肠炎沙门菌pal基因缺失株部分生物学特性研究

作     者：赵桂新 

作者单位：河北科技师范学院 

学位级别：硕士

导师姓名：史秋梅;吴同垒

授予年度：2024年

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

主      题：肠炎沙门菌 pal基因 原核转录组测序 毒力 细胞感染 动物感染 免疫保护 

摘      要：肠炎沙门菌是常见的革兰氏阴性、人畜共患致病菌,严重危害公共卫生安全。抗生素是治疗细菌感染的常用策略,但也造成环境污染和多重耐药菌株的大量出现,进一步危害人类健康。疫苗接种被认为是防治沙门菌感染的另一个重要措施。沙门菌疫苗主要有减毒活疫苗、亚单位疫苗、灭活疫苗和DNA疫苗等。由于沙门菌是兼性胞内寄生菌,强大的细胞免疫对病原的清除具有至关重要的作用,因此减毒活疫苗免疫效果被认为优于其他类型疫苗。Tol-Pal系统是跨越内膜和外膜的多蛋白复合物,Tol-Pal系统的改变通常会破坏细菌细胞膜完整性,扰乱外膜通透性。肽聚糖相关脂蛋白（Peptidoglycan-associated lipoprotein,Pal）是Tol-Pal系统的组成部分,由pal基因编码,在多种革兰氏阴性菌内普遍存在,在很多革兰氏阴性菌中均有研究,被认为是一个重要的毒力因子,而肠炎沙门菌中pal基因的功能尚未明确,本研究选取pal基因为靶基因,探究Pal影响肠炎沙门菌毒力的机制及缺失株的免疫保护作用,为肠炎沙门菌减毒活疫苗开发提供新靶标。 1.肠炎沙门菌pal基因缺失株构建及部分特性分析 本研究利用肠炎沙门菌C50336构建肠炎沙门菌pal基因缺失株（Δpal）和pal基因回补株（Δpal+pal）,对Δpal进行部分生物学特性分析,研究表明Δpal遗传稳定性好,pal基因缺失基本不影响肠炎沙门菌生长和生化特性;Δpal生物被膜形成相关基因的表达水平均下调;pal基因缺失可以降低肠炎沙门菌运动能力、生物被膜形成能力、Curli菌毛的分泌量、耐药性、抵御碱性和氧化环境的能力及在蛋清中生存的能力。 2.肠炎沙门菌pal基因缺失株基因表达差异分析 为了探究pal基因对肠炎沙门菌毒力基因表达水平的影响,经q PCR检测Δpal的mgtc、inv H、spv B、sip A、sip B、ssav、csg A、pip B、prot6、mrr1、xth A、orf245、sod C、flg G、lrp、tat A、ssr A和adr A毒力基因的表达水平,与C50336相比,上述毒力基因表达水平均显著下调。对Δpal与C50336的原核转录组测序数据以多重检验校正P0.05且|logFold Change|≥2为标准筛选差异表达基因,发现Δpal与C50336存在152个显著差异表达基因,其中上调基因为29个,下调基因为123个。 3.肠炎沙门菌pal基因缺失株毒力评价及免疫保护作用研究 基于上述两部分试验结果,推测pal基因缺失可能影响肠炎沙门菌感染细胞的能力和毒力。通过细胞感染试验研究发现pal基因缺失显著降低肠炎沙门菌粘附、侵袭及胞内存活能力。小鼠感染试验研究发现Δpal的LD50增加10～4倍,在同等感染时间下,Δpal在小鼠组织器官中负荷量显著低于C50336,表明pal基因缺失使得肠炎沙门菌的毒力下降且定植能力显著降低。组织病理学观察可得,Δpal对小鼠产生的病理伤害较轻微,安全性良好。Δpal可诱导小鼠产生Ig G和Ig A抗体,当Δpal免疫的小鼠再次接触C50336抗原时会促进小鼠淋巴细胞增殖转化,Δpal免疫小鼠可上调部分细胞因子表达水平,表明Δpal可以诱导宿主产生粘膜免疫、体液免疫和细胞免疫的全身性免疫应答,Δpal作为减毒活疫苗候选株具有良好的免疫原性,Δpal可针对肠炎沙门菌的感染具有良好的免疫保护效果。 综上所述,本研究阐述了pal基因影响肠炎沙门菌毒力的机制及缺失株的免疫保护作用,同时Δpal作为肠炎沙门菌减毒活疫苗是非常有前景的,本研究为沙门菌疫苗的研发提供了新靶标。