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mir-15a-5p Regulates Oxaliplatin Resistance in Colorectal Cancer through the Wnt/β-catenin pathway

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Medicinal plant 2022年第3期13卷 9-13,17页

作者： Yanjie HUANG Tong XU Luwen WEN Qi FENG Jining ZHENG Chengde Medical College Chengde 067000 China

[Objectives]To explore the effects and mechanism of mir-15a-5p on oxaliplatin resistance in colorectal cancer HCT116/L cells.[Methods]The expression of mir-15a-5p in colorectal cancer sensitive cells HCT116 and resistant cells HCT116/L was detected by RT-qpCR method;the effect of oxaliplatin on the proliferation of HCT116 and HCT116/L cells was detected by MTT,and its IC_(50) and drug resistance fold of HCT116/L cells were calculated;the expressions of Wnt3a,β-Catenin and p-gp in HCT116 and HCT116/L cells were detected by Western Blot ***-116/L cells were divided into 5 groups:blank control group HCT116/L,control group 1 transfected with mir-15a-5p mimics NC,experimental group 1 transfected with mir-15a-5p mimics,control group 2 transfected with mir-15a-5p inhibitor NC,and experimental group 2 transfected with mir-15a-5p *** expression of mir-15a-5p in each group was detected by RT-qpCR method and the transfection efficiency was *** effect of different concentrations of oxaliplatin on the proliferation of cells in each group after transfection was detected by MTT and the half inhibitory concentration(50%inhibiting concentration,IC_(50))was *** expressions of Wnt3a,β-catenin and p-gp in each group after transfection were detected by Western Blot method,and the expressions of Wnt3a,β-catenin and MDR1 mRNA in each group after transfection were detected by RT-qpCR method.[Results](i)RT-qpCR results showed that the expression of mir-15a-5p in HCT116/L cells was(0.16±0.05)significantly lower than that in HCT116 cells(p5).(ii)The IC50 of oxaliplatin for HCT-116 cells and HCT116/L cells detected by MTT method were(13.51±2.62)and(103.08±12.29)μg/mL,*** drug resistance index of HCT116/L was 7.63.(iii)Western Blot results showed that the expressions of Wnt3a,β-catenin and p-gp in HCT116/L cells were significantly higher than those in HCT-116 cells(p5).(iv)After successful transfection,the IC50 of mir-15a-5p mimics group

关键词： Colorectal cancer mir-15a-5p Wnt/β-catenin p-gp

mir-15a-5p抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖与迁移

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中国病理生理杂志 2017年第2期33卷 344-348,352页

作者：钱建升李宇窦建卫西安交通大学第一附属医院肿瘤放疗科陕西西安710061 陕西省人民医院放疗科陕西西安710068 西安交通大学医学部药学院陕西西安710061

目的:观察高表达的mir-15a-5p对人肝细胞癌SMMC-7721细胞增殖和迁移能力的影响。方法:化学合成加入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的mir-15a-5p寡聚核苷酸,并进行测序确认;利用pcDNA6.2-GW/EmGFp质粒构建mir-15a-5p真核表达载体,瞬时转染SMMC-7... 详细信息

目的:观察高表达的mir-15a-5p对人肝细胞癌SMMC-7721细胞增殖和迁移能力的影响。方法:化学合成加入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的mir-15a-5p寡聚核苷酸,并进行测序确认;利用pcDNA6.2-GW/EmGFp质粒构建mir-15a-5p真核表达载体,瞬时转染SMMC-7721细胞,实时荧光定量pCR检测mir-15a-5p的表达;CCK-8法和台盼蓝染色活细胞计数检测SMMC-7721细胞的增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力的变化。结果:设计的mir-15a-5p序列与寡核苷酸测序结果匹配达100%;真核表达质粒瞬转后人肝癌SMMC-7721细胞mir-15a-5p的表达量与对照组相比显著增加(p5);mir-15a-5p高表达SMMC-7721细胞的增殖能力与对照组相比均显著下降(p5);mir-15a-5p高表达组细胞迁移速度低于对照组。结论:高表达的mir-15a-5p可抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖和迁移能力。

关键词： mir-15a-5p 肝细胞癌细胞增殖细胞迁移

mir-15a-5p靶向pD-L1对食管癌进展、预后与肿瘤免疫反应的影响

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世界华人消化杂志 2024年第9期32卷 678-685页

