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河南省输入性恶性疟原虫多药抗性基因1和k13基因的突变分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2018年第2期36卷 97-102页

作者：杨成运李素华张雅兰周瑞敏刘颖钱丹赵玉玲许汴利张红卫邓艳河南省疾病预防控制中心郑州450016

目的对河南省2013-2015年输入性恶性疟原虫多药抗性基因1(Pfmdr1)和k13基因进行检测,分析其基因突变情况。方法采集河南省2013-2015年自非洲返乡的被确诊为输入性恶性疟患者的血样,并收集病例的相关信息。提取患者血样中疟原虫基因组DNA... 详细信息

目的对河南省2013-2015年输入性恶性疟原虫多药抗性基因1(Pfmdr1)和k13基因进行检测,分析其基因突变情况。方法采集河南省2013-2015年自非洲返乡的被确诊为输入性恶性疟患者的血样,并收集病例的相关信息。提取患者血样中疟原虫基因组DNA,巢式PCR扩增Pfmdr1和k13基因,对扩增序列进行测序、比对,分析基因的突变情况。结果386例输入性恶性疟患者以男性青壮年为主,自26个非洲国家返乡,其中病例数居前3位的输入来源国为安哥拉、赤道几内亚和尼日利亚,其病例数分别占总病例数的22.5%(87/386)、13.7%(53/386)和13.2%(51/386)。386份血样均成功扩增出Pfmdr1和k13基因。测序结果显示,Pfmdr1的86和1246位点的突变率分别为23.6%(91/386)和3.1%(12/386),k13基因的突变率为5.4%(21/386)。21份k13基因突变的血样来自于安哥拉、赤道几内亚和尼日利亚等10个国家,未发现C580Y突变。在来自安哥拉和赤道几内亚的血样中检测到2个与青蒿素抗性相关的突变,分别为R539T和P574L,突变率均为0.3%(1/386)。2013-2015年,Pfmdr1的86位点的突变率分别为28.8%(36/125)、23.4%(32/137)和18.6%(23/124),各年份突变率的差异有统计学意义(χ~2=6.438,P137)和1.6%(2/124),各年份突变率的差异无统计学意义(χ~2=1.384,P>0.05);k13基因的突变率分别为3.2%(4/125)、8.8%(12/137)和4.0%(5/124),各年份突变率的差异无统计学意义(χ~2=4.631,P>0.05)。结论Pfmdr1的86和1246位点的突变率分别为23.6%(91/386)和3.1%(12/386),k13基因的突变率为5.4%(21/386),发现了与青蒿素抗性相关的R539T和P574L位点突变。

关键词：输入性疟疾恶性疟原虫恶性疟原虫多药抗性基因1 k13基因突变

中缅边境及泰国东南地区恶性疟原虫k13基因侧翼微卫星多态性研究

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2017年第3期35卷 209-212页

作者：陈学迪叶润潘卫庆第二军医大学热带传染病学教研室上海200433

目的研究中缅边境拉咱地区和泰国东南Srisaket、Trat和Ranong等3个地区恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)k13基因侧翼微卫星的多态性。方法取前期经基因型研究的恶性疟原虫样品42份,其中中缅边境拉咱地区22份(k13基因R539T突变型和野... 详细信息

目的研究中缅边境拉咱地区和泰国东南Srisaket、Trat和Ranong等3个地区恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)k13基因侧翼微卫星的多态性。方法取前期经基因型研究的恶性疟原虫样品42份,其中中缅边境拉咱地区22份(k13基因R539T突变型和野生型各11份),泰国3个地区20份(k13基因R539T突变型9份和野生型11份),对上述样品k13基因上游31 900、6 360、150 bp和下游1 700、11 000、31 500 bp共6个位点的微卫星片段进行PCR扩增,PCR产物经毛细管电泳仪检测片段长度,并采用Bio Calculator软件进行数据分析,Gen ALEx软件计算等位基因频率和期望杂合度(He)。结果中缅边境拉咱地区和泰国3个地区恶性疟原虫虫株k13基因两侧的6个微卫星位点共检测到46个等位基因,在上游6 360 bp位点的等位基因长度分别集中在286和278 bp,等位基因频率为73%和67%。上游31 900 bp位点等位基因长度分别集中在211和205 bp,等位基因频率为55%和44%。上游150 bp及下游1 700 bp位点等位基因长度主要集中在195和209 bp,其他两个位点未出现集中分布的情况。中缅边境拉咱地区虫株的单倍体型为H1至H4型,泰国3个地区虫株除了2株H2单体型外,其余均为H5和H6型。42份样品的6个微卫星位点的平均He分别为0.49±0.23、0.42±0.33和0.72±0.12、0.67±0.11。R539T突变的虫株在毗邻k13基因的微卫星位点处He明显降低,在上游150 bp处分别为0.17和0,在下游1 700 bp处分别为0.3和0。结论中缅边境拉咱地区及泰国3个地区k13基因为R539T突变型的恶性疟原虫虫株均受到青蒿素选择压力,等位基因型在上游6 360和31 900 bp两个位点上具有明显的差异。

