAX1-s1。将重组质粒转染COs-7细胞,采用间接免疫荧光检测出s1蛋白的体外表达。将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌sL7207中,构建出运送DNA疫苗的重组沙门氏菌sL7207(pVAX1-s1)。分别以5×108CFU、1×109CFU、2×109CFU剂量的重组菌口服接种6周龄BALB/c小鼠,试验结果表明,重组菌对小鼠具有良好的安全性。以1×109CFU剂量的重组菌口服免疫小鼠,抗体检测结果显示,在二免后两周和三免后两周,重组菌免疫组的血清抗体水平与sL7207(pVAX1)空载体免疫组间分别存在显著性差异(P<0.05)和极显著性差异(P<0.01)。在三免后两周重组菌免疫组出现了较高水平的肠黏膜抗体。

关键词：小鼠肝炎病毒 s1基因减毒沙门氏菌安全性免疫特性

s1基因真核表达载体的构建及农杆菌转化水稻的初步研究

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S1基因真核表达载体的构建及农杆菌转化水稻的初步研究

作者：王法军首都师范大学

学位级别：硕士

水稻(Oryza sativa)病毒病害能够造成水稻的减产与品质下降,给粮食生产造成了巨大的经济损失。以往传统的防治水稻病毒病害的方法如喷洒农药等往往会造成环境及食品的污染,且效果也不能持久,而传统的育种方式也很难满足生产的需要。目前... 详细信息

水稻(Oryza sativa)病毒病害能够造成水稻的减产与品质下降,给粮食生产造成了巨大的经济损失。以往传统的防治水稻病毒病害的方法如喷洒农药等往往会造成环境及食品的污染,且效果也不能持久,而传统的育种方式也很难满足生产的需要。目前,利用基因工程手段培育抗病毒的水稻品种成为病毒病防治主要手段之一。水稻条纹叶枯病是危害水稻的一种主要的病害,是由水稻条纹病毒(RsV)引起,由灰飞虱传播的虫媒病毒。在世界各地和我国都有过多次反复大的危害。而水稻的栽培品种中的两个亚种对RsV表现出不同的抵抗性。一个亚种为*** ***,品质优良抗病性差;另一个亚种是*** ***,品质差抗病性强。实验发现Indica品种的粗分离物中有高活性的抑制RsV合成的抗性因子,经盐析、疏水及离子交换层析等分离,得到的组分仍然有高的抑制活性。本实验从具有抗RsV的Indica系水稻品种中分离得到一条与抗RsV复制相关的蛋白条带,通过对该蛋白的末端进行分析,用PCR扩增和人工合成得到该蛋白的基因,命名为s1,对s1进行研究发现,它编码一个未知蛋白,含有8个内含子,序列中含有叶绿体转运肽。为了进一步研究s1编码蛋白(s1)的功能,通过基因工程技术,将s1基因克隆到酵母表达载体pYEs2/CT中,并成功在酵母表达体系中得到正确蛋白表达,为研究s1蛋白的功能提供了条件。同时,将s1基因与pCAMBIA1302载体连接并转化入农杆菌***4404,通过农杆菌介导的遗传转化体系将s1基因转入水稻(Oryza stiva L),得到大量抗性愈伤和转基因分化苗,并且初步进行了PCR验证。抗性转基因苗的得到,为选育抗病毒水稻品种奠定了基础,为水稻抗病毒基因工程的研究提供了一次新的探索。此外,本实验还利用洋葱表皮细胞对s1基因进行了初步的亚细胞定位,发现该基因定位于细胞核。

关键词：抗性基因 s1基因基因工程酵母表达遗传转化亚细胞定位

猪丁型冠状病毒s1基因的克隆、原核表达及多克隆抗体制备

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畜牧兽医学报 2018年第6期49卷 1256-1264页

作者：李成张雨迪黄小波刘浩宇刘志鹏赵玉佳曹三杰文心田文翼平赵勤伍锐四川农业大学动物医学院猪病研究中心成都611130

本研究旨在克隆猪丁型冠状病毒(PDCoV)s1基因(1—1 566bp),体外表达s1基因抗原表位预测区sa(106—1 290bp)蛋白并制备抗该蛋白质的多克隆抗体。运用生物信息学软件分析s1核苷酸和编码氨基酸序列特征,将s1基因抗原表位预测区sa克隆至原... 详细信息

本研究旨在克隆猪丁型冠状病毒(PDCoV)s1基因(1—1 566bp),体外表达s1基因抗原表位预测区sa(106—1 290bp)蛋白并制备抗该蛋白质的多克隆抗体。运用生物信息学软件分析s1核苷酸和编码氨基酸序列特征,将s1基因抗原表位预测区sa克隆至原核表达载体pET22b(+),构建重组表达载体pET22b-sa,转化Rosetta(DE3)菌株,IPTG诱导表达、超滤柱浓缩纯化重组蛋白、Ni柱亲和层析,Western blot检测sa蛋白的活性,将sa蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结果表明,CHN-2015毒株s1基因开放型阅读框大小为1 566bp(GenBank ***398009),编码522个氨基酸,是具有亲水性的非跨膜蛋白,存在15个潜在的B细胞抗原表位;原核表达sa重组蛋白,该蛋白质在37℃下用终浓度为0.8mmol·L^(-1)IPTG诱导5h后,蛋白质主要以可溶性形式存在,免疫印迹显示表达的sa蛋白在上清与包涵体中都有良好的反应性;用纯化的sa蛋白四次免疫家兔,获得的兔抗sa蛋白抗体效价可达1∶10 240。本研究克隆了s1基因,原核表达了sa蛋白和制备了高效价的兔抗sa蛋白抗体,具有良好的免疫原性,为后续深入开展s蛋白的功能研究奠定了基础。