作者：林亭呈张婉君浙江省台州医院药剂科浙江省台州市318050

背景微核糖核酸(microRNA,mir)-15a-5p与细胞程序性死亡蛋白配体1(programmed death-ligand 1,pD-L1)在多种肿瘤进展、治疗与预后中发挥重要作用,但其在食管癌中的作用尚不完全清楚.目的研究mir-15a-5p与pD-L1表达对食管癌进展与预后的... 详细信息

背景微核糖核酸(microRNA,mir)-15a-5p与细胞程序性死亡蛋白配体1(programmed death-ligand 1,pD-L1)在多种肿瘤进展、治疗与预后中发挥重要作用,但其在食管癌中的作用尚不完全清楚.目的研究mir-15a-5p与pD-L1表达对食管癌进展与预后的影响,并分析二者的靶向关系以及二者调控食管癌细胞生物学行为的机制.方法用癌症基因组图谱数据库、基因表达综合数据库和RNA相互作用组百科全书泛癌分析数据库分析食管癌中mir-15a-5p和pD-L1基因的表达,通过Kaplan-Meier生存分析研究mir-15a-5p和pD-L1的表达与食管癌无病生存期以及总生存期的关系.信息学和荧光活性实验检测mir-15a-5p与pD-L1的靶向关系.体外培养食管癌细胞,转染mir-15a-5p mimics或mir-NC后,分别用Western blot、流式细胞术、免疫荧光实验检测pD-L1表达.将转染mir-15a-5p mimics或mir-NC的食管癌细胞与CD8+T细胞共培养,流式细胞术检测干扰素-γ(interferon-γ,INF-γ)阳性CD8+T细胞比例,ELISA检测共培养体系中上清液中INF-γ和白细胞介素(interleukin,IL)-2含量.结果mir-15a-5p在食管癌组织中表达水平较癌旁非癌变组织降低(p5).以mir-15a-5p表达水平的中位数为分界线,随T分期和肿瘤大小增加和淋巴结转移,mir-15a-5p低表达率增加(p5);相比于mir-15a-5p低表达的食管癌患者,mir-15a-5p高表达显示出较长的无病生存期和总生存期(p5),mir-15a-5p高表达同时pD-L1低表达的无病生存期和总生存期更长(p5).在mir-15a-5p高表达的食管癌患者中pD-L1 mRNA多呈低表达.pD-L1为mir-15a-5p的靶基因.过表达mir-15a-5p抑制食管癌细胞中总pD-L1及膜pD-L1表达(p5).在食管癌细胞中过表达mir-15a-5p可促进共培养体系中CD8+T细胞的激活(即:共培养体系中INF-γ阳性CD8+T细胞比例以及共培养体系中上清液中INF-γ和IL-2含量增加).结论mir-15a-5p可通过靶向pD-L1增强食管癌细胞的肿瘤免疫反应,且mir-15a-5p/pD-L1可作为食管癌诊断及预后生物标记物.

关键词： mir-15a-5p 食管癌 pD-L1 预后肿瘤免疫反应

mir-15a-5p通过调控YAp1表达影响慢粒细胞对伊马替尼敏感性

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miR-15a-5p通过调控YAP1表达影响慢粒细胞对伊马替尼敏感性

作者：陈慧君南昌大学

学位级别：硕士

目的:本研究旨在探讨mi R-15a-5p通过调控YAp1表达影响CML细胞生物学特性及其对IM敏感性的变化,为丰富现有CML细胞对IM耐药的分子生物学机制提供新的理论基础和依据,为研究逆转CML细胞对IM耐药提供新思路。方法:1、利用CCK-8方法检测慢... 详细信息

