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hitail-pcr技术鉴定转基因猪整合位点的研究

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中国兽医学报 2010年第9期30卷 1235-1238页

作者：李莉李小平任林柱陈立梅王铁东张英闫森欧阳红生逄大欣吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062 北华大学基础医学院吉林吉林132013

采用高效热不对称交互式pcr(hitail-pcr)的方法,取转基因克隆猪血液,提取基因组作为模板,扩增目的片段,将扩增获得的特异性产物,连接到PGEM-T载体上,送测序公司测序。测序结果与载体序列经比对后,获得侧翼序列。将获得的侧翼序列提交Gen... 详细信息

采用高效热不对称交互式pcr(hitail-pcr)的方法,取转基因克隆猪血液,提取基因组作为模板,扩增目的片段,将扩增获得的特异性产物,连接到PGEM-T载体上,送测序公司测序。测序结果与载体序列经比对后,获得侧翼序列。将获得的侧翼序列提交GenBank与猪的基因组数据库比对确定了在基因组上的位置。结果表明目标序列整合到猪的15号染色体的基因组克隆(nw_00188566P4)中。该方法可以有效、快捷的鉴定外源基因在基因组中的整合的具体位置,具有良好的应用前景。

关键词： hitail-pcr 转基因猪整合位点

假单胞菌(Pseudomonas sp.)AT39突变体库的构建及反式茴脑利用相关基因(tao)的克隆

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基因组学与应用生物学 2022年第2期41卷 325-330页

作者：蒋琼黄罗冬华燕飞申佩弘广西大学生命科学与技术学院广西微生物与酶工程技术研究中心广西南宁530004 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室广西南宁530004

生物转化反式茴脑生成的苯丙素类芳香物质被视为天然原料,能广泛应用于食品加工、香料生产及医药等领域。以能代谢反式茴脑的假单胞菌(Pseudomonas sp.)AT39为出发菌株,采用转座子(pTnMod-RKm’)插入突变构建了含有6137个突变体的突变体... 详细信息

生物转化反式茴脑生成的苯丙素类芳香物质被视为天然原料,能广泛应用于食品加工、香料生产及医药等领域。以能代谢反式茴脑的假单胞菌(Pseudomonas sp.)AT39为出发菌株,采用转座子(pTnMod-RKm’)插入突变构建了含有6137个突变体的突变体库,筛选出44株反式茴脑代谢受影响的突变株。检测突变菌及野生菌的反式茴脑利用能力,发现突变菌AT39-15的反式茴脑代谢能力是野生菌的14%。利用hitail-pcr技术对突变菌AT39-15转座子侧翼序列扩增,获得插入突变的基因,测序结果显示基因大小为1047 bp,基因序列与恶臭假单胞菌(Pseudomonas sp.)JYR-1的反式茴脑氧化酶基因(tao)一致性达100%。研究结果为下一步构建基因工程菌提供了基因资源。

关键词：反式茴脑突变体库 hitail-pcr tao

‘南通小方柿’cDNA文库构建及DkGA2ox2调控因子的筛选

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分子植物育种 2022年第21期20卷 7082-7090页

作者：叶夏林曹丽芳董雨菡侯应军渠慎春南京农业大学园艺学院果树生物技术实验室南京210095

本研究利用酵母单杂技术筛选DkGA2ox2基因上游转录因子,为进一步研究其表达调控机制提供理论基础。利用hitail-pcr技术获得启动子序列,连入诱饵载体,转化进诱饵菌株。利用Gateway技术构建‘南通小方柿’cDNA文库,再共转化诱饵菌株,筛选... 详细信息

