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let-7b-5p靶向SDC2抑制胆管癌增殖和迁移机制的研究

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let-7b-5p靶向SDC2抑制胆管癌增殖和迁移机制的研究

作者：韩磊昆明医科大学

学位级别：硕士

【目的】胆管癌是一类起源于胆管内膜上皮细胞、具有高度侵袭性的恶性肿瘤。近些年来,胆管癌的发病率、死亡率在全球范围内呈逐渐上升的趋势。胆管癌起病症状隐匿,缺乏特异性诊断指标,诊断较为困难,结合其自身的生物学特点,一般预后极... 详细信息

【目的】胆管癌是一类起源于胆管内膜上皮细胞、具有高度侵袭性的恶性肿瘤。近些年来,胆管癌的发病率、死亡率在全球范围内呈逐渐上升的趋势。胆管癌起病症状隐匿,缺乏特异性诊断指标,诊断较为困难,结合其自身的生物学特点,一般预后极差。因此,目前迫切需要找到一些能实现早期诊断、有效个体化治疗的分子靶标和肿瘤标志物。本课题通过运用临床病理标本检测、体外细胞实验及体内动物实验来探究let-7b-5p与SDC2间的靶向关系以及探索let-7b-5p/SDC2轴在胆管癌增殖、迁移中的机制,为实现胆管癌的早期诊断、个体化治疗及监测预后复发提供新的方向和思路。【方法】1.收集整理临床患者手术切除胆管癌组织标本和癌旁胆管组织标本,应用FISH方法检测胆管癌及癌旁组织中let-7b-5p的表达,分析胆管癌及癌旁组织中let-7b-5p表达的差异;通过免疫组织化学染色分析胆管癌及癌旁组织中SDC2蛋白表达,并探讨let-7b-5p、SDC2的表达量与胆管癌患者临床病理特征之间的关系。2.选取人胆管癌细胞系Hucc T1,传代培养后选取第3代细胞作为研究对象。构建let-7b-5p慢病毒敲低、过表达载体和各自阴性对照载体,继而包装各组慢病毒后分别转入胆管癌Hucc T1细胞,设立未转染细胞为空白对照组,余转染细胞分别为let-7b-5p敲低阴性对照组、let-7b-5p敲低组、let-7b-5p过表达阴性对照组、let-7b-5p过表达组,采用荧光显微镜直接观察评价转染效率。细胞转染后48h应用q pCR方法检测5组细胞内let-7b-5p表达量的差异,评价转染效果。随后通过EDU、流式细胞技术、细胞划痕实验、细胞迁移实验及Transwell侵袭实验等分别检测各组细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的能力;使用Western blot检测各组增殖和凋亡相关因子Ki67、Caspase3的表达,以及各组细胞SDC2蛋白的表达,利用双荧光素酶基因检测系统明确let-7b-5p对SDC2的靶向调控性。3.选取bALb/c裸鼠作为研究对象,将上述各组胆管癌细胞行裸鼠皮下接种,构建皮下移植瘤模型。裸鼠饲养3周后,针对裸鼠生长状态和瘤体的生长趋势,进行数据分析和实验检测,探索let-7b-5p/SDC2轴在胆管癌病理发展中的作用机制。【结果】1.FISH检测let-7b-5p表达结果:胆管癌组织中的表达低于癌旁组织,对比差异显著(p5);免疫组织化学检测SDC2蛋白表达结果:SDC2在胆管癌组织内表达明显上调,对比差异显著(p5);let-7b-5p、SDC2的表达与临床病理学资料分析:胆管癌组织内let-7b-5p、SDC2的表达量与患者年龄、淋巴结转移情况、肿瘤分化程度、TNM分期均无显著相关性,差异均无统计学意义(p>0.05);人胆管癌组织内let-7b-5p的表达与SDC2的表达存在负相关性。2.细胞功能验证:(1)成功构建了慢病毒let-7b-5p敲低、过表达载体和各自阴性对照载体,并成功包装慢病毒,各组慢病毒稳定转染人胆管癌细胞;(2)q pCR检测各组细胞let-7b-5p表达结果:let-7b-5p敲低组明显下调并低于其余各组,差异显著(p5);let-7b-5p过表达组明显上调并高于其余各组,差异显著(p5);空白对照组、let-7b-5p敲低阴性对照组、let-7b-5p过表达阴性对照组,三组间比较,差异无统计学意义(p>0.05);(3)EDU检测各组细胞增殖活性:let-7b-5p敲低组增殖情况明显高于其它各组,对比差异显著(p5),而let-7b-5p过表达组增殖情况明显低于其它各组,对比差异显著(p5),其余三组间比较,差异无统计学意义(p>0.05);(4)流式细胞检测细胞凋亡性:let-7b-5p过表达组与过表达阴性对照组相比较,过表达组细胞凋亡率明显升高,差异具有统计学意义(p5);let-7b-5p敲低组与敲低阴性对照组相比较,敲低组细胞凋亡率明显降低,差异具有统计学意义(p5);let-7b-5p过表达组与空白对照组相比较,过表达组细胞凋亡率明显升高,差异具有统计学意义(p5);let-7b-5p敲低组与空白对照组相比较,敲低组细胞凋亡率明显降低,差异具有统计学意义(p5);(5)划痕实验检测各组细胞迁移能力:随着时间的推移,let-7b-5p敲低组细胞迁移能力明显高于其它各组,对比差异显著(p5);let-7b-5p过表达组细胞迁移能力明显低于其它各组,对比差异显著(p5);(6)Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力:let-7b-5p敲低组细胞迁移和侵袭能力明显高于其它各组,对比差异显著(p5);let-7b-5p过表达组细胞迁移和侵袭能力明显低于其它各组,对比差异显著(p5);(7)双荧光素酶基因检测结果表明l