关键词：恶性疟原虫微卫星 k13基因

中缅边境地区恶性疟原虫k13基因的多态性分析

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中国病原生物学杂志 2021年第10期16卷 1223-1226页

作者：叶升玉叶润李春富唐烨榕周红宁云南省寄生虫病防治所云南省虫媒传染病防控研究重点实验室云南省虫媒传染病防控关键技术创新团队(培育)云南普洱665000 中国人民解放军海军军医大学热带病学教研室

目的通过检测中缅边境地区恶性疟原虫kelch 13螺旋体蛋白基因(kelch 13-propeller, k13)突变的动态变化情况,为当地恶性疟治疗策略的制定提供科学依据。方法收集以往中缅边境地区中国云南省西双版纳州景洪市、缅甸克钦邦拉咱市和佤邦第... 详细信息

目的通过检测中缅边境地区恶性疟原虫kelch 13螺旋体蛋白基因(kelch 13-propeller, k13)突变的动态变化情况,为当地恶性疟治疗策略的制定提供科学依据。方法收集以往中缅边境地区中国云南省西双版纳州景洪市、缅甸克钦邦拉咱市和佤邦第二特区勐冒县恶性疟病例滤纸血标本175份,采用巢式PCR法扩增k13基因第426~676位点片段,对扩增产物测序并进行统计分析。结果 2001年西双版纳州景洪市30份滤纸血中仅1份检出恶性疟原虫k13基因F446I突变;2006年标本未检测到突变。缅甸拉咱市恶性疟原虫k13基因共检测到5种突变(F446I、C469Y、Y511H、E556D和P574L),其中以F446I突变为主,突变率由2001年的45%(9/20)降低至2012年的25%(10/40);勐冒县2009年标本中未检测到k13基因突变。结论中缅边境地区缅甸拉咱市恶性疟原虫k13基因存在较多类型的突变,以F446I突变为主,提示该地区恶性疟原虫可能存在青蒿素抗性,建议加强对中缅边境地区恶性疟原虫药物抗性监测。

关键词：疟原虫恶性 k13基因多态性中缅边境地区

恶性疟原虫非洲地理株k13基因M579I突变与青蒿素耐受相关性研究

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恶性疟原虫非洲地理株k13基因M579I突变与青蒿素耐受相关性研究

作者：刘思宏江苏省血吸虫病防治研究所

学位级别：硕士

疟疾是由疟原虫感染人体引起的一种虫媒寄生虫病。目前全球每年约有2亿多人感染,造成60多万人死亡,其中大部分发生在非洲。2006年,世界卫生组织推荐以青蒿素为基础的联合疗法(ACTs)治疗恶性疟原虫感染,疟疾的感染率和死亡率均大幅下降... 详细信息

