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白粉病菌侵染对美洲南瓜不同抗性品种pal基因表达量的影响

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核农学报 2015年第10期29卷 1876-1883页

作者：张树武徐秉良刘佳薛应钰陈荣贤甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心甘肃兰州730070 甘肃省武威金苹果有限责任公司甘肃武威733000

为明确白粉病菌侵染对不同美洲南瓜抗性品种pal基因表达量的影响,采用室内接种和qRTPCR技术分别测定不同美洲南瓜抗性品种接种苍耳单囊白粉菌后发病率和病情指数,并分析接菌后其不同组织部位pal基因表达量的变化情况。室内测定结果表明... 详细信息

为明确白粉病菌侵染对不同美洲南瓜抗性品种pal基因表达量的影响,采用室内接种和qRTPCR技术分别测定不同美洲南瓜抗性品种接种苍耳单囊白粉菌后发病率和病情指数,并分析接菌后其不同组织部位pal基因表达量的变化情况。室内测定结果表明,抗病品种小三星F2发病率和病情指数显著低于感病品种金12F2,尤其接菌后第13天,小三星F2发病率和病情指数分别为17.3%和15.6,而金12F2发病率和病情指数分别为93.3%和83.0。pal基因表达量测定结果表明,不同抗性美洲南瓜接菌后,pal基因相对表达量显著升高,且随着接种天数增加,其不同组织部位pal基因相对表达量呈现出先增加后降低的趋势。抗病品种小三星F2接菌后叶片中pal基因相对表达量增加较为显著,叶柄和茎秆次之,并且其相对表达量分别在第7和第9天达到最大值;感病品种金12F2接菌后叶片中pal基因相对表达量较抗病品种低,但与对照相比,其pal基因相对表达量显著增加,并分别在第9和第11天达到最大值。因此,pal基因相对表达量与美洲南瓜抗白粉病强弱具有密切的关系。本研究可为南瓜抗病品种的选育提供科学依据。

关键词：苍耳单囊白粉菌 pal基因美洲南瓜抗病性组织部位

107杨次生木质部pal基因的RT-PCR扩增及其鉴定

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林业科学 2004年第4期40卷 193-197页

作者：薛永常李金花卢孟柱张绮纹大连轻工业学院生物与食品学院大连116034 中国林业科学研究院林业研究所北京100091

A fragment of pal (phenylalanine ammonia_lyase) gene was amplified by RT_PCR from poplar (Populus×euramericana cv. “74/76”) developing second xylem mRNA. It was cloned into pGEM-T Easy vector and identified by restriction enzyme, PCR amplification and sequencing. The sequence of the amplified DNA fragment was 565 base pairs. Alignment with the P. kitakamiensis pal cDNA sequence retrieved from EMBL nucleotide acid database (accession number D30656) showed that the first 400 base pairs in both sequences were almost identical. Therefore the fragment was part of pal gene. And both of sense and anti-sense expressional vectors were constructed.

关键词：次生木质部 pal基因 RT-PCR 鉴定苯丙氨酸解氨酶欧美杨107

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杜仲pal基因cDNA全长序列特征分析

经济林研究 2014年第1期32卷 40-44页

作者：李铁柱杜红岩刘慧敏中国林业科学研究院经济林研究开发中心河南郑州450003 国家林业局杜仲工程技术研究中心河南郑州450003 中南林业科技大学林学院湖南长沙410004

苯丙素类化合物的合成过程中,苯丙氨酸解氨酶(pal)是植物苯丙烷类合成的第1个关键酶。为了解杜仲苯丙氨酸解氨酶基因序列信息,为杜仲苯丙素类高效合成的分子调控提供科学依据,对杜仲pal基因cDNA和基因组全长序列特征进行了系统的生物信... 详细信息

苯丙素类化合物的合成过程中,苯丙氨酸解氨酶(pal)是植物苯丙烷类合成的第1个关键酶。为了解杜仲苯丙氨酸解氨酶基因序列信息,为杜仲苯丙素类高效合成的分子调控提供科学依据,对杜仲pal基因cDNA和基因组全长序列特征进行了系统的生物信息学分析。结果表明,杜仲的Eupal1基因的全长cDNA,其长度为2 133 bp;该基因共编码711个aa,酶蛋白相对分子质量77.14 kD,等电点6.24,属于稳定疏水性蛋白;编码蛋白二级结构是以α-螺旋和螺环结构为主的混合型结构,属于lyase-I-like蛋白超家族。