目的:本研究旨在探讨mi R-15a-5p通过调控YAp1表达影响CML细胞生物学特性及其对IM敏感性的变化,为丰富现有CML细胞对IM耐药的分子生物学机制提供新的理论基础和依据,为研究逆转CML细胞对IM耐药提供新思路。方法:1、利用CCK-8方法检测慢粒非耐药细胞株K562、耐药细胞株K562G在不同浓度伊马替尼(IM)刺激48h后的细胞活力,并计算IC50。q RT-pCR技术检测K562、K562G细胞以及健康供者外周血单个核细胞(pBMC)的mi R-15a-5p的表达差异。2、验证下调mi R-15a-5p表达对K562细胞耐药性的影响以K562为实验细胞,分别转染空载体对照组(NC)、mi R-15a-5p抑制剂(inhibitor)48h后,q RT-pCR技术检测转染效率。K562细胞转染NC、mi R-15a-5p inhibitor后48h利用CCK-8方法检测细胞活力和IC50;转染mi R-15a-5p inhibitor组及NC对照组48h后分别进行加0.1μM IM和不加IM处理48h,流式细胞术检测细胞凋亡率、Western Blot检测细胞增殖蛋白Cyclin D1以及凋亡蛋白Caspase3的表达差异。3、验证上调mir-15a-5p表达对K562G细胞耐药性的影响以K562G为研究对象,分别空载体对照组(NC)、mi R-15a-5p模拟剂(mimic)48h后,q RT-pCR技术检测转染效率。K562G细胞转染NC、mi R-15a-5p mimic后48h利用CCK-8方法检测细胞活力和IC50;转染mi R-15a-5p mimic组及NC对照组48h后分别进行加5μM IM和不加IM处理48h,流式细胞术检测细胞凋亡率、Western Blot检测Cyclin D1蛋白以及Caspase3蛋白的表达差异。4、利用mirNA靶基因数据库(mi RDB、mi RTarbase和Targetscan)对mi R-15a-5p的靶基因进行预测,并利用双荧光素酶报告系统进行验证。5、使用siRNA敲低K562G细胞的YAp1表达,Western Blot方法和q RT-pCR技术检测细胞敲低效率;CCK-8试剂盒检测转染si RNA 48h后细胞增殖情况;Western Blot方法检测增殖和凋亡相关蛋白表达情况。结果:1、K562细胞的IC50为0.16μM,K562G细胞的IC50为10.94μM。q RT-pCR结果显示,mi R-15a-5p在健康供者pBMC表达最高,在K562G细胞表达最低,三者之间两两比较均具有统计学差异。2、下调mi R-15a-5p表达可降低K562对IM的敏感性qRT-pCR技术检测各组mi R-15a-5p的表达,结果显示,与NC组相比,mi R-15a-5p inhibitor可明显降低K562细胞中mi R-15a-5p表达(p15a-5p inhibitor组K562细胞活力较对照组增加,且对IM的IC50值上升。流式细胞术结果显示,与NC组相比,mi R-15a-5p inhibitor组凋亡率降低(p5);与NC+IM组相比,mi R-15a-5p inhibitor+IM组凋亡率降低(p5);NC+IM较NC组凋亡率增加了2.4倍,而mi R-15a-5p inhibitor+IM组较mi R-15a-5p inhibitor组凋亡率只增加了2.1倍,表明抑制mi R-15a-5p表达后降低了K562细胞对IM敏感性。Western Blot结果显示,与NC组相比,mi R-15a-5p inhibitor组增殖蛋白Cyclin D1表达增加,凋亡蛋白Caspase-3表达下降;与NC+IM组相比,mi R-15a-5p inhibitor+IM组Cyclin D1蛋白表达增加,Caspase-3蛋白表达下降,表明下调mi R-15a-5p表达后能够逆转应用IM引起的Cyclin D1蛋白表达下降,Caspase-3蛋白表达增加。3、上调mi R-15a-5p表达可增加K562G细胞对IM的敏感性qRT-pCR技术检测各组mi R-15a-5p的表达,结果显示,与NC组相比,mi R-15a-5p mimic可明显上调K562G的mi R-15a-5p表达(p15a-5p mimic组K562G细胞活力较对照组明显受抑制,且对IM的IC50下降。流式结果显示,与NC相比,mi R-15a-5p mimic组凋亡率增加(p5);与NC+IM组相比,mi R-15a-5

关键词：慢性粒细胞性白血病 mir-15a-5p YAp1 耐药

mir-15a-5p靶向SIRT4调控结直肠癌细胞增殖、迁移和耐药性

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miR-15a-5p靶向SIRT4调控结直肠癌细胞增殖、迁移和耐药性