关键词： let-7b-5p SDC2 胆管癌

山羊子宫外泌体来源chi-let-7b-5p在胚胎附植中的作用研究

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山羊子宫外泌体来源chi-let-7b-5p在胚胎附植中的作用研究

作者：宁心暖西北农林科技大学

学位级别：硕士

在山羊等反刍动物养殖业中,繁殖率是影响动物生产经济效益的重要因素。在生产实践中,山羊面临受胎率低、反复流产等问题。胚胎附植是哺乳动物妊娠建立的关键环节,因此对胚胎附植阶段的深入研究是提高动物生殖性能的重点。外泌体可以将... 详细信息

在山羊等反刍动物养殖业中,繁殖率是影响动物生产经济效益的重要因素。在生产实践中,山羊面临受胎率低、反复流产等问题。胚胎附植是哺乳动物妊娠建立的关键环节,因此对胚胎附植阶段的深入研究是提高动物生殖性能的重点。外泌体可以将携带的核酸、蛋白质、脂质等多种物质,传递给靶细胞,调控靶细胞功能,发挥“信使”功能。已有报道显示人类以及其他动物子宫液中存在外泌体,且参与调节胚胎附植过程,而对山羊此方面的研究尚少。本研究通过建立山羊早期妊娠模型,收集山羊妊娠5天(胚胎附植前期)、15天(妊娠识别期)、18天(胚胎黏附期)的子宫冲洗液,通过超速离心法提取外泌体,并通过透射电子显微镜、纳米粒径跟踪分析仪及Western blot对提取样本进行鉴定;通过高通量测序技术,揭示山羊不同妊娠天数子宫冲洗液外泌体m RNAs和mi RNAs表达谱,使用GO分析和KEGG分析,揭示差异表达m RNAs以及mi RNAs靶基因主要发挥的功能及参与的信号通路;基于测序结果,本研究在山羊不同妊娠天数的子宫组织中发现let-7b-5p差异表达,推测其可能参与调控山羊胚胎附植过程,通过转染mi RNA mimic或inhibitor检测其对山羊子宫内膜上皮细胞增殖及胚胎附植相关基因表达是否产生影响,根据mi RNA靶基因在线预测软件找到预测的靶基因,并通过双荧光素酶报告实验验证靶向关系;在小鼠妊娠第3天子宫角注射mi RNA agmir或antagmir,通过对小鼠子宫胚胎附植位点数进行统计,验证let-7b-5p对胚胎附植的作用。结果如下:(1)透射电子显微镜下样品呈典型的杯状结构,粒径结果分析显示平均大小为75-78 nm之间,浓度在10particles/m L以上,Western blot鉴定外泌体标志蛋白结果阳性,表明已成功从山羊子宫冲洗液中分离到外泌体。(2)测序结果表明,妊娠5天和妊娠15天组中有26个差异表达的mi RNAs,10635个差异表达的m RNAs;妊娠5天和妊娠18天样本中差异表达的mi RNAs和m RNAs分别为35个和7362个;妊娠15天和妊娠18天样本中有30个差异表达的mi RNAs、9220个差异表达的m RNAs。GO分析结果显示这些差异表达的m RNAs和差异mi RNAs预测的靶基因是一些具有催化活性、结合活性、转录调节活性的膜相关细胞器,参与代谢、生物调节、发育等过程。KEGG分析结果显示其参与多种信号调节,例如代谢途径、氧化磷酸化、磷脂酰肌醇信号系统、Fox O信号通路、黏合连接、TGF-beta信号通路、Rap1信号通路、pI3K-Akt信号通路、Toll样受体信号通路等。