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真核表达载体pcdna3.1(+)TPA的建立及其在人皮肤成纤维细胞的表达活性(英文)

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中南大学学报（医学版） 2005年第4期30卷 373-378页

作者：邓洪波杨宇杨进福唐滔周文武刘剑中南大学湘雅二医院老年病科长沙410011 中南大学湘雅二医院胸心外科长沙410011

目的:建立在人皮肤成纤维细胞中稳定表达的细胞株,为组织型纤溶酶原激活因子(TPA)功能分析和对缺血性心脏疾病基因治疗提供理论依据。方法:构建真核表达载体pcdna3.1(+)TPA,然后将其转入人皮肤成纤维细胞,经G418筛选后,用RT-PCR,ELISA... 详细信息

目的:建立在人皮肤成纤维细胞中稳定表达的细胞株,为组织型纤溶酶原激活因子(TPA)功能分析和对缺血性心脏疾病基因治疗提供理论依据。方法:构建真核表达载体pcdna3.1(+)TPA,然后将其转入人皮肤成纤维细胞,经G418筛选后,用RT-PCR,ELISA和发色底物法观察外源性TPA表达情况。结果:真核表达载体pcdna3.1(+)TPA在人皮肤成纤维细胞中获有效表达,酶联免疫吸附法TPA蛋白表达定量检测结果为每24小时643.5ng/106个细胞,高于未转pcdna3.1(+)TPA的皮肤成纤维细胞每24小时19.2ng/106个细胞;发色底物法测得外源性TPA活性为每24小时122.6U/106个细胞,亦高于未转pcdna3.1(+)TPA的皮肤成纤维细胞每24小时5.8U/106个细胞。结论:pcdna3.1(+)TPA转入人皮肤成纤维细胞后,外源性TPA基因获有效表达,该细胞模型将成为TPA功能研究和缺血性心脏病基因治疗的重要方法。

关键词：组织型纤溶酶原激活因子基因治疗 pcdna3.1 皮肤成纤维细胞缺血性心脏病

pcdna3.1（＋）-增强型绿色荧光蛋白在大鼠鞘内注射的表达

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解剖学杂志 2009年第3期32卷 339-341页

作者：徐玉英曹靖任秀花赵青赞臧卫东郑州大学基础医学院解剖学教研室河南郑州450052

目的：构建重组质粒pcdna3.1（＋）-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）并观察其存大鼠体内的转染部位及表达时间。方法：构建重组质粒pcdna3.1（＋）-增强型绿色荧光蛋白后直接注射到正常大鼠的蛛网膜下腔，观察其存大鼠体内转染后的时空效应... 详细信息

目的：构建重组质粒pcdna3.1（＋）-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）并观察其存大鼠体内的转染部位及表达时间。方法：构建重组质粒pcdna3.1（＋）-增强型绿色荧光蛋白后直接注射到正常大鼠的蛛网膜下腔，观察其存大鼠体内转染后的时空效应。结果：双酶切结果符合真核表达载体pcdna3.1（＋）约5.4kb，EGFP约750bp，另外测序分析与文献报道结果完全一致；动物实验结果表明，鞘内注射24h后存大鼠的脑脊膜和脊神经的外膜上有EGFP表达，在14d达到高峰，4周后明显下降，第7周消失；在实验组大鼠的心、肝、脾、肺、肾及股四头肌均没有绿色荧光。对照组所有取材部位均没有绿色荧光。结论：重组质粒pcdna3.1（＋）-EGFP通过直接注射法被成功转染至大鼠的蛛网膜下腔，且外源基因得到了表达。

关键词：鞘内注射增强型绿色荧光蛋白真核表达 pcdna3.1

pcdna3.1-mAFP真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

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中国现代医学杂志 2007年第9期17卷 1059-1061页

作者：匡志鹏谢裕安梁安民罗小玲吴继宁广西医科大学附属肿瘤医院生物医学研究中心广西南宁530021

目的构建真核表达载体pcdna3.1-mAFP,观察其在293肿瘤细胞中的表达情况。方法从Hepa1-6小鼠肝癌细胞中提取总RNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增小鼠甲胎蛋白(mAFP)基因编码区全长序列,测序确认后,插入到pcdna3.1真核表达载体中,双酶... 详细信息

目的构建真核表达载体pcdna3.1-mAFP,观察其在293肿瘤细胞中的表达情况。方法从Hepa1-6小鼠肝癌细胞中提取总RNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增小鼠甲胎蛋白(mAFP)基因编码区全长序列,测序确认后,插入到pcdna3.1真核表达载体中,双酶切鉴定。用Lipofectamine脂质体将构建的重组载体转染293肿瘤细胞,检测AFP蛋白在293细胞中的表达情况。结果成功克隆了mAFP基因编码区全长序列,构建出重组真核表达载体pcdna3.1-mAFP,脂质体转染后可检测到mAFP基因在293细胞中的表达。结论该研究成功构建了重组pcdna3.1-mAFP真核表达载体,为进一步开展原发性肝癌的靶向性基因治疗奠定了基础。