本研究利用酵母单杂技术筛选DkGA2ox2基因上游转录因子,为进一步研究其表达调控机制提供理论基础。利用hitail-pcr技术获得启动子序列,连入诱饵载体,转化进诱饵菌株。利用Gateway技术构建‘南通小方柿’cDNA文库,再共转化诱饵菌株,筛选得到转录因子。通过hitail-pcr共获得1205 bp启动子序列。构建的文库库容为1.4×107,插入片段大小在750~2000 bp间,重组率100%。初步筛选出HB蛋白、FLL3蛋白和EIN3/EIL1蛋白3个候选蛋白,为探索DkGA2ox2基因上游调控机制提供了理论支撑。

关键词： DkGA2ox2 hitail-pcr Gateway技术 cDNA文库酵母单杂

利用hitail-pcr技术鉴定T-DNA在RNAi-OsRhoGAP2水稻中的插入位点

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江苏农业科学 2018年第9期46卷 55-59页

作者：葛慧雯李佳佳王高华闫鑫甜安文静杜京尧石佳彭静静王美娜梁卫红河南师范大学生命科学学院河南新乡453007

水稻OsRhoGAP2基因是前期从幼穗cDNA文库中筛选获得的功能未知基因,采用DNA重组技术构建OsRhoGAP2基因RNA干扰载体,并转化水稻。对转基因水稻的表型分析显示,OsRhoGAP2基因RNA干扰水稻株高显著高于对照水稻。采用高效热不对称交错pcr法(... 详细信息

水稻OsRhoGAP2基因是前期从幼穗cDNA文库中筛选获得的功能未知基因,采用DNA重组技术构建OsRhoGAP2基因RNA干扰载体,并转化水稻。对转基因水稻的表型分析显示,OsRhoGAP2基因RNA干扰水稻株高显著高于对照水稻。采用高效热不对称交错pcr法(Hi TAIL-pcr)对RNAi-OsRhoGAP2转基因水稻T-DNA插入位点的侧翼序列进行分析,利用特异性嵌套引物扩增,结合序列对比分析,发现在4个不同的转基因水稻株系中,TDNA均插入到水稻OsRhoGAP2基因的第5个外显子内,本研究将为后续对该基因的功能鉴定提供重要依据。

关键词： OsRhoGAP2基因 hitail-pcr 侧翼序列 T-DNA 转基因水稻插入位点

转BtCry1Ac欧洲黑杨的外源基因插入位点分析及特异性检测

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林业科学 2020年第10期56卷 45-52页

作者：张磊胡建军林木遗传育种国家重点实验室国家林业和草原局林木培育重点实验室中国林业科学研究院林业研究所北京100091

【目的】分析转BtCry1Ac欧洲黑杨外源基因插入位点,从而进一步完善抗虫转基因杨树的背景信息,推进抗虫转基因杨树的安全评价及应用。【方法】以转BtCry1Ac欧洲黑杨株系n12、n222为试验材料,使用高效热不对称交错pcr法(hitail-pcr)分离... 详细信息

【目的】分析转BtCry1Ac欧洲黑杨外源基因插入位点,从而进一步完善抗虫转基因杨树的背景信息,推进抗虫转基因杨树的安全评价及应用。【方法】以转BtCry1Ac欧洲黑杨株系n12、n222为试验材料,使用高效热不对称交错pcr法(hitail-pcr)分离外源基因插入位点侧翼序列,比对毛果杨基因组序列确定插入位点。根据插入位点处的侧翼序列设计2对特异性pcr检测引物,建立转BtCry1Ac欧洲黑杨外源基因特异性pcr检测方法,并利用实时荧光定量pcr技术分析插入位点周边基因表达情况。【结果】pcr及半定量pcr结果表明,转基因欧洲黑杨株系的BtCry1Ac基因稳定表达。通过比对毛果杨基因组序列确定转基因杨n12 T-DNA插入基因组Chr15的10162773位点即Potri.015G076600第2个内含子,其碱基组成AT含量为65%;n222整合位点为基因组Chr01基因间隔区41596184位点,其碱基组成AT含量为69%。特异性pcr检测显示,n12能扩增出709 bp(转基因)和1159 bp(非转基因)特异性条带,n222及其与丹红杨杂交子代能扩增出1265 bp(转基因)和1827 bp(非转基因)特异性条带,而对照仅能扩增非转基因特异性片段。n12 T-DNA插入造成插入位点的丝氨酸蛋白激酶(SPK)Potri.015G076600基因表达量上调4.3倍,而附近的共济失调毛细血管扩张症突变蛋白(ATM)Potri.015G076700表达量下调20倍,从而可能调节杨树生长速度。n222插入位点上下游基因异黄酮-7-O-β-葡萄糖苷6″-O-丙二酰转移酶(IBG)Potri.001G395700和光敏色素互作因子解旋酶(PIF)Potri.001G395800表达量均上调。【结论】转BtCry1Ac欧洲黑杨T-DNA偏好插入富含AT区域,同时T-DNA载体边界序列缺失,并引起插入位点附近基因表达量变化。建立转BtCry1Ac欧洲黑杨特异性检测方法,为转BtCry1Ac欧洲黑杨的管理与监测提供参考。

