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rnc基因调控粪肠球菌生物膜表型的研究

rnc基因调控粪肠球菌生物膜表型的研究

作者：卓妮娅四川大学

学位级别：硕士

粪肠球菌常存在于难治性根尖周炎的病变中,被证实与根管治疗失败和根尖肿胀有关。粪肠球菌的重要毒力因子之一是其包裹细菌体的生物膜,胞外多糖(extracellular polysaccharide,EPS)为生物膜基质的主要成分。粪肠球菌细菌本身的结构和特... 详细信息

粪肠球菌常存在于难治性根尖周炎的病变中,被证实与根管治疗失败和根尖肿胀有关。粪肠球菌的重要毒力因子之一是其包裹细菌体的生物膜,胞外多糖(extracellular polysaccharide,EPS)为生物膜基质的主要成分。粪肠球菌细菌本身的结构和特性使其具有天然和获得性耐药能力,也造成粪肠球菌在根管系统中难以用常规药物彻底清除,现有的根管冲洗药物在生物安全性及牙体组织机械性能等方面存在一定局限。近年来中医中药的发展拓展口腔疾病治疗领域,蒲公英、防风、五倍子、没食子等中药及其复方制剂被证实针对粪肠球菌有抗菌抗炎等效果,是有潜力的根管冲洗药物。粪肠球菌中具有的双组分信号转导系统Wal RK,在生物膜的胞外多糖合成及细菌耐药能力中具有重要作用,与该系统位于同一转录子内编码RNase III的rnc基因,于多种原核生物中在转录后水平调控基因表达。本课题分别导入重组质粒构建粪肠球菌rnc基因过表达株和低表达株,比较其生长情况、生物膜表型、结构和产生量,评估rnc基因突变株对根管冲洗药物作用的生物学效应,验证rnc基因对粪肠球菌生物膜表型的影响,以期为难治性根尖周炎治疗提供理论依据和基础。目的:1.构建粪肠球菌rnc基因过表达株和低表达株2.研究rnc基因对粪肠球菌生长能力、生物膜表观、结构及生物膜产生等方面的影响3.探索粪肠球菌rnc基因突变株针对不同根管冲洗药物作用时的药物敏感性及生物膜消除能力方法:1.将携带rnc基因序列或rnc基因反义RNA序列的质粒分别导入粪肠球菌标准株ATCC29212,通过RT-q PCR(real time polymerase chain reaction)检测rnc基因的表达,经测序验证粪肠球菌rnc基因低表达株及rnc基因高表达株是否成功构建。2.绘制12小时生长曲线描述粪肠球菌ATCC29212及rnc基因低表达株/过表达株的生长情况;扫描电镜下观察粪肠球菌各菌株24小时生物膜形貌;激光共聚焦显微镜下观察各菌株生物膜结构,计算胞外多糖/细菌灰度比值并比较;结晶紫染色分析各菌株生物膜形成水平。3.将不同药物处理后的生物膜样本通过菌落计数方法比较粪肠球菌ATCC29212及rnc基因低表达株/过表达株对各组药物敏感性的差别;通过结晶紫染色的方法比较药物对生物膜的消除作用。结果:***-q PCR结果显示成功构建rnc基因高表达株及rnc低表达株(p基因低表达细菌生长受到抑制,扫描电镜下rnc低表达株形成更脆弱稀薄的生物膜;激光共聚焦显微镜观察生物膜更不密实且缺乏均质性,胞外多糖含量较ATCC29212少,胞外多糖/细菌比值低(prnc基因低表达株/过表达株均有一定杀菌作用,其中rnc基因突变株较ATCC29212对中药制剂(百药煎、防风、蒲公英)更加敏感。综上所述,rnc基因的缺失影响粪肠球菌胞外多糖代谢,使粪肠球菌生物膜结构和组成发生变化,产生更为脆弱的生物膜,同时影响粪肠球菌的生长情况和药物敏感性,使药物对其杀灭作用更强,其中中药制剂十分具有潜力,但仍需在消除生物膜方面进一步探索,以上结论有助于为治疗难治性根尖周炎提供新的探索方向及理论依据。

关键词：粪肠球菌生物膜 rnc基因胞外多糖难治性根尖周炎

rnc基因调控变形链球菌蔗糖依赖性黏附能力的机制研究

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临床口腔医学杂志 2018年第5期34卷 259-262页

作者：张茹雷蕾杨英明胡涛首都医科大学附属北京口腔医院牙体牙髓科北京100050 口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院口腔预防科四川成都610041

目的:探讨rnc基因缺失后变形链球菌蔗糖依赖性黏附能力的改变,并分析其在细菌生物膜早期黏附中的作用机制。方法:采用PCR连接诱变法构建变形链球菌rnc基因缺失突变株,通过蔗糖依赖性黏附实验对比变形链球菌rnc基因缺失突变菌株和标准株U... 详细信息

目的:探讨rnc基因缺失后变形链球菌蔗糖依赖性黏附能力的改变,并分析其在细菌生物膜早期黏附中的作用机制。方法:采用PCR连接诱变法构建变形链球菌rnc基因缺失突变株,通过蔗糖依赖性黏附实验对比变形链球菌rnc基因缺失突变菌株和标准株UA159的黏附能力;RT-q PCR验证rnc缺失后变形链球菌蔗糖依赖性黏附相关基因的表达水平差异。结果:rnc缺失突变株蔗糖依赖性黏附能力及生物膜成膜能力较变形链球菌UA159降低;rnc缺失后蔗糖依赖性黏附相关调控基因gbp B,gtf B,gtf D,dex A显著上调,而gbp C、gbp D显著下调。结论:rnc缺失影响蔗糖依赖性黏附相关基因的表达,降低了变形链球菌蔗糖依赖性黏附能力,影响其致龋性。