关键词：杜仲 pal基因 cDNA全长序列特征

美洲南瓜种皮pal基因RNAi表达载体构建及品种抗病性研究

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美洲南瓜种皮PAL基因RNAi表达载体构建及品种抗病性研究

作者：张树武甘肃农业大学

学位级别：硕士

美洲南瓜（Cucurbita pepo）为一年生蔓生草本植物，在北方保护地大面积栽培，而裸仁美洲南瓜（Hull-less Cucurbita pepo）作为美洲南瓜新型的栽培变种之一，是自然界中罕见的一种变异类型，但是近年来由于裸仁美洲南瓜育种技术传统、... 详细信息

美洲南瓜（Cucurbita pepo）为一年生蔓生草本植物，在北方保护地大面积栽培，而裸仁美洲南瓜（Hull-less Cucurbita pepo）作为美洲南瓜新型的栽培变种之一，是自然界中罕见的一种变异类型，但是近年来由于裸仁美洲南瓜育种技术传统、无壳率不稳定和综合商品性状不优，以及美洲南瓜白粉病和病毒病大面积发生等问题，成为限制裸仁美洲南瓜种质创新的一个瓶颈问题。因此，本研究以有壳和裸仁美洲南瓜为试材，构建了种皮pal基因RNAi表达载体，并对其编码蛋白进行了亚细胞定位，以及测定了白粉菌和西瓜花叶病毒（WMV）侵染后不同抗感品种不同组织部位pal基因的表达特性，主要研究结果如下：（1）采用“同源克隆法”克隆了有壳和裸仁美洲南瓜pal基因EST序列，其序列长度分别为815bp和812bp，并利用BLAST软件对有壳和裸仁美洲南瓜pal基因EST序列与NCBI中已报道的黄瓜pal基因EST序列进行比对，结果表明有壳和裸仁美洲南瓜pal基因序列与已报道的黄瓜pal基因EST序列同源性分别为92.44%和92.76%。同时，以克隆获得的有壳美洲南瓜pal基因部分靶标序列作为干扰片段，设计特异性引物扩增有壳美洲南瓜pal基因正反义片段，并以pHANNIBAL作为过渡中间载体引入大小为799bp的内含子序列形成发卡结构，构建了由CaMV35S启动子驱动的具有正义基因片段-pal(f)-pdk intro-反义基因片段-pal(r)的植物干扰表达载体pCEPSPS-FPR。（2）利用分子生物学软件对有壳和裸仁美洲南瓜pal基因编码蛋白进行亚细胞定位，结果表明pal基因编码蛋白位于细胞质内和内质网内。同时，通过构建重组质粒pCAMIBA-pal3-GFP和pCAMIBA-pal13-GFP，以及采用“基因枪”将重组质粒分别转入洋葱内表皮细胞，利用激光扫描共聚焦显微镜观察到绿色荧光出现在细胞质内和内质网内。因此，有壳和裸仁美洲南瓜种皮pal基因均为细胞质和内质网定位蛋白。（3）不同抗感美洲南瓜品种接种白粉病菌后，pal基因相对表达量显著升高，且接种后不同天数、不同品种和不同部位pal基因相对表达量均存在显著差异。随着接种天数的增加，不同抗感品种不同部位pal基因相对表达量整体呈现出先增加后降低的趋势。抗病品种“小三星F2”和“四星F1”接种白粉菌后叶片中pal基因相对表达量增加较为显著，叶柄和茎秆次之，并且其相对表达量在第7和9天达到最大值;感病品种“金12F1”和“金12F2”接种白粉菌后叶片中pal基因的相对表达量较抗病品种低，但与对照相比，其pal基因相对表达量显著增加，并且其相对表达量在第9和11天达到最大值，因此，可推测pal基因的相对表达量与美洲南瓜品种抗白粉病的强弱呈正相关，即表明pal基因与美洲南瓜的抗病性具有密切的关系。（4）接种WMV后不同抗感品种不同组织部位pal基因相对表达量随着接种时间的增加，整体呈现出先增加后降低的趋势，而且不同组织部位pal基因相对表达量总体呈现出叶片较高，叶柄和茎秆次之。同时，接种后5个品种不同组织部位pal基因相对表达量与对照相比均存在显著差异，且抗病和中抗品种不同组织部位pal基因相对表达量显著高于感病品种，其中抗病品种GBRV-8不同部位pal基因相对表达量相对较高，中抗品种GBRV-6，抗病品种GBRV-12和GBRV-13不同部位pal基因相对表达量次之，而感病品种光板pal基因相对表达量最低，因此，可推测pal基因的相对表达量与美洲南瓜品种抗病毒病强弱密切相关。