疟疾是由疟原虫感染人体引起的一种虫媒寄生虫病。目前全球每年约有2亿多人感染,造成60多万人死亡,其中大部分发生在非洲。2006年,世界卫生组织推荐以青蒿素为基础的联合疗法(ACTs)治疗恶性疟原虫感染,疟疾的感染率和死亡率均大幅下降。但随着青蒿素类抗疟药物在全球的广泛使用,全球多个地区已经发现青蒿素耐受的恶性疟原虫株。2014年,有研究发现恶性疟原虫k13(Plasmodium falciparum kelch 13,Pfk13)基因kelch结构域突变与青蒿素的耐受性有关,但k13不同位点的突变与青蒿素耐受的关联性有待进一步确认,而且不同遗传背景的虫株即使具有同样k13突变,其耐受水平也有明显差异。本课题组前期研究报道了首例非洲来源的恶性疟原虫青蒿素耐药虫株,并发现其k13基因带有M579I突变。随后,国际同行对实验室虫株(3D7)的k13进行M579I位点突变,也发现其对青蒿素的敏感性显著下降。但非洲恶性疟原虫株M579I突变是否与青蒿素耐受性的相关性并不确定,而且这些k13位点突变引起青蒿素耐受的分子机制也未明确。因此,本课题对恶性疟原虫非洲地理株的k13基因M579I突变与青蒿素耐受的相关性进行了研究,并对M579I突变引起的青蒿素耐受的机制进行初步探讨。第一部分恶性疟原虫非洲地理株k13基因M579I突变与青蒿素耐受的相关性研究目的:为了验证恶性疟原虫非洲地理株k13基因M579I位点突变能否导致青蒿素耐受现象。方法:首先,采用环状体生存试验(RSA)对恶性疟原虫非洲地理株的青蒿素耐受水平进行体外测定,然后采用CRISPR/Cas9技术对青蒿素敏感的非洲恶性疟地理株进行k13基因的M579I突变,以及对带有M579I突变的青蒿素耐药株进行I579M回复突变,再用RSA进行青蒿素耐受性分析,从而验证非洲地理株中k13基因M579I突变与青蒿素耐受的关联性。结果:恶性疟原虫非洲地理株大部分对青蒿素较为敏感(EG-01、EG-02和EG-03的RSA结果分别为:1.02±1.00%、0.32±0.45%和0.33±0.04%)。实验室前期发现的青蒿素耐药株(CWX)及其单克隆均对青蒿素敏感性较低(CWX、CWX-9A、CWX-11F和CWX-12F的RSA结果分别为:9.00±2.31%、8.21±0.98%、9.51±2.42%和12.36±1.29%),单克隆间耐药水平无显著性差异(P>0.05)。对k13基因未发生突变的青蒿素敏感地理株(EG-01)进行基因编辑,成功获得M579I突变株(EG-01),RSA结果显示其青蒿素耐受水平(20.34±3.56%)显著高于无突变虫株(P0.05),均高于EG-01(Pk13-I579M的回复突变质粒,进行电转染,对其回复突变,但未获得突变株。结论:本部分研究证实非洲输入地理株k13基因的M579I突变与青蒿素耐受性相关。第二部分恶性疟原虫非洲地理株k13基因M579I突变引起青蒿素耐受的机制初步研究目的:进一步了解非洲地理株中k13基因M579I位点突变所引起的青蒿素耐受的分子机制。方法:收集k13基因M579I突变前后的恶性疟原虫非洲地理株早期环状体,进行转录组测序(RNA-Seq),对筛选得到转录差异基因进行功能分析,从转录水平分析非洲地理株k13基因M579I突变引起青蒿素耐受的分子机制。结果:对k13基因M579I突变前后虫株(EG-01与EG-01)进行RNA-seq转录组测序,共测得5712个转录基因。具有统计学意义的差异基因共239个,上调基因为159个,下调基因为114个。GO聚类分析表明其中抗原变异家族基因普遍上调。上调基因中还有共同调控输出蛋白功能的基因,如:控制蛋白质折叠PF3D7＿1215300(10 k Da伴侣蛋白)与PF3D7＿1015600(热休克蛋白HSP60);蛋白质输出相关的PF3D7＿0631300、PF3D7＿1101800等;Pk蛋白激酶家族PF3D7＿1337100、PF3D7＿0213400;丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶FIkk1家族PF3D7＿0102600等。结论:本部分通过转录组分析显示恶性疟原虫非洲地理株k13基因M579I突变引起青蒿素敏感性下降的机制可能是通过输出蛋白功能上调,导致内吞血红蛋白作用降低有关。pfmdr1和pfmrp1等已知抗性相关基因可能与青蒿素耐受性相关。

关键词：恶性疟原虫青蒿素耐受性 k13基因非洲地理株

恶性疟原虫青蒿素抗性相关k13基因及其C-末端功能域的克隆及表达

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中国热带医学 2017年第5期17卷 440-444页

作者：赵笑张冬梅第二军医大学热卫系热带传染病学教研室上海200433

目的探索在大肠埃希菌中表达恶性疟原虫青蒿素抗性相关基因k13及其C-末端propeller结构域,为后续蛋白结构分析及青蒿素抗性机制等功能研究奠定基础。方法以恶性疟原虫基因组DNA为模板、PCR扩增k13及其C-末端基因片段并分别克隆至pET-28... 详细信息