关键词：变形链球菌 rnc基因蔗糖依赖性黏附生物膜

rnc基因调节变异链球菌环境耐受性及其机制研究

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口腔疾病防治 2018年第8期26卷 504-507页

作者：张茹雷蕾杨英明胡涛首都医科大学附属北京口腔医院牙体牙髓科北京100050 四川大学华西口腔医院口腔预防科口腔疾病研究国家重点实验室四川成都610041

目的 rnc基因敲除后,观察变异链球菌的耐酸、耐氧化、耐高渗透压性能的改变及其可能的调节机制。方法通过长链PCR连接诱变技术,构建rnc基因缺失突变株,分别对比突变菌株与野生菌株对氧化环境、酸性环境及高渗透压环境的耐受能力;采用rea... 详细信息

目的 rnc基因敲除后,观察变异链球菌的耐酸、耐氧化、耐高渗透压性能的改变及其可能的调节机制。方法通过长链PCR连接诱变技术,构建rnc基因缺失突变株,分别对比突变菌株与野生菌株对氧化环境、酸性环境及高渗透压环境的耐受能力;采用real-time RT-PCR验证rnc缺失后变异链球菌环境耐受相关基因的转录水平表达变化。结果 rnc基因缺失后,变异链球菌的耐酸性(c2=13.464,P=0.001)及耐氧化性(c2=4.505,P=0.048)较野生菌株显著下降,但耐高渗透压性显著增加(c2=11.971,P=0.001)。环境耐受相关基因lux S与rop A的表达水平显著下调(Prnc基因缺失影响变异链球菌环境耐受相关基因的表达,降低了变异链球菌耐酸、耐氧化能力,增强了对高渗透压的耐受能力。

关键词：变异链球菌 rnc基因耐酸性氧化应激环境耐受性

变异链球菌rnc基因有效防治龋病的机制和应用研究

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变异链球菌rnc基因有效防治龋病的机制和应用研究

中华口腔医学会第十一次全国牙体牙髓病学学术大会

作者：胡涛雷蕾杨英明毛梦莹口腔疾病研究国家重点实验室四川大学华西口腔医院口腔预防科/牙体牙髓科

目的:胞外多糖是变异链球菌最重要的致龋毒力因子,变异链球菌rnc基因与细菌生物膜胞外多糖代谢、致龋力以及RNA转录后调控密切相关。本课题系列研究围绕变异链球菌rnc基因,拟从多个层面消解调控胞外多糖从而达到控制牙菌斑、防治龋病发... 详细信息

目的:胞外多糖是变异链球菌最重要的致龋毒力因子,变异链球菌rnc基因与细菌生物膜胞外多糖代谢、致龋力以及RNA转录后调控密切相关。本课题系列研究围绕变异链球菌rnc基因,拟从多个层面消解调控胞外多糖从而达到控制牙菌斑、防治龋病发生的目的。方法:构建变异链球菌rnc基因缺失株,渗透凝胶色谱以及全水解乙酰化测定生物膜细菌胞外多糖小分子单糖组份比例;重组表达rnc基因编码核酸内切酶RNaseⅢ,初步探究RNaseⅢ的酶活性;rnc基因可依赖msRNAs对VicRKX转录体系进行调控,进一步利用T4-RNA连接酶体系研究具有发卡结构msRNAs与vicR 5’UTR区域的结合关系,进而对于胞外多糖代谢的调控效应。结果:小分子单糖组份比例结果示rnc基因缺失株葡萄糖单糖含量显著降低,提示多糖分子内部连接方式的改变从而影响多糖结构;重组表达编码核酸内切酶RNaseⅢ,具有降解RNA活性;"嵌合物"实验首次验证msRNA与vicR 5’UTR区域结合,抑制vicR基因转录从而发挥对胞外多糖调节作用。结论:本研究提示以rnc基因为靶点,通过多层面改建胞外多糖结构/组分为消解牙菌斑生物膜以及龋病防治提供理论依据和新思路。

关键词：变异链球菌胞外多糖 rnc基因转录后调控 T4 ligase

来源： cnki会议评论

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大肠杆菌中rnc与era基因的共表达

生物化学杂志 1991年第5期7卷 518-524页

作者：陈苏民 Donald L.Cort 第四军医大学生物化学教研室西安710033 Laboratory of Chromosome Biology NIH/NCI-FCRF-BRIFrederick Maryland USA

rnc,era基因是大肠杆菌两个相邻的基因。用S_1核酸酶图谱法测得转录从rnc基因伸延到era基因。当rnc基因突变使所产生的RNaseⅢ丧失活性时,大肠杆菌中RNaseⅢ和Era蛋白的合成速度同对上升,且上升幅度相同,合成量相等。将此二基因分别或... 详细信息

rnc,era基因是大肠杆菌两个相邻的基因。用S_1核酸酶图谱法测得转录从rnc基因伸延到era基因。当rnc基因突变使所产生的RNaseⅢ丧失活性时,大肠杆菌中RNaseⅢ和Era蛋白的合成速度同对上升,且上升幅度相同,合成量相等。将此二基因分别或一起克隆入质粒并置于P_L起动子下游时,rnc能表达产生RNaseⅢ;rnc-era能表达产生RNaseⅢ和Era两种蛋白质,单独era则虽能转录却不产生Era蛋白。实验证明:era基因的表达依赖于rnc基因的表达,在体内两者共表达体现在转录和翻译水平上,两个基因同属于一个操纵子,共同受RNaseⅢ活性的反馈调节。单独转录的era-mRNA因缺乏有效的翻译起始序列而不能被翻译。

关键词： rnc基因 erd基因基因表达