作者：梁雨桐四川大学

学位级别：硕士

结直肠癌是全球最常见的肿瘤之一,在我国的发病率逐年上升。micro RNA(mirNA)作为基因表达调控研究的后起之秀,参与调节肿瘤的基因表达、细胞周期、增殖和转移等重大生物进程。据报道,micro RNA-15a-5p(mirNA-15a-5p)在不同肿瘤中的作... 详细信息

结直肠癌是全球最常见的肿瘤之一,在我国的发病率逐年上升。micro RNA(mirNA)作为基因表达调控研究的后起之秀,参与调节肿瘤的基因表达、细胞周期、增殖和转移等重大生物进程。据报道,micro RNA-15a-5p(mirNA-15a-5p)在不同肿瘤中的作用不尽相同。在结肠炎中,mirNA-15a-5p促进结肠上皮细胞向结直肠癌细胞的转变,但其在结直肠癌发生发展中的具体机制尚不清楚。TCGA数据分析表明mir-15a-5p在结直肠癌中高表达。通过克隆形成、细胞倍增、划痕和Transwell实验证明mirNA-15a-5p在结直肠癌细胞HCT116中促进肿瘤细胞的增殖、迁移和浸润。为了进一步了解mir-15a-5p在结直肠癌中可能的调节机制,对其靶基因进行挖掘。分析TCGA数据库发现其中SIRT4在结直肠癌中低表达,与mir-15a-5p表达呈负相关。长寿蛋白SIRT4属于Sirtuin家族,有多项研究显示SIRT4抑制多种肿瘤的发展。SIRT4低表达与患者生存期缩短,预后不良关系紧密。实验构建稳定过表达和干扰SIRT4的HCT116-SIRT4和HCT116-sh SIRT4细胞株,发现SIRT4抑制结直肠癌细胞HCT116增殖、迁移和浸润。利用双荧光素酶报告实验进一步证明mir-15a-5p靶向结合在SIRT4的3’-UTR区。此外,HCT116细胞中过表达mir-15a-5p后,SIRT4 m RNA和蛋白水平表达含量下降。这些结果说明在结直肠癌细胞HCT116中,mir-15a-5p靶向抑制SIRT4促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和浸润。通过蛋白免疫印迹实验,发现HCT116 SIRT4过表达后,p-STAT3、p-GSK3β和Bcl-2水平下降,pTEN和BAX表达量上升,而HCT116-sh SIRT4干扰细胞株中,pSTAT3、p-GSK3β、Bcl-2、BAX及pTEN表达量变化相反。这些结果说明SIRT4在结直肠癌细胞HCT116中调控STAT3磷酸化和pTEN/AKT信号通路。使用Napabucasin抑制剂处理HCT116-sh SIRT4细胞,抑制p-STAT3表达后,p-GSK3β和Bcl-2下降,BAX表达量上升,细胞增殖、迁移和浸润能力减弱。在mir-15a-5p高表达的HCT116细胞中,当Napabucasin抑制p-STAT3后,细胞增殖、迁移和浸润能力减弱,说明mir-15a-5p通过靶向抑制SIRT4调节STAT3磷酸化从而影响细胞增殖、迁移和浸润能力。克服获得性化学耐药是结直肠癌治疗面临的关键问题之一。本论文使用结直肠癌五氟尿嘧啶(fluorouracil,5-FU)获得性耐药细胞系HCT116/FUR和结直肠癌奥沙利铂(Oxaliplatin,OXA)获得性耐药细胞系HCT116/OXA实验发现mir-15a-5p在这两种耐药细胞株中高表达,而SIRT4呈现低表达。mir-15a-5p inhibitor处理细胞后能恢复部分HCT116/FUR和HCT116/OXA耐药细胞株的化学敏感性,抑制细胞增殖和迁移。HCT116/FUR和HCT116/OXA中高表达SIRT4也得到同样结果。这说明,mir-15a-5p/SIRT4可能在结直肠癌HCT116细胞获得化学耐药的过程中扮演着重要的角色。总之,本论文发现SIRT4是mir-15a-5p的直接靶标,mir-15a-5p通过SIRT4调控STAT3磷酸化及pTEN/AKT信号通路,调控HCT116细胞增殖、迁移和浸润能力,并参与调控结直肠癌细胞HCT116 5-FU及奥沙利铂获得性耐药的产生。本研究对于了解结直肠癌发生发展机制、寻找新的肿瘤诊断和预后标志物、克服结直肠癌获得化学耐药性具有重要的意义。