随机选择测序结果中差异表达的mi RNAs(chi-mi R-199b-5p、chi-mi R-136-5p和chi-mi R-106b-3p)和m RNAs(FTH1、pTGS2、CTNNb1、ACSL4和GpX4)经RT-pCR检测,与测序结果一致,表明测序结果可靠。(3)原位杂交结果表明chi-let-7b-5p在山羊子宫组织中随着妊娠天数增加表达量降低,主要定位于山羊子宫内膜腔上皮细胞、腺上皮细胞和基质细胞中;不影响子宫内膜上皮细胞的增殖;let-7b-5p mimic下调了胚胎附植相关基因CXCL10、MUC1的表达,上调ISG15和HOXA10的表达,let-7b-5p inhibitor上调了CXCL10、MUC1的表达,下调了LIF的表达;双荧光素酶报告结果显示let-7b-5p直接靶向CXCL10,与NC mimic相比,在psi CHECK2-CXCL10 WT组中,chi-let-7b-5p mimic使荧光素酶活性降低了63%,而psi CHECK2-CXCL10 MUT组中,NC mimic和chi-let-7b-5p mimic的荧光素酶活性无显著差异,且let-7b-5p mimic上调CXCL10的蛋白表达水平,而let-7b-5p inhibitor抑制CXCL10的蛋白表达水平;免疫组化结果表明,CXCL10主要表达于子宫内膜腔上皮细胞、腺上皮细胞、基质细胞以及深层肌肉层,且m RNA表达水平随妊娠天数增加表达升高。(4)利用小鼠早期妊娠模型,在妊娠妊娠第3天子宫角注射let-7b-5p agmir或antagmir,结果显示,小鼠体内过表达let-7b-5p后,显著降低子宫中胚胎附植位点数,干扰let-7b-5p表达后对小鼠胚胎附植位点数无影响,此外,过表达let-7b-5p可下调小鼠胚胎附植相关基因LIF、Spp1和HOXA10的m RNA水平表达,干扰let-7b-5p表达上调LIF、Spp1的m RNA水平表达。综上所述,本研究通过高通量测序比较了山羊早期妊娠不同天数子宫液中外泌体中的m RNAs和mi RNAs的差异表达,并表明差异表达的chi-let-7b-5p可以靶向调控胚胎附植因子CXCL

关键词：胚胎附植外泌体 let-7b-5p CXCL10

LncRNA MVIH通过调节let-7b-5p促进胃癌细胞顺铂耐药

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包头医学院学报 2023年第10期39卷 11-17,22页

作者：胡婷李琦梅汪婷婷曾会会汪子书蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科安徽蚌埠233000

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)MVIH与胃癌细胞顺铂耐药的关系及其调控机制。方法:构建胃癌顺铂耐药细胞,CCK8法检测细胞增殖能力和顺铂半数抑制浓度(IC50),并计算耐药系数;实时定量pCR(qRT-pCR)分析耐药细胞中lncRNA MVIH和let-7b-5p... 详细信息