关键词：小鼠甲胎蛋白重组真核表达载体 pcdna3.1 原发性肝癌

pcdna3.1/eIF5A真核表达载体的构建及其在真核细胞CCRF-CEM中的表达

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中国新药杂志 2007年第7期16卷 527-531页

作者：朱金武钱之玉关勇彪中国药科大学药理教研室南京210009 军事医学科学院毒物药物研究所北京100850

目的:摸索真核细胞翻译启动因子5A(eIF5A)编码基因的合成、pcdna3.1/eIF5A真核表达载体的构建及其在真核细胞CCRF-CEM中的表达。方法:用PCR合成eIF5A基因,将基因分别接在克隆载体pMD 18-T的EcoRⅤ多克隆位点上和真核表达载体pcdna3.1的H... 详细信息

目的:摸索真核细胞翻译启动因子5A(eIF5A)编码基因的合成、pcdna3.1/eIF5A真核表达载体的构建及其在真核细胞CCRF-CEM中的表达。方法:用PCR合成eIF5A基因,将基因分别接在克隆载体pMD 18-T的EcoRⅤ多克隆位点上和真核表达载体pcdna3.1的HindⅢ和EcoRⅠ的多克隆位点之间,构建eIF5A基因的克隆载体和真核表达载体,分别在大肠杆菌***5α中转化并提取质粒,将真核表达载体pcdna3.1/eIF5A的质粒提取后,用脂质体包合并转染真核细胞CCRF-CEM,用流式细胞仪对eIF5A的表达水平进行检测。结果:eIF5A在CCRF-CEM细胞中的表达水平为107.03,eIF5A在转染细胞CCRF-CEM/trans中的表达水平为114.27,表达升高。结论:本实验构建了pcdna3.1/eIF5A真核表达载体,发现其在CCRF-CEM细胞中高表达。本实验结果将有助于探讨肿瘤治疗过程中的新靶标。

关键词：真核细胞翻译启动因子5A(eIF5A) pcdna3.1 克隆表达载体真核表达载体

pcdna3.1载体对内参基因表达影响分析

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重庆医科大学学报 2010年第6期35卷 816-818页

作者：陈可王增产重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室重庆400016

目的:研究转染质粒pcdna3.1对内参基因表达影响差别,为今后在采用pcdna3.1载体进行表达分析时内参基因的选择提供参考。方法:选用HepG2、HEK293、Hela、A549、QGY共5种细胞转染pcdna3.1空载体质粒,转染后48h提取细胞总RNA荧光定量PCR法... 详细信息

目的:研究转染质粒pcdna3.1对内参基因表达影响差别,为今后在采用pcdna3.1载体进行表达分析时内参基因的选择提供参考。方法:选用HepG2、HEK293、Hela、A549、QGY共5种细胞转染pcdna3.1空载体质粒,转染后48h提取细胞总RNA荧光定量PCR法比较内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphste dehydrogenase,GAPDH)、肌动蛋白(β-actin)、18sRNA表达水平差异,提取细胞总蛋白,检测GAPDH、β-actin表达水平差异。结果:5种细胞在转染质粒pcdna3.1后,内参基因转录和蛋白表达均出现不同程度的下降,其中以β-actin下降最为明显,GAPDH及18sRNA在转录水平下降幅度小,且下降程度接近。结论:pcdna3.1质粒转染造成基因表达非特异性抑制,其中对管家基因β-actin影响较大,因此在应用pcdna3.1来源载体进行基因功能分析时,不推荐使用β-actin作为内参基因。

关键词： pcdna3.1 内参基因转染转录表达

pcdna3.1-Osx真核表达质粒的构建和鉴定

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pcDNA3.1-Osx真核表达质粒的构建和鉴定

作者：饶燕刚四川大学

学位级别：硕士

颌面部骨缺损修复重建是涉及多学科理论和技术的临床难题，颌面部骨缺损常由肿瘤、外伤或者感染引起，并严重影响患者的心理和生理健康。目前颌面部骨缺损的修复主要是应用自体骨、异体骨移植或者生物材料植入，这些方法各有其自身的缺... 详细信息