关键词：结直肠癌细胞 mir-15a-5p SIRT4 STAT3

lncRNA FGD5-AS1靶向mir-15a-5p调控LpS诱导的脓毒症细胞损伤

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中国免疫学杂志 2022年第6期38卷 666-670,675页

作者：王春枝武百强吴威赵艳庚张娜唐海霞杨冬松漯河医学高等专科学校第二附属医院重症医学科漯河462300 郑州市第七人民医院急诊科郑州450016 漯河医学高等专科学校第二附属医院药品科漯河462300 漯河医学高等专科学校第二附属医院骨科漯河462300

目的:探讨长链非编码RNA FGD5-AS1(lncRNA FGD5-AS1)对LpS诱导的脓毒症细胞损伤的影响及分子机制。方法:500 ng/ml脂多糖(LpS)诱导THp-1细胞损伤。THp-1细胞分为对照组、LpS组、pcDNA组、pcDNA-FGD5-AS1组、anti-mir-NC组、anti-mir-15a-5p组、pcDNA-FGD5-AS1+mir-NC组、pcDNA-FGD5-AS1+mir-15a-5p组。RT-qpCR检测lncRNA FGD5-AS1和mir-15a-5p表达;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot法检测蛋白表达;ELISA检测IL-6、IL-1β、TNF-α水平。双荧光素酶报告实验检测lncRNA FGD5-AS1和mir-15a-5p的靶向关系。结果:与对照组相比,经LpS诱导的THp-1细胞中,lncRNA FGD5-AS1表达降低,mir-15a-5p表达升高(p5)。过表达lncRNA FGD5-AS1和下调mir-15a-5p均能够显著降低细胞凋亡以及炎症细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α表达(p5)。lncRNA FGD5-AS1靶向调控mir-15a-5p表达,上调mir-15a-5p能逆转过表达lncRNA FGD5-AS1对LpS诱导的THp-1细胞凋亡以及炎症细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的影响(p5)。结论:过表达lncRNA FGD5-AS1通过靶向下调mir-15a-5p表达减轻LpS诱导的THp-1细胞损伤。

关键词： lncRNA FGD5-AS1 mir-15a-5p LpS THp-1 细胞损伤

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沉默环状RNA溴域pHD手指转录因子通过靶向mir-15a-5p对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞损伤影响的研究

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中国糖尿病杂志 2023年第4期31卷 284-290页

作者：黄德磊傅宏王梗黑龙江省大庆市大庆龙南医院眼科 163453

目的探讨沉默环状RNA溴域pHD手指转录因子(circBpTF)对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞(hRMEC)损伤的影响及其可能作用机制。方法取对数生长期hRMEC加入浓度为5.5 mmol/L葡萄糖培养基处理24 h为正常对照(Con)组,加入浓度为25 mmol/L... 详细信息

目的探讨沉默环状RNA溴域pHD手指转录因子(circBpTF)对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞(hRMEC)损伤的影响及其可能作用机制。方法取对数生长期hRMEC加入浓度为5.5 mmol/L葡萄糖培养基处理24 h为正常对照(Con)组,加入浓度为25 mmol/L葡萄糖培养基处理24 h为HG组。将si-NC、si-circBpTF、mir-NC、mir-15a-5p mimic、si-circBpTF和mir-15a-5p inhibitor(共转染)分别转染至hRMEC,转染成功后加入浓度为25 mmol/L葡萄糖培养基处理24 h,分别为HG+si-NC组、HG+si-circBpTF组、HG+mir-NC组、HG+mir-15a-5p mimic组、HG+si-circBpTF+mir-15a-5p inhibitor组。qRT-pCR法检测circBpTF、mir-15a-5p表达,试剂盒检测丙二醛(MDA)与超氧化物歧化酶(SOD)活性,细胞计数试剂盒8法与流式细胞术分别检测细胞活力及凋亡率,双荧光素酶报告实验检测circBpTF与mir-15a-5p的靶向关系,Western blot法检测活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白表达。结果与Con组比较,HG组MDA、凋亡率、circBpTF表达升高(p5),SOD、细胞活力、mir-15a-5p表达降低(p5)。与HG+si-NC组比较,HG+si-circBpTF组MDA、凋亡率、circBpTF表达降低(p5),SOD、细胞活力、mir-15a-5p表达升高(p5)。与HG+mir-NC组比较,HG+mir-15a-5p mimic组MDA、凋亡率降低(p5),SOD、细胞活力、mir-15a-5p表达升高(p5)。与HG+si-circBpTF组比较,HG+si-circBpTF+mir-15a-5p inhibitor组MDA、凋亡率升高(p5),SOD、细胞活力、mir-15a-5p表达降低(p5)。Starbase预测显示,circBpTF与mir-15a-5p存在互补序列,上调mir-15a-5p表达可抑制转染野生型载体WT-circBpTF的细胞相对荧光素酶活性(p5)。结论沉默circBpTF可通过靶向调控mir-15a-5p表达促进细胞增殖及抑制细胞氧化应激、凋亡,减轻高糖诱导的hRMEC损伤。