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)MVIH与胃癌细胞顺铂耐药的关系及其调控机制。方法:构建胃癌顺铂耐药细胞,CCK8法检测细胞增殖能力和顺铂半数抑制浓度(IC50),并计算耐药系数;实时定量pCR(qRT-pCR)分析耐药细胞中lncRNA MVIH和let-7b-5p的表达情况;流式细胞术检测细胞凋亡率;蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白bax和Caspase3的表达;通过lncLocator数据库和lncRNASNp2数据库分析lncRNA MVIH在细胞中的分布情况和可能调控的miRNA,双萤光素酶报告基因实验进行验证;生物信息学分析let-7b-5p在胃癌和癌旁组织的表达情况以及对胃癌预后的影响。结果:胃癌顺铂耐药细胞MGC803R中lncRNA MVIH的表达高于其亲本细胞MGC803(p5);在MGC803R中转染siMVIH显著增加了顺铂诱导的细胞凋亡,凋亡相关蛋白bax和Caspase3显著上调,同时抑制了其增殖(p5);lncRNA MVIH富集在细胞质中,可以靶向调控let-7b-5p,且let-7b-5p在胃癌中低表达,并与胃癌预后呈正相关(p5);在MGC803中同时转染siMVIH和let-7b-5p抑制剂,逆转了lncRNA MVIH对细胞顺铂敏感性的调控。结论:LncRNA MVIH通过调节let-7b-5p促进胃癌细胞顺铂耐药。

关键词： LncRNA MVIH 胃癌顺铂耐药 let-7b-5p

血液中低表达的微小RNA let-7b-5p对非小细胞肺癌的诊断价值

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实用肿瘤杂志 2023年第6期38卷 558-565页

作者：李国盛何融泉周华富孔晋亮陈罡广西医科大学第一附属医院病理科广西壮族自治区南宁530021 广西医科大学第一附属医院心胸外科广西南宁530021 广西医科大学第一附属医院肿瘤内科广西南宁530021 广西医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科广西南宁530021

目的探索微小RNA let-7b-5p用于早期诊断非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)患者的可行性。方法从Gene Expression Omnibus(GEO)数据库获取GSE152702、GSE171517、GSE27486以及GSE40738原始数据集,共包含145例NSCLC患者(NSCLC组)和83位健康人(对照组)的血液样本数据。NSCLC组数据涵盖肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)和肺鳞癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)。采用Wilcoxon秩和检验和标准化均数差(standardized mean difference,SMD)比较NSCLC组和对照组的let-7b-5p表达水平。通过受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线的曲线下面积(area under the curve,AUC)以及诊断性meta分析的敏感度和特异度评估let-7b-5p诊断NSCLC(LUAD和LUSC)的效能。结果GSE152702、GSE27486以及GSE40738数据集显示,let-7b-5p在LUAD患者的血液中低表达(均p5),GSE152702数据集还显示LUSC患者的血液中let-7b-5p表达低于对照组(p5)。综合LUAD和LUSC组的SMD结果进一步明确NSCLC组血液中let-7b-5p表达较对照组下调(SMD=-0.50,95%CI:-0.75~-0.26)。ROC曲线和诊断性meta分析显示,血液中let-7b-5p的表达水平可区分NSCLC样本和正常样本(AUC=0.79,敏感度=0.71,特异度=0.76)。ROC曲线分析显示,let-7b-5p在NSCLC中的10个潜在靶基因[碱性亮氨酸拉链和W2结构域2(basic leucine zipper and W2 domains2,bZW2)、细胞分裂周期蛋白25A(cell division cycle 25A,CDC25A)、细胞分裂周期相关基因8(cell division cycle associated8,CDCA8)、Ⅲ型胶原α-1链(collagen typeⅢalpha 1 chain,COL3A1)、外纺锤体极样蛋白1(extra spindle pole bodies like 1,ESpL1)、高迁移率族AT-hook蛋白1(high mobility group AT-hook 1,HMGA1)、胰岛素样生长因子2结合蛋白3(insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 3,IGF2bp3)、NME/NM23核苷二磷酸激酶4(NME/NM23 nucleoside diphosphate kinase 4,NME4)、葡萄糖磷酸变位酶2样蛋白1(phosphoglucomutase 2 like 1,pGM2L1)以及核糖核苷酸还原酶调节亚基M2(ribonucleotide reductase regulatory subunit M2,RRM2)]可区分LUAD与正常肺样本(AUC=0.765~0.980)以及区分LUSC与正常肺样本(AUC=0.749~0.997)。结论检测血液中的let-7b-5p表达水平可能可作为诊断NSCLC(包括LUAD和LUSC)患者的有效手段。