关键词：有壳美洲南瓜裸仁美洲南瓜种皮 pal基因克隆 RNAi 亚细胞定位南瓜白粉病西瓜花叶病毒病表达分析

苹果梨果实pal和CHS基因克隆与分析及pal基因植物表达载体的构建

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苹果梨果实PAL和CHS基因克隆与分析及PAL基因植物表达载体的构建

作者：王旭延边大学

学位级别：硕士

苹果梨(Pingguoli)是蔷薇科(Rosaceae)梨属(Pyrus)植物,因其个大、耐寒、丰产、优质,阳面着红色,肉质酥脆多汁而备受消费者喜爱。本试验通过RT-PCR技术对影响苹果梨果实着色相关酶(pal、CHS)基因全长进行了克隆,并且构建了pal基因的植... 详细信息

苹果梨(Pingguoli)是蔷薇科(Rosaceae)梨属(Pyrus)植物,因其个大、耐寒、丰产、优质,阳面着红色,肉质酥脆多汁而备受消费者喜爱。本试验通过RT-PCR技术对影响苹果梨果实着色相关酶(pal、CHS)基因全长进行了克隆,并且构建了pal基因的植物表达载体,以期为进一步探明苹果梨果实着色的分子机理及研究其基因功能奠定了基础。结果如下：1、首次从苹果梨中成功地克隆了pal基因的全长cDNA序列,命名为Pypal。 Pypal cDNA全长2160bp,推测其编码719个氨基酸,分子量(MV)为77.91KDa,等电点(PI)值为6.18。经同源性比较Pypal与一些蔷薇科植物序列高度同源。2、生物信息学分析表明,Pypal整条多肽链中亲水氨基酸416个,疏水氨基酸295个,整条多肽链表现为亲水性,定位于细胞质基质,且无转运肽,不存在跨膜结构域. Pypal蛋白二级结构预测显示：a-螺旋(H)占50.49%,p-折叠(E)占2.36%,无规卷曲(C)占47.15%。故Pypal蛋白二级结构以a-螺旋和无规卷曲为主。3、构建了含有pal基因的植物表达载体PBI121-Pypal,利用冻融转化法转化到根癌农杆菌LBA4404中。为将Pypal转化到模式植物或其他植物进而了解其功能奠定了基础。4、克隆得到的苹果梨CHS基因的全长cDNA序列为1170bp,命名为PyCHS1,其中A+T含量为47.26%,C+G为52.74%,推测其编码389个氨基酸,分子量为42.5KDa,等电点为5.77。经同源性比较PyCHS1与一些蔷薇科植物序列高度同源。5、生物信息学分析表明,PyCHS1整条多肽链中亲水氨基酸215个,疏水氨基酸166个,整条多肽链表现为亲水性,定位于细胞质基质,且无转运肽,不存在跨膜结构域。PyCHS1蛋白二级结构预测显示：α-螺旋(H)和无规卷曲(C)各占44.22%和32.39%,而β-折叠(E)则达到23.39%。故PyCHS1蛋白二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主。

关键词：苹果梨 pal基因 CHS基因生物信息学分析植物表达载体

‘红颜’草莓一步成苗体系优化和pal基因过表达载体、RNAi载体构建

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‘红颜’草莓一步成苗体系优化和PAL基因过表达载体、RNAi载体构建

作者：任寅印山西农业大学

学位级别：硕士

‘红颜’草莓外观品质好,营养物质丰富,富含黄酮等多种生物活性物质,抗氧化能力强,是山西省晋中市太谷区设施大棚草莓的主栽品种之一。常规繁殖方式易积累病毒,导致果实产量降低和品质下降。利用茎尖组织培养技术,能在较短时间内提供大... 详细信息