关键词：欧洲黑杨抗虫基因 BtCry1Ac 转基因 hitail-pcr 侧翼序列事件特异性检测

维普期刊数据库评论

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小金海棠MxYSL5启动子克隆技术的比较

植物生理学报 2012年第1期48卷 95-101页

作者：陈竹王忆殷丽丽张新忠韩振海中国农业大学园艺植物研究所北京100193

分别利用3种基于pcr技术的染色体步移法克隆了小金海棠MxYLS5基因的启动子,并比较了这三个体系的扩增产物。3种体系都可以获得特异性扩增产物,但扩增条带的长度和数量均不同,其中利用Genome Walking Kit扩增出来的条带特异性较好长度最... 详细信息

分别利用3种基于pcr技术的染色体步移法克隆了小金海棠MxYLS5基因的启动子,并比较了这三个体系的扩增产物。3种体系都可以获得特异性扩增产物,但扩增条带的长度和数量均不同,其中利用Genome Walking Kit扩增出来的条带特异性较好长度最长,而且特异性引物和简并引物的设计及退火温度的设置对3种体系的扩增产物起着关键的作用。基于pcr技术的染色体步移法为小金海棠MxYLS5基因启动子的克隆提供了一个稳定可靠的技术手段。

关键词：启动子克隆染色体步移 Tail-pcr hitail-pcr 小金海棠

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富贵竹过氧化物酶全长基因的克隆与表达分析

安徽农业科学 2022年第11期50卷 89-93页

作者：陈春花张松陈苗胡汉桥薛迎斌广东海洋大学滨海农业学院广东湛江524088 国家耐盐碱水稻技术创新中心华南中心广东湛江524088 广东海洋大学化学与环境学院广东湛江524088

[目的]克隆富贵竹全长POD基因,检测富贵竹感染斯氏泛菌(Pantoea stewartii)后该基因的表达。[方法]用pcr克隆富贵竹(Dracaena sanderiana)POD部分基因,用hitail-pcr扩增该基因左右两侧序列。通过RT-pcr和qpcr确定POD基因在病原物侵染时... 详细信息

[目的]克隆富贵竹全长POD基因,检测富贵竹感染斯氏泛菌(Pantoea stewartii)后该基因的表达。[方法]用pcr克隆富贵竹(Dracaena sanderiana)POD部分基因,用hitail-pcr扩增该基因左右两侧序列。通过RT-pcr和qpcr确定POD基因在病原物侵染时的表达。[结果]获得一个长度为3419 bp的序列,登录号为MZ450796。经基因结构预测,该序列包含1个转录起始位点、加尾信号和4个外显子。进化树分析表明,该基因编码的氨基酸序列与芦笋POD的氨基酸序列一致性最高。接种P.stewartii后,POD基因的表达上调,3 d达最大值。[结论]克隆了富贵竹全长POD基因,确定了POD基因在富贵竹叶片中表达和结构预测的正确性;POD基因被P.stewartii诱导上调表达。