目的探索在大肠埃希菌中表达恶性疟原虫青蒿素抗性相关基因k13及其C-末端propeller结构域,为后续蛋白结构分析及青蒿素抗性机制等功能研究奠定基础。方法以恶性疟原虫基因组DNA为模板、PCR扩增k13及其C-末端基因片段并分别克隆至pET-28a载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-dthiogalactoside,IPTG)诱导,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western blot检测重组蛋白的表达。再分别用恶性疟和间日疟患者血清进行重组蛋白rk13和rk13-propeller的Western blot检测。结果 PCR扩增得到全长k13基因和k13-propeller片段,并构建了重组质粒pET-28a-k13和pET-28a-k13-propeller。SDS-PAGE电泳和Western blot检测表明,两重组蛋白均表达,且重组蛋白rk13可与恶性疟患者血清反应,rk13-propeller既可与恶性疟又可与间日疟患者血清反应。结论利用原核表达系统成功表达重组蛋白rk13和rk13-propeller,两重组蛋白能够与疟疾患者血清反应,且与不同种疟疾的患者血清反应的特异性有所不同。

关键词：恶性疟原虫 k13基因 k13-螺旋桨样基因片段重组蛋白原核表达

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境外输入性恶性疟原虫药物抗性基因多态性分析

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中国病原生物学杂志 2018年第9期13卷 998-1001页

作者：杨成运李素华张雅兰周瑞敏刘颖钱丹赵玉玲许汴利张红卫河南省疾病预防控制中心河南省传染病病原生物重点实验室河南郑州450016

目的了解河南省输入性恶性疟原虫相关抗性基因的突变情况。方法采集河南省2016年自非洲劳务返乡的131例输入性恶性疟患者血样,提取DNA,采用Pfdhfr、Pfmdr1和k13基因序列引物进行巢式PCR扩增并测序,对测序结果进行序列比对,分析基因突变... 详细信息

目的了解河南省输入性恶性疟原虫相关抗性基因的突变情况。方法采集河南省2016年自非洲劳务返乡的131例输入性恶性疟患者血样,提取DNA,采用Pfdhfr、Pfmdr1和k13基因序列引物进行巢式PCR扩增并测序,对测序结果进行序列比对,分析基因突变情况。结果 131例输入性恶性疟患者自19个非洲国家务工返乡。131份血样均扩增出Pfdhfr、Pfmdr1和k13基因片段。其中Pfdhfr基因51,59和108位点氨基酸双突变NRNI型占2.29%,ICNI型占10.69%,三突变IRNI型占85.49%,野生型占1.53%,未见四突变。Pfmdr1基因86突变率分别为9.16%,k13突变率为11.45%,共15份血样检测到9个位点突变。结论 2016年河南省输入性恶性疟原虫Pfdhfr、Pfmdr1和k13基因均有不同程度的突变,其中Pfdhfr基因三突变型所占比例较高,k13基因未检测到与青蒿素抗性相关的突变。

关键词：输入性恶性疟 Pfdhfr基因 Pfmdr1基因 k13基因突变河南省

非洲输入恶性疟原虫青蒿素抗性分子标记k13突变及其种群遗传学研究

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非洲输入恶性疟原虫青蒿素抗性分子标记k13突变及其种群遗传学研究

作者：刘宏南京医科大学

学位级别：硕士

疟疾是全球危害最严重的传染病之一,其病原体是疟原虫。恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)是寄生于人体的五种疟原虫之一,其引发的恶性疟发病较急、症状较为严重,甚至导致死亡。非洲是最严重的疟疾流行区,我国目前无疟疾本地感染病例... 详细信息