关键词：非小细胞肺癌微小RNA let-7b-5p 体液诊断

The Influence of let-7b-5p Target Gene in Cholangiocarcinoma and its bioinformatic Analysis

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Journal of Clinical and Nursing Research 2021年第2期5卷 33-37页

作者： Xibing Zhang Jianghua Ran Fang Liu Yingpeng Zhao Zongqiang Hu Department of Hepatopancreatobiliary Surgery The First Hospital of KunmingOrgan Transplantation Institute of Yunnan ProvinceYunnan ProvinceChina Department of Endocrine The First Hospital of KunmingKunming 650000Yunnan ProvinceChina

Objective:To analyze the biological functions and its clinical significance of let-7b-5p target gene in cholangiocarcinoma utilizing bioinformatics.Methods:The paper focuses on the let-7b-5p target gene,and predicts its biological functions as well as related signal pathways through GO biological function and KEGG signal pathway enrichment analysis.The STRING database and Cytoscape are used to construct a protein-protein interaction network to screen core genes.Results:The results of GO analysis showed that let-7b-5p target gene was mainly enriched in biological processes such as Small GTpase binding,Rho GTpase binding,and Rac GTpase binding.The results of KEGG analysis showed that let-7b-5p target gene was significantly enriched in key signaling pathways including Focal adhesion and ECM-receptor interaction.Through protein-protein interaction network and module analysis,CXCL8 and SDC2 were screened as the core site.Conclusion:let-7b-5p can participate in the regulation of biological functions of tumor cells in cholangiocarcinoma,suggesting that it may play an important role as a tumor suppressor gene and biomarker in the occurrence and development of cholangiocarcinoma,which provides new ideas for its diagnosis and treatment.

关键词： let-7b-5p Cholangiocarcinoma bioinformatics CXCL8 SDC2

ALD中HSC来源外泌体转运let-7b-5p促肝细胞凋亡与调肝理脾方的保护作用研究

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ALD中HSC来源外泌体转运Let-7b-5p促肝细胞凋亡与调肝理脾方的保...

作者：孔晨帆北京中医药大学

学位级别：硕士

目的:酒精性肝病（alcoholic liver disease,ALD）是由于长期过量摄入酒精所导致的一种病程漫长、且发病机制复杂的肝病。在我国,ALD发病率与死亡率正以惊人的速度上升,已成为我国最主要的慢性肝病之一。ALD发病机制未被完全阐明,但肝... 详细信息