关键词：富贵竹过氧化物酶 hitail-pcr 斯氏泛菌

大丽轮枝菌致病缺陷型T-DNA插入突变体的筛选与鉴定

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棉花学报 2018年第1期30卷 29-37页

作者：崔伟业周雷单柳颖张君戴小枫郭维中国农业科学院农产品加工研究所北京100193

【目的】从大丽轮枝菌T-DNA突变体库中筛选鉴定致病缺陷型突变体并分析致病相关基因。【方法】将落叶型大丽轮枝菌菌株Vd991的294个T-DNA插入突变体在寄主棉花上进行致病力测定。利用Southern杂交和hitail-pcr(High-efficiency thermal ... 详细信息

【目的】从大丽轮枝菌T-DNA突变体库中筛选鉴定致病缺陷型突变体并分析致病相关基因。【方法】将落叶型大丽轮枝菌菌株Vd991的294个T-DNA插入突变体在寄主棉花上进行致病力测定。利用Southern杂交和hitail-pcr(High-efficiency thermal asymmetric interlaced pcr)技术分别对筛选获得的9个致病力显著降低的突变体进行拷贝数和侧翼序列分析。【结果】与接种野生型Vd991的棉花相比,接种突变体的棉花的病情指数极显著降低。Southern杂交表明其中1个突变体中T-DNA为双拷贝插入,其余8个突变体均为单拷贝插入。生物学特性分析发现T-DNA的插入导致这些突变体在生长速率和产孢量等方面与野生型Vd991相比均有不同程度的降低。Blast比对分析明确了这些突变体中T-DNA的插入位置和在基因组上的分布,并从野生型菌株Vd991中成功克隆得到了这些可能影响大丽轮枝菌致病力的相关基因。【结论】筛选和鉴定T-DNA插入突变是在全基因组范围内快速获得致病相关基因信息的1种有效方法,极大的促进了大丽轮枝菌的致病分子机制等研究,为进一步培育抗病棉花品种奠定了基础。

关键词：大丽轮枝菌致病力 T-DNA hitail-pcr 侧翼序列分析

转MSTN干扰载体细胞株的获得及外源基因整合情况的研究

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中国细胞生物学学报 2014年第7期36卷 906-912页

作者：刘丹佟慧丽李树峰常淑伟杨翠翠严云勤东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030

转基因细胞株的建立能够为转基因体细胞克隆技术奠定重要基础。该实验利用MSTN干扰载体,转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞,获得5个相应的转基因单克隆细胞株。采用Realtime pcr和高效热不对称互交式pcr(hitail-pcr)技术检测细胞克隆中MSTN表... 详细信息

转基因细胞株的建立能够为转基因体细胞克隆技术奠定重要基础。该实验利用MSTN干扰载体,转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞,获得5个相应的转基因单克隆细胞株。采用Realtime pcr和高效热不对称互交式pcr(hitail-pcr)技术检测细胞克隆中MSTN表达载体的拷贝数及其在牛基因组中的整合位点。结果表明,荧光定量pcr有效检测到5个细胞克隆中质粒的拷贝数分别为2.26±0.32、1.52±0.25、25.68±1.02、8.43±0.73和6.72±0.10。hitail-pcr对整合位点的检测结果表明,质粒片段在插入到基因组的过程中进行了重组,其与基因组的结点处有2或4个共同的碱基序列。该研究探索MSTN干扰载体在牛胎儿成纤维细胞中的整合机制,以期获得遗传背景清楚的转基因细胞作为体细胞核移植的重要材料,为高产转基因肉牛新品种的培育提供重要的理论和实验基础。

关键词： MSTN 转基因细胞株拷贝数整合位点 Real-time pcr hitail-pcr