疟疾是全球危害最严重的传染病之一,其病原体是疟原虫。恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)是寄生于人体的五种疟原虫之一,其引发的恶性疟发病较急、症状较为严重,甚至导致死亡。非洲是最严重的疟疾流行区,我国目前无疟疾本地感染病例。但近年来随着社会经济的发展,日趋频繁的国际间交流和贸易往来,由非洲输入我国的恶性疟病例居高不下,因此加强对非洲恶性疟原虫药物抗性的监测对我国疟疾防控工作具有重大意义。自2006年开始,WHO推荐全球以青蒿素为基础的联合用药(Artemisinin-based combination therapies,ACTs)作为一线抗疟药物来治疗恶性疟,ACTs的使用显著降低了疟疾发病率和死亡率。但是在2008年东南亚地区出现了青蒿素抗性虫株,目前已发展成东南亚地区严重的公共卫生问题。目前虽然非洲恶性疟原虫对青蒿素耐药的相关证据甚少,且以青蒿素为基础的一线复方药物对治疗非重症恶性疟仍然非常有效,但是非洲疟疾的高发病率和高死亡率,抗药性虫株可能成为疟疾防控工作最大的威胁,因此青蒿素耐药性监测至关重要。2014年,研究发现青蒿素抗性与k13-propeller(k13)基因有关,成为青蒿素抗性的分子标记用来监测青蒿素耐药性。本研究以来自非洲36个国家的1561份输入性恶性疟病例样本为研究对象,对青蒿素抗性分子标记k13基因进行多态性及药物选择压力分析,进一步通过微卫星标记分析选择性清除和种群遗传结构,还对可能出现药物选择压的地区的虫株进行遗传背景研究,为输入性恶性疟的临床合理用药提供科学依据,为监测青蒿素耐药恶性疟原虫的扩散提供参考。本研究内容分为三个部分:第一部分非洲输入恶性疟原虫青蒿素抗性标记分子k13突变分析目的:了解非洲输入恶性疟原虫青蒿素抗性分子标记k13基因的突变情况,并进行药物选择压力分析。方法:收集江苏省2011-2019年输入性恶性疟患者血样,对恶性疟原虫k13基因的kelch螺旋桨域进行PCR扩增并测序。应用DNAstar软件对所有双向测序序列依据峰图进行编辑和校对,用Bio Edit软件将样本序列与参考序列进行比对,应用Dna SP软件分析k13基因序列多态性及进行中性检验,应用MEGA软件计算非同义碱基替代率(d N)和同义碱基替代率(d S)。利用SPSS22.0软件进行数据的统计分析,计算各位点及不同地区、年份之间的k13突变率。结果:来自36个非洲国家的1561份输入性恶性疟样本的k13基因有89份共54个位点发生了突变,非同义突变有35个,同义突变有19个。在来自非洲中部地区的17份样本中检测出与青蒿素抗性相关的突变位点(M476I、A481V、G533A、G533S、N537I、I543T、M579I、M579V、C580Y、P667S、F673I),15例来自赤道几内亚,1例(C580Y)来自加蓬,1例(M579V)来自喀麦隆。来自非洲中部特别是赤道几内亚的样本k13基因非同义突变率及多态性水平均明显高于其他地区,d N/d S比值为3.187。各年份之间突变率的差异无统计学意义。结论:非洲大部分地区恶性疟原中k13基因呈多位点低频率突变,赤道几内亚恶性疟原虫k13基因的突变频率明显高于其他地区,发现多个可能跟青蒿素抗性相关的突变位点,而且d N/d S比值为3.187,可能受到药物选择压影响。第二部分非洲输入恶性疟原虫k13基因侧翼微卫星多态性分析目的:比较非洲各地区非同义突变株与野生株之间微卫星位点期望杂合度的差异,进一步分析恶性疟原虫k13基因是否受到选择性清除的影响。方法:对k13基因侧翼的10个微卫星位点进行分析,应用Gen Al Ex软件计算各群体的期望杂合度(Expected heterozygosity,He),并检验各群体之间He值的差异有无统计学意义,判定是否存在选择性清除。用Arlequin软件分析计算遗传分化系数Fst值,并应用Structure软件分析恶性疟原虫遗传结构。结果:恶性疟原虫五个微卫星位点平均等位基因个数为16.7,He平均值是0.831。对不同地理区域(非洲中部、非洲南部、非洲西部)以及样本来源比较多的国家(赤道几内亚、安哥拉、尼日利亚)的He比较分析,差异未发现具有统计学意义(P>0.05)。将样本按照是否突变(非同义突变株和野生株)和是否具有青蒿素k13抗性相关突变位点(青蒿素抗性相关突变株和野生株)进行分类,比较两者He,差异也不具有统计学意义(P>0.05)。对非洲中部及赤道几内亚、非洲南部及安哥拉、非洲西部的非同义突变株和野生株进行He分析,差异同样无统计学意义(P>0.05)。遗传结构分析显示非洲西部与非洲南部的遗传分化系数Fst值最大为0.028(P<0.05)。在不同国家之间安哥拉和尼日利亚Fst值最大为0.04

关键词：恶性疟原虫青蒿素抗性 k13基因药物选择压微卫星标记选择性清除抗性分子标记遗传背景