目的:酒精性肝病（alcoholic liver disease,ALD）是由于长期过量摄入酒精所导致的一种病程漫长、且发病机制复杂的肝病。在我国,ALD发病率与死亡率正以惊人的速度上升,已成为我国最主要的慢性肝病之一。ALD发病机制未被完全阐明,但肝细胞、肝星状细胞等多种细胞已被证实参与其中,肝细胞的凋亡坏死、肝星状细胞的激活转分化贯穿ALD全程。已有大量研究发现肝内的细胞通讯与多种肝病进展关系密切,其中外泌体通过miRNA传递信息在ADL、肝纤维化等疾病中扮演了重要角色。外泌体是一种直径为30-150nm的胞外囊泡,可搭载包括微小RNA（miRNA）在内的多种小分子物质,充当细胞间信息传递的媒介,发挥重要的生物学功能。已有研究证实,肝细胞、肝星状细胞外泌体可以转运至肝内临近细胞,加重肝损伤。前期研究中发现,ALD模型中活化的肝星状细胞来源外泌体可诱导肝细胞凋亡,中药调肝理脾方对ALD具有显著的保护作用,但肝星状细胞来源外泌体诱导肝细胞凋亡以及调肝理脾方保护ALD的具体机制尚不明确。本研究旨在探讨ALD中肝星状细胞外泌体转运的miRNA对肝细胞的作用机制,从肝内细胞通讯的角度探究ALD发生发展中与调肝理脾方治疗ALD的分子机制。方法:（1）ALD中肝星状细胞促进肝细胞凋亡。1)HSC的ALD模型构建。采用不同浓度的乙醛刺激HSC48h,利用细胞增殖试剂盒（CCK-8）测定细胞存活率,Western blot（Wb）测定HSC细胞平滑肌肌动蛋白α（α-SMA）、胶原1（Col1）与纤连蛋白（FN）的表达水平,以评价模型。2)活化HSC与肝细胞的共培养实验。Transwell共培养（活化/静止）HSC与肝细胞,流式细胞术检测肝细胞凋亡率,采用实时荧光定量pCR（qpCR）与Wb法检测肝细胞凋亡相关分子Caspase3、bax与bcl-2表达水平,验证活化HSC对肝细胞凋亡的作用。（2）活化HSC外泌体miRNA差异表达谱与下游靶基因的筛选。1)用无外泌体培养基/含乙醛的无外泌体培养基分别处理HSC,收集细胞上清液并用超速离心法收集上清液中外泌体。使用电镜、Wb、粒径分析的方法对HSC外泌体（HSC-exo）进行鉴定。2)提取静止/活化HSC-exo,利用RNA-seq分析外泌体差异miRNA。|log2（FC）|＞2为标准筛选HSC来源外泌体中的差异表达miRNA。TargetScan软件预测HSC来源外泌体差异表达let-7b-5p的下游靶基因,双荧光素酶报告基因实验验证let-7b-5p与靶基因mRNA互补结合。（3）活化HSC外泌体运转let-7b-5p促进肝细胞凋亡。1)HSC-exo用pKH26染色后,与肝细胞共同孵育4h,使用荧光显微镜观察拍摄肝细胞摄取HSC-exo。将肝细胞与活化/静止组HSC-exo共同孵育,采用流式细胞术检测肝细胞凋亡,实时定量pCR方法检测肝细胞内 let-7b-5p,EZH2、bax、bcl-2 mRNA水平水平,Wb的方法测定肝细胞EZH2、bax、bcl-2表达水平,验证活化组HSC-exo对肝细胞凋亡的作用。2)肝星状细胞内转染let-7b-5p mimics、let-7b-5p mimic-NC。qpCR方法检测肝星状细胞外泌体内let-7b-5p;将let-7b-5p mimic修饰的肝星状细胞外泌体与肝细胞共培养,采用流式细胞术检测肝细胞凋亡水平,qpCR方法检测肝细胞内let-7b-5p,EZH2、bax、bcl-2 mRNA水平水平,Wb方法检测EZH2、bax、bcl-2的表达水平。（4）调肝理脾颗粒对let-7b-5p介导的肝细胞凋亡保护作用研究。1)采用不同浓度的调肝理脾方颗粒水溶液处理肝细胞48h小时,采用CCK-8法确定调肝理脾颗粒处理的最佳浓度。2)设立肝细胞NC组,let-7b-5p过表达组组与中药保护组。中药保护组首先采用调肝理脾方水溶液预防性给药48h,48h后NC组转染let-7b-5p mimic-NC,let-7b-5p过表达组与中药保护组组转染let-7b-5p mimic。使用流式细胞术检测NC组、let-7b-5p过表达组与中药保护组的凋亡水平,qpCR检测let-7b-5p,EZH2、bax、bcl-2 mRNA 水平,Western blot 方法检测 EZH2、bax、bcl-2 的表达水平。结果:（1）用300μM乙醛刺激HSC 48小时后,HSC的存活率最高,为正常组的1.15倍。Wb结果显示,α-SMA、Col1与FN表达水平较正常HSC显著上调,HSC造模成功。（2）流式结果显示:肝细胞与乙醛活化的HSCTranswell共培养后,肝细胞凋亡率显著提高;qpCR与Wb结果显示肝细胞Caspase3、bax mRNA与蛋白表达上调,bcl-2 mRNA与蛋白表达量下调。（3）透射电镜、Wb与粒径分析结果显示,细胞上清液超速离心

关键词：凋亡肝细胞肝星状细胞酒精性肝病调肝理脾方外泌体 let-7b-5p

let-7b-5p靶向ETFA减轻高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化的机制研究

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广西医科大学学报 2021年第12期38卷 2214-2219页