‘红颜’草莓外观品质好,营养物质丰富,富含黄酮等多种生物活性物质,抗氧化能力强,是山西省晋中市太谷区设施大棚草莓的主栽品种之一。常规繁殖方式易积累病毒,导致果实产量降低和品质下降。利用茎尖组织培养技术,能在较短时间内提供大量整齐的种苗。但仍存在培养时间长、步骤多、易污染等问题。本研究以当年生‘红颜’草莓为试验材料,通过探究茎尖不同大小、匍匐茎采集时间、外植体不同灭菌时间、培养基不同激素浓度配比、转接次数对‘红颜’草莓茎尖再生的影响,优化‘红颜’草莓组培一步成苗体系;同时对其类黄酮合成途径的关键酶pal基因(Unigene15686)进行筛选、克隆和分析,并构建pal基因过表达载体和沉默载体。本文结论如下:1、草莓茎尖的最佳灭菌处理为0.1%升汞处理10 min,成活率可达83.33%;最佳茎尖大小为0.3 cm,成活率可达93.33%。2、一步成苗最佳培养基为MS+0.37 mg/L 6-BA+0.15 mg/L IBA+0.04 mg/L GA,最佳再生频率为4.13,培养周期为50 d。培养30 d后进行转接,最佳转接次数为1次,再生频率可达1.40。组培苗的最佳栽培基质为:V(园土):V(营养土):V(蛭石)=1:1:1,移栽成活率可达91.67%。3、克隆得到‘红颜’草莓pal基因unigene15686,ORF长度为2175 bp,编码725个氨基酸,与6号染色体上maker-Fvb6-1-augustus-gene-255.38基因的ORF序列相同,推测为同一基因。该蛋白整体保守性较高,具有典型的pal保守结构域;系统分析草莓pal基因发现,草莓26个pal基因主要存在两个进化枝,其编码的所有蛋白均呈酸性,大部分存在于溶酶体和叶绿体中。4、采用同源重组方式,构建了以p CAMBIA1300为骨架的pal基因(Unigene15686)的过表达载体p CAMBIA1300GFP-pal15686;筛选pal基因的靶标片段,将其重组至p TRV2载体,构建了pal的基因沉默载体p TRV2-pal15686。以上结果将对草莓种苗的工厂化生产和草莓关键酶pal的深入研究提供理论基础。

关键词： ‘红颜’草莓一步成苗响应面法 pal基因载体构建

利用RNAi分析水稻化感作用关键酶pal基因的功能

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利用RNAi分析水稻化感作用关键酶PAL基因的功能

作者：代小青福建农林大学

学位级别：硕士

为证实水稻化感作用的功能性状与pal基因功能之间的相关性,揭示水稻化感作用的分子生态学过程与机制,以强化感水稻品种P1312777为材料,从化感水稻P1312777植株中提取基因组DNA,根据GenBank中pal基因的保守序列,设计合成RNAi引物,PCR扩增... 详细信息

为证实水稻化感作用的功能性状与pal基因功能之间的相关性,揭示水稻化感作用的分子生态学过程与机制,以强化感水稻品种P1312777为材料,从化感水稻P1312777植株中提取基因组DNA,根据GenBank中pal基因的保守序列,设计合成RNAi引物,PCR扩增出pal基因片段并克隆到pMD-18 Teasy载体,测序确定其正确性,获得pal基因320bp序列。再将pal基因片段(320bp)正反向连接于载体PTCK-303内含子两端,构建成RNAi表达载体PTCK303-S-A,通过根癌农杆菌介导转化水稻,对水稻进行GUS染色,PCR检测,证明外源基因已经成功整合到水稻基因组中,获得转基因水稻。荧光定量PCR检测结果:转基因正常氮与低氮PI叶组织中的pal基因表达量是对照未转基因正常氮,低氮PI叶组织中pal基因表达量的70%与75%,转基因正常氮与低氮PI叶组织中的pal基因干扰效率分别为30%与25%。与对照未转基因正常氮下相比,对照未转基因低氮下PI叶组织中的pal基因上调表达2.12倍。转基因低氮PI叶组织的pal基因也上调表达,与转基因正常氮下相比上调2.32倍。pal酶活性检测结果:转基因正常氮PI水稻pal酶活性下调,与未转基因正常氮PI水稻pal酶活性相比降低64%,说明pal基因被干扰。在不同氮素条件下水稻抑草潜力的变化结果:在源于转基因P1312777正常氮处理液中培养的稗草,其稗草干物重均大于未转基因P1312777、Lemont正常氮处理液培养的稗草的对应值,其抑制率则小于其对应值,在源于转基因P1312777低氮处理液中培养的稗草,其稗草干物重均大于未转基因P1312777、Lemont低氮处理液培养的稗草的对应值,其抑制率则小于其对应值,证实水稻化感作用的功能性状与pal基因的功能相关。