颌面部骨缺损修复重建是涉及多学科理论和技术的临床难题，颌面部骨缺损常由肿瘤、外伤或者感染引起，并严重影响患者的心理和生理健康。目前颌面部骨缺损的修复主要是应用自体骨、异体骨移植或者生物材料植入，这些方法各有其自身的缺点，如：供区功能障碍、免疫排斥、潜在传染病风险或组织相容性等问题。组织工程学研究的发展以及基因技术的研究的深入为颌面部骨缺损的修复重建提供了一条新途径，利用基因工程和组织工程技术实现组织和器官的再生已成为可能。在骨组织工程研究中，种子细胞是其关键问题。理想的种子细胞应具有较好地成骨活性，或能够定向分化为成骨细胞，因此，对骨髓基质细胞等种子细胞进行基因修饰，促使其定向分化为成骨细胞，就具有重要的理论意义和迫切的实践意义。因此，本实验将原核载体中的成骨分化基因osterix分离鉴定，并与pcdna3.1构建真核表达载体，并进行鉴定。首先，对原核质粒中的目的基因进行分离鉴定;然后，利用亚克隆技术构建真核表达质粒，利用电泳及基因测序的方法鉴定构建的真核表达质粒;最后，将基因测序结果进行同源性比对。研究结果显示：成功构建pcdna3.1-Osx真核表达质粒，为进一步研究奠定方法学基础。

关键词： Osterix(Osx) 载体构建 pcdna3.1

Notch1基因C端特征结构域pcdna3.1-AN真核表达载体的构建

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郑州大学学报（医学版） 2007年第2期42卷 228-230页

作者：鲁照明王莉莉张爱琴许培荣刘红涛薛乐勋郑州大学细胞生物学研究室郑州大学第一附属医院郑州450052 河南省中医学院第一附属医院检验科郑州450000

目的:扩增人胎盘组织Notch1基因C端特征性结构域ANK和NLS(简称AN),并构建pcdna3.1-AN真核表达载体。方法:按照GenBank中Notch1序列,设计一对引物,利用RT-PCR方法从人胎盘组织中获取ANcDNA片段,将其克隆至真核表达质粒pcdna3.1(+)中,构... 详细信息

目的:扩增人胎盘组织Notch1基因C端特征性结构域ANK和NLS(简称AN),并构建pcdna3.1-AN真核表达载体。方法:按照GenBank中Notch1序列,设计一对引物,利用RT-PCR方法从人胎盘组织中获取ANcDNA片段,将其克隆至真核表达质粒pcdna3.1(+)中,构建重组真核表达载体pcdna3.1-AN。结果:所获得的序列是Notch1特征性的AN结构域。结论:成功构建了pcdna3.1-AN真核表达载体。

关键词： Notchl ANK结构域 NLS结构域 pcdna3.1

pcdna3.1/hTSHRa重组体的构建

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天津医科大学学报 2006年第4期12卷 489-491页

作者：朱云娟姚智赵紫琴李兰英陆凤先叶静天津医科大学免疫学教研室天津300070 天津医科大学病理生理学教研室天津300070 天津医科大学内分泌学研究所天津300070

目的:构建重组体pcdna3.1/hTSHRa。方法:提取人正常甲状腺组织总RNA,逆转录后进行PCR,将纯化的扩增产物hTSHRa与表达载体pcdna3.1TOPO连接后转化***感受态菌。重组质粒经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法进行鉴定。结果:PCR扩增得到... 详细信息

目的:构建重组体pcdna3.1/hTSHRa。方法:提取人正常甲状腺组织总RNA,逆转录后进行PCR,将纯化的扩增产物hTSHRa与表达载体pcdna3.1TOPO连接后转化***感受态菌。重组质粒经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法进行鉴定。结果:PCR扩增得到hTSHR膜外区N端753bp的基因片段hTSHRa。该片段与表达载体pcdna3.1TOPO连接后转化***感受态菌。重组质粒经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定证实hTSHRa片段插入序列和方向正确。结论:hTSHRa片段插入真核表达载体pcdna3.1TOPO,插入序列和插入方向正确,可用于后续基因表达。

关键词：促甲状腺激素受体基因表达 pcdna3.1 Graves’病

pcdna3.1-FKBP12.6基因表达载体的构建及扩增

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华南国防医学杂志 2006年第4期20卷 16-18,24页

作者：刘国通杨成明第三军医大学大坪医院野战外科研究所心内科重庆400042

目的构建并扩增pcdna3.1-FKBP12.6基因表达载体。方法目的基因全基因合成,PCR加入酶切位点,连接入pGEM-Teasy载体,经酶切鉴定及测序后获得测序正确的目的基因。连接入真核表达载体pcdna3.1(-),再经酶切鉴定及测序后进行pcdna3.1-FKBP12.... 详细信息

目的构建并扩增pcdna3.1-FKBP12.6基因表达载体。方法目的基因全基因合成,PCR加入酶切位点,连接入pGEM-Teasy载体,经酶切鉴定及测序后获得测序正确的目的基因。连接入真核表达载体pcdna3.1(-),再经酶切鉴定及测序后进行pcdna3.1-FKBP12.6的扩增。结果成功构建并扩增pcdna3.1-FKBP12.6基因表达载体。结论pcdna3.1-FK-BP12.6表达载体的构建,为深入研究FKBP12.6基因对心肌细胞结构和功能的影响奠定基础,进而为探索安全、高效的心肌功能异常的治疗提供新的途径。

关键词： pcdna3.1 FKBP12.6 雷尼丁受体