作者：陈传珍卢海林覃晓广西医科大学第一附属医院血管外科南宁530021

目的:探讨let-7b-5p调控电子转移黄素蛋白A(ETFA)表达对高磷诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)钙化的影响。方法:体外培养VSMCs,分为正常对照组和钙化组。钙化组用含β-甘油磷酸钠(β-Gp)的培养基培养14 d诱导VSMCs钙化,通过茜素红染色和碱... 详细信息

目的:探讨let-7b-5p调控电子转移黄素蛋白A(ETFA)表达对高磷诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)钙化的影响。方法:体外培养VSMCs,分为正常对照组和钙化组。钙化组用含β-甘油磷酸钠(β-Gp)的培养基培养14 d诱导VSMCs钙化,通过茜素红染色和碱性磷酸酶(ALp)染色观察VSMCs钙化情况。分别将let-7b-5p mimic、let-7b-5p inhibitor、ETFA siRNA及相应对照转染VSMCs,并诱导细胞钙化。用RT-qpCR法检测细胞let-7b-5p、ETFA及Runx2表达,Western blotting法检测ETFA和Runx2蛋白表达。双荧光素酶实验验证let-7b-5p与ETFA的靶向关系。结果:与正常对照组比较,钙化组出现明显的紫红色钙盐结节,let-7b-5p表达显著下调,ETFA和成骨细胞因子Runx2表达明显上调(均p5)。pearson相关分析显示,let-7b-5p与ETFA表达呈负相关关系(r=-0.785,pplet-7b-5p mimic能显著降低钙化细胞Runx2和ETFA的表达及ALp活性,而let-7b-5p inhibitor则相反。let-7b-5p可靶向调控ETFA表达。沉默ETFA后,钙化VSMCs中ETFA和Runx2表达显著下降,钙盐结节明显减少。结论:let-7b-5p可通过靶向抑制ETFA的表达抑制高磷诱导的VSMCs钙化。

关键词：血管平滑肌细胞高磷血管钙化 let-7b-5p ETFA

成纤维生长因子受体1通过控制微小RNA let-7b表达调节内皮细胞线粒体生源的作用研究

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中华内分泌代谢杂志 2018年第5期34卷 404-409页

作者：胡琼英杨矫陈高莉陈秋成都中医药大学附属医院检验科 610072 成都中医药大学附属医院内分泌科 610072

目的探索成纤维生长因子受体l（fihrohlast growth factor receptor1，FGFRl）在调控内皮稳态时对上游分子N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸（N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline、AcSDKp）的影响和下游微小RNAlet-7（microRNA let-7、miR let-7）的诱导作用及与内皮细胞线粒体生源的关系，以期最终研究FGFR1在内皮稳态中的调控作用。方法下调FGF／FGFRl信号通路，蛋白质印迹（Western印迹．Wb）法和细胞免疫荧光（Immunofluorescence staining）技术检测线粒体融合蛋白MFN2（mitofusin-2）、OpA1（optic atrophy protein1）和分裂蛋白DRp1（dynamin-related protein-1）的表达；应用线粒体染色（MitoTraker Green）检测线粒体的生成；运用实时荧光定量核酸扩增（Real-time Quantitative pCR、qpCR）检测技术检测microRNA let-7的表达。结果FGFRl通过诱导microRNA let-7b一5p的生成促进AcSDKp维持线粒体的生源；AcSDKp修复细胞因子复合物Triple（TGF-β2、IL-1β和TNF-α）所引起microRNA let-7b-5p表达抑制与线粒体的生成密切相关；抑制microRNA let-7b-5p的表达后，AcSDKp失去促进线粒体生成的作用：上调microRNA let-7b-5p的表达后，可修复内皮细胞中因FGF／FGFRl底物FRS2（fibroblast growth factor receptor substrate）沉默所致通路缺失所致的线粒体生成障碍。结论FGFRl通过上调microRNA let-7b-5p的表达，促进线粒体的生成，从而在内皮细胞的稳态中起着十分重要的作用。

关键词：成纤维生长因子受体1 成纤维生长因子受体底物2 线粒体生源微小RNA let-7b-5p

LINC01882通过促进CD4+ T细胞向Treg分化改善aGVHD

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LINC01882通过促进CD4+ T细胞向Treg分化改善aGVHD