关键词：糖尿病视网膜病变人视网膜微血管内皮细胞环状RNA溴域pHD手指转录因子 mir-15a-5p 细胞增殖凋亡氧化应激

LncRNA MEG8通过靶向mir-15a-5p调控MICA/B介导结直肠癌细胞免疫逃逸

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中国免疫学杂志 2024年第6期40卷 1217-1221,1127页

作者：李鸷吴迪田飞刘洁谢兴明遵义市第一人民医院胃肠外科遵义563000

目的:探究长链非编码RNA母系表达基因8(LncRNA MEG8)通过靶向mir-15a-5p调控MHCⅠ类相关蛋白A/B(MICA/B)介导的结直肠癌(CRC)细胞免疫逃逸机制。方法:RT-qpCR、Western blot检测CRC组织和细胞系MEG8、mir-15a-5p、MICA、MICB、NKG2D蛋白水平;双荧光素酶实验验证MEG8对mir-15a-5p的调控关系;采用脂质体转染法将NC、MEG8、mir-NC、mir-15a-5p分别或共转染至SW480、SW620细胞,记为NC组、MEG8组、MEG8+mir-NC组、MEG8+mir-15a-5p组;将NK细胞分别与SW480、SW620细胞共培养;ELISA检测共培养液中TNF-α、IFN-γ水平;CCK-8、EdU染色、Transwell实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力;RT-qpCR、Western blot检测细胞MEG8、mir-15a-5p、MICA、MICB、NKG2D蛋白水平。结果:与癌旁组织或正常结肠上皮细胞相比,CRC组织和细胞系中MEG8、MICA、MICB、NKG2D mRNA和蛋白水平降低,mir-15a-5p水平升高(p5)。MEG8靶向调控mir-15a-5p。共培养体系中,与NC组相比,MEG8组细胞MICA、MICB、NKG2D蛋白水平、共培养上清液中TNF-α、IFN-γ水平明显升高,培养1 d、2 d、3 d后,OD值、EdU阳性率、迁移和侵袭细胞数明显降低(p5);过表达mir-15a-5p能部分逆转过表达MEG8对细胞MICA、MICB、NKG2D、TNF-α、IFN-γ水平和增殖、侵袭转移能力的影响(p5)。结论:MEG8通过靶向mir-15a-5p调控MICA、MICB表达,促进NK细胞活性,抑制CRC细胞免疫逃逸。

关键词：长链非编码RNA母系表达基因8 mir-15a-5p 结直肠癌免疫逃逸 MHCⅠ类相关蛋白A/B

mir-15a-5p与Smad7在心房颤动心肌纤维化的作用机制研究

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miR-15a-5p与Smad7在心房颤动心肌纤维化的作用机制研究

作者：何丹大连医科大学

学位级别：硕士

【背景和目的】心房颤动(房颤)作为临床最常见的心律失常之一,可诱发卒中、猝死、心力衰竭等严重并发症,其发病率逐年上升。房颤的主要病理基础是心房重构,而心房重构中心肌纤维化起着关键作用,因此认为房颤和心肌纤维化相互促进,但确... 详细信息