关键词：猪丁型冠状病毒 s1基因克隆原核表达抗原性多克隆抗体

2010—2013年我国鸡传染性支气管炎病毒分离株s1基因分子特性分析

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中国农业大学学报 2015年第2期20卷 137-148页

作者：尤永君张国中刘月焕梁武王腾刘兴彩沈元王友中国农业大学动物医学院北京100193 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193 天津瑞普生物技术股份有限公司技术服务部天津300308

为掌握近年来我国传染性支气管炎病毒的流行动态和变化规律,利用检测转化至克隆载体鸡传染性支气管炎病毒（IBV）s1基因序列,应用MEGA5分析软件进行聚类分析,并对瑞普生物疫病诊断研究服务中心2010—2013年间从我国野外分离并测定的30... 详细信息

为掌握近年来我国传染性支气管炎病毒的流行动态和变化规律,利用检测转化至克隆载体鸡传染性支气管炎病毒（IBV）s1基因序列,应用MEGA5分析软件进行聚类分析,并对瑞普生物疫病诊断研究服务中心2010—2013年间从我国野外分离并测定的30株传染性支气管炎的s1基因序列与常用疫苗毒株和GenBank中代表性IBV毒株的对应基因序列进行比较,结果发现：1）30株野外分离株可分为2个基因型：LX4型和TW型,分别占总数的93.3%和6.7%;2）LX4型分离株s1基因和氨基酸序列与常见疫苗毒株序列差别很大,同源性仅分别为77.6%~86.3%和75.8%~85.7%;3）分析s基因裂解位点时发现同一基因型毒株的裂解位点氨基酸序列高度趋同,且型间差异性较大。可见,近年来我国主要IBV分离株属于LX4型,并且彼此间亲缘关系较近,与我国现用传染性支气管炎主要弱毒疫苗和国外参考株属于不同的基因型,这可能是导致疫苗免疫失败,传染性支气管炎（IB）在鸡群中爆发的主要原因。该研究结果为筛选针对我国目前流行IBV毒株的疫苗株提供参考。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒 s1基因基因型裂解位点分子特征

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传染性支气管炎病毒s1基因的遗传多样性

华北农学报 2010年第5期25卷 61-67页

作者：曲新泽袁小远王友令徐怀英秦卓明姜世金山东农业大学动物科技学院山东泰安271018 山东农业科学院家禽研究所山东济南250023

为全面分析传染性支气管炎(IBV)流行株s1基因的遗传变异,结合1992-2008年间从山东乃至全国分离鉴定的IBV毒株,在进行抗原性研究的基础上,对17株IBV毒株分别进行了s1基因的克隆测序,并与GenBank中具有代表性的参考株进行同源比较,同时对... 详细信息

为全面分析传染性支气管炎(IBV)流行株s1基因的遗传变异,结合1992-2008年间从山东乃至全国分离鉴定的IBV毒株,在进行抗原性研究的基础上,对17株IBV毒株分别进行了s1基因的克隆测序,并与GenBank中具有代表性的参考株进行同源比较,同时对其高变区HVRⅠ氨基酸基序进行分析。根据系统发育树,结合病毒发生的年代、地域和临床病理,将58株IBV国内外毒株初步分为6个基因型,其中,国内流行株主要涵盖5种基因型,大部分流行株属于基因Ⅴ型(北方株为主)和基因Ⅳ型(南方株为主),两种类型毒株相互交织,呈现复杂的流行形式。对IBV高变区HVRⅠ氨基酸基序分析表明,多数毒株存在不同程度的点突变,尚有4株分离株在33位和34位之间有氨基酸残基的插入。s1基因的遗传变异具有多样性,与常规疫苗株和国外参考株相比,无论是核苷酸还是氨基酸均发生了较大的变异。不同IBV毒株s1基因片段与其全长之间遗传变异高度相关(r=0.968),但IBV流行株与疫苗株的遗传距离愈来愈远,彰显出IBV流行株在H120的免疫压力下,已经发生了较大程度的变异。

关键词：传染性支气管炎病毒遗传变异 s1基因基因分型

两株禽源野生动物冠状病毒分离株s1基因特性的研究

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中国预防兽医学报 2005年第5期27卷 380-384页

作者：付家栋张桂红廖明任涛辛朝安华南农业大学兽医学院广州510640

本研究从野生禽类动物孔雀和鹧鸪的喉气管拭子中各分离到1株冠状病毒,经RT_PCR检测成功扩增出s1基测序后和GenBank上报道序列进行同源性比较以及系统发育树分析,发现这两株病毒和鸡传染性支气管炎病毒存在密切的亲源关系。

关键词：离野生动物冠状病毒 s1基因

鸡传染性支气管炎病毒sC株s1基因的序列分析

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中国兽医科技 2003年第12期33卷 47-50页

作者：刘洪义刘兴友西南科技大学四川绵阳621000 郑州牧业工程高等专科学校河南郑州450011

用RT PCR扩增了鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)sC株s1基因 ,连接到 pMD 18 T载体上 ,克隆后进行了核酸序列分析 ,证实sC株s1基因与基因库中收录的国外毒株H12 0和M 4 1的同源性较低 ,分别为 81.1%和 80 .0 % ,而与国内JX990 1株的同源性达... 详细信息

用RT PCR扩增了鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)sC株s1基因 ,连接到 pMD 18 T载体上 ,克隆后进行了核酸序列分析 ,证实sC株s1基因与基因库中收录的国外毒株H12 0和M 4 1的同源性较低 ,分别为 81.1%和 80 .0 % ,而与国内JX990 1株的同源性达到 91.3% ,初步证实国内存在IBV新毒株。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒 sC株 s1基因序列分析