作者：滕瑶华中科技大学

学位级别：硕士

研究目的:1.验证LINC01882在aGVHD患者CD4T细胞中的表达;2.探究LINC01882调控人CD4T细胞的生物学功能及机制;3.在小鼠GVHD模型中,探讨过表达LINC01882的CD4T细胞是否能减轻aGVHD。研究方法:1.临床资料采用实时定量聚合酶链反应(RT-qpCR... 详细信息

研究目的:1.验证LINC01882在aGVHD患者CD4T细胞中的表达;2.探究LINC01882调控人CD4T细胞的生物学功能及机制;3.在小鼠GVHD模型中,探讨过表达LINC01882的CD4T细胞是否能减轻aGVHD。研究方法:1.临床资料采用实时定量聚合酶链反应(RT-qpCR)检测aGVHD患者与non-aGVHD患者的CD4T细胞中LINC01882和let-7b-5p的表达水平。2.体外实验(1)采用RT-qpCR检测anti-CD3/CD28活化后的人CD4T细胞和未活化的CD4T细胞中的LINC01882及let-7b-5p的表达水平。(2)(1)利用LINC01882 cDNA慢病毒和空载慢病毒分别感染人活化的CD4T细胞,得到过表达LINC01882的细胞(OE-LINC)及其对照组细胞(NC-LINC);(2)利用LINC01882的两个独立的si RNA和对照si RNA分别转染人活化的CD4T细胞,得到敲低LINC01882表达的细胞(si-LINC#1,si-LINC#2)及其对照组细胞(si-NC);(3)利用let-7b-5p mimic及mimic NC分别转染人活化的CD4T细胞,得到过表达let-7b-5p的细胞(let-7b-5p-mimic)和对照组细胞(mimic-NC)。(4)利用let-7b-5p mimic和mimic NC分别转染OE-LINC组细胞,得到同时过表达LINC01882和let-7b-5p的细胞(OE-LINC+let-7b-5p-mimic)和过表达LINC01882的细胞(OE-LINC+mimic-NC);利用mimic NC转染NC-LINC组的细胞得到对照组细胞(NC-LINC+mimic-NC)。1)利用RT-qpCR检测各组细胞中LINC01882、let-7b-5p的表达水平;2)应用流式细胞术检测各组细胞Treg、Th17细胞的比例改变;3)ELISA检测各组细胞培养上清中IL-10和IL-17的水平改变;4)利用miRNA-seq技术筛选LINC01882的靶基因miRNA,使用双荧光素酶报告实验以及RT-qpCR确定两者关系;5)应用Western blotting(Wb)和RT-qpCR检测各组细胞smad2的水平。3.体内实验使用NOD-scid IL2Rγ(NSG)小鼠构建人源化GVHD模型,分成两组。一组输注pbMC和过表达LINC01882的CD4T细胞,为NC co-inj;另一组输注pbMC和对照CD4T细胞,为OE co-inj。研究结果:1.在活化的CD4T细胞和aGVHD患者的CD4T细胞中LINC01882的表达水平明显下降,let-7b-5p的表达升高。2.在活化的CD4T细胞中过表达LINC01882后,Treg比例增加,IL-10分泌水平增加,smad2的表达增加;而沉默LINC01882的表达后,结果相反。在过表达或敲低LINC01882活化的CD4T细胞中Th17细胞比例和IL-17水平均无改变。3.生物信息学分析结果、Wb和RT-qpCR结果证实smad2是let-7b-5p的靶基因;4.在活化的CD4T细胞过表达LINC01882后,let-7b-5p的表达减少,smad2的表达增加;在活化的CD4T细胞敲低LINC01882后,结果相反。双荧光素酶报告实验结果证明LINC01882与let-7b-5p存在结合。5.与OE-LINC+mimic-NC组细胞比较,OE-LINC+let-7b-5p-mimic组Treg比例减少,IL-10分泌水平减少,smad2的表达减少。6.OE co-inj组人源化GVHD小鼠各脏器的病理评分降低,脾脏人Treg细胞的浸润增加。结论:1.LINC01882在活化和aGVHD患者的CD4T细胞的表达水平下降。2.LINC01882通过调控let-7b-5p/smad2轴参与aGVHD的发生发展,为aGVHD提供新的治疗靶点。

关键词： LINC01882 Treg cells 急性移植物抗宿主疾病 let-7b-5p smad2