【背景和目的】心房颤动(房颤)作为临床最常见的心律失常之一,可诱发卒中、猝死、心力衰竭等严重并发症,其发病率逐年上升。房颤的主要病理基础是心房重构,而心房重构中心肌纤维化起着关键作用,因此认为房颤和心肌纤维化相互促进,但确切机制仍不明确,对于房颤心肌纤维化也无有效的治疗手段。大量研究表明转化生长因子β1(TGF-β1)可作为心肌纤维化最相关的因子之一。研究发现,Smad蛋白家族是TGF-β1的关键调控因子,分为受体调节型(R-Smads)、抑制型(I-Smads)和协同调节型(Co-Smads)。Smad7属于I-Smads,是TGF-β1信号通路的抑制剂。mi RNA是保守的18-25个核苷酸的非编码RNA,通过与m RNA 3′非翻译区(3′UTR)碱基配对从而调控基因表达,mi RNA的异常表达通常与病理疾病有关。据报道mi R-15a-5p在房颤患者中表达异常,但其作用机制目前尚无研究。本研究旨在探索mi R-15a-5p与Smad7在房颤心肌纤维化中的表达和可能的调控作用机制。【方法】1、收集从2020年6月至2021年6月我院心脏外科接受瓣膜置换患者左心耳(Left atrial appendage,LAA)组织于-80℃冻存(留少许组织进行福尔马林固定),共25例,其中房颤组患者13例,对照组患者12例。(1)定量实时聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-pCR)测定两组患者LAA组织mi R-15a-5p、Smad7、TGF-β1的m RNA表达水平;(2)蛋白质印迹(Western-blot,WB)检测两组患者LAA组织Smad7、TGF-β1、collagen I的蛋白表达水平;(3)苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色和羟脯氨酸含量测定对比两组患者LAA组织纤维化程度。2、用脂多糖(lipopolysaccharide,LpS)刺激H9C2细胞进一步构建心肌细胞纤维化模型,分别转染mi R-15a-5p模拟物和抑制剂、pc DNA3.1-Smad7和小干扰RNA-Smad7(si RNA-Smad7)以上调或下调mi R-15a-5p和Smad7在细胞内的表达水平。(1)q RT-pCR和WB检测mi R-15a-5p、Smad7、TGF-β1和collagen I的m RNA和蛋白表达水平;(2)细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)和5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(5-Ethynyl-2′-deoxyuridine,Ed U)测定细胞活力和增殖能力。3、基于Target Scan和RNAHybrid等综合预测分析发现Smad7的3′UTR有一个mi R-15a-5p的靶位点的基础上,双荧光素酶报告基因检测验证mi R-15a-5p和Smad7的相互作用。4、统计分析,计数资料以百分比表示,计量资料以均数±标准误(Mean±SEM)表示,采用独立样本t检验分析两组间的显著性差异。两组以上的差异采用单因素方差分析(ANOVA),然后进行事后检验。p5认为结果有统计学差异。【结果】1、两组基线特征结果显示,两组的左心房内径(LAD)有显著差异(61.69±3.67 vs 45.17±1.762,p5),其它基线资料在统计学上无差异。与对照组相比,房颤组患者LAA组织中mi R-15a-5p及纤维化标志物(TGF-β1和collagen I)的表达水平上调,而Smad7的表达则相反。2、在LpS刺激的H9C2细胞模型中,mi R-15a-5p m RNA(4.76±0.58 vs 1.00±0.10,ppppc DNA3.1-Smad7或mi R-15a-5p抑制剂,纤维化化标志物collagen I和TGF-β1的m RNA和蛋白表达水平、细胞活力和增殖能力均不同程度受抑制,而进一步的反馈实验证实si RNA-Smad7可以一定程度逆转mi R-15a-5p抑制剂的抑制作用。3、H9C2细胞中转染mi R-15a-5p模拟物可以抑制Smad7的表达,双荧光素酶报告基因检测实验验证了mi R-15a-5p对Smad7有靶向调节作用。【结论】1、mi R-15a-5p表达上调和Smad7表达下调可能与房颤患者心肌细胞纤维化相关。2、下调mi R-15a-5p或上调Smad7可抑制细胞模型中的纤维化标志物的表达、细胞活

关键词： mir-15a-5p 心肌纤维化 Smad7 TGF-β1 心房颤动