关键词： pal基因 RNAi GUS染色荧光定量PCR pal酶活性抑草潜力

基于实时荧光定量PCR技术的蝴蝶兰PPO和pal基因表达分析

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中国农学通报 2015年第7期31卷 125-130页

作者：赵和文崔金腾周田田北京农学院园林学院北京102206

为研究蝴蝶兰在组织培养过程中的褐化机制,通过观察与褐化相关基因PPO和pal在组织培养过程中不同时期的表达量,判断上述2个基因对褐化的影响。采用实时荧光定量的方法,设计特异性引物,获得PPO基因与pal基因的目的片段,再以实时荧光定量... 详细信息

为研究蝴蝶兰在组织培养过程中的褐化机制,通过观察与褐化相关基因PPO和pal在组织培养过程中不同时期的表达量,判断上述2个基因对褐化的影响。采用实时荧光定量的方法,设计特异性引物,获得PPO基因与pal基因的目的片段,再以实时荧光定量方式,检验上述2个基因在蝴蝶兰组培苗中的表达量。结果表明,获得的PPO基因目的片段与蝴蝶兰×五唇兰相似性达到97%,蝴蝶兰PPO基因目的片段序列与蝴蝶兰×朵丽兰相似性达到98%。通过对蝴蝶兰组培苗培养不同阶段中PPO基因及pal基因的表达差异研究,发现：在对组培苗叶片切割后PPO基因的表达量迅速增加,随培养时间的推移,表达量经过缓慢的降低后逐渐增高,在10~12天阶段表达量急剧增加,在12天达到最大量,随后降低,后期表达量浮动不大;pal基因分别在1、8、12天表达量急剧增加,12天的表达量最大,随后,总体表达量有降低趋势。2个基因在第12天表达量都达到最高,说明此时是褐化发生的关键时期,若此时期对其进行有效预防措施,将会减少褐化现象。

关键词：组织培养褐化 PPO基因 pal基因

山葡萄pal基因原核表达载体的构建及表达蛋白纯化

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安徽农业大学学报 2019年第5期46卷 888-893页

作者：陈蒙袁赫海张宇刘海峰延边大学农学院

山葡萄苯丙胺酸解氨酶(pal)是苯丙烷途径的关键酶,在果皮着色中能够调控花色苷合成途径。构建pal基因原核表达重组质粒pET28a-pal,并对重组蛋白表达条件进行优化,以山葡萄DNA扩增pal并连接到p MD18-T,筛选得到阳性克隆后连接到pET28a原... 详细信息

山葡萄苯丙胺酸解氨酶(pal)是苯丙烷途径的关键酶,在果皮着色中能够调控花色苷合成途径。构建pal基因原核表达重组质粒pET28a-pal,并对重组蛋白表达条件进行优化,以山葡萄DNA扩增pal并连接到p MD18-T,筛选得到阳性克隆后连接到pET28a原核表达载体上,重组质粒转化至*** BL21后经不同浓度的IPTG、不同诱导温度、不同诱导时间处理,通过DPS设计正交试验优化重组蛋白的表达条件,并将重组蛋白纯化。结果显示,正交试验不同处理下的蛋白表达差异显著(Ppal的效果最佳。成功构建其原核表达载体并使其在大肠杆菌中得到高效表达,为探究pal蛋白的表达提供参考。

关键词：山葡萄 pal基因正交设计原核表达