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维氏气单胞菌hfq基因的敲除及其对滞留形成的影响

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维氏气单胞菌hfq基因的敲除及其对滞留形成的影响

作者：张霖海南大学

学位级别：硕士

hfq(Host factor of the RNA bacteriophage Qβ,简称 hfq)是细菌中普遍存在的全局调控因子,作为RNA分子伴侣,通过介导小RNA和信使RNA(sRNA-mRNA)的碱基配对影响其靶向转录物的翻译速率和寿命,涉及细菌的生长增殖、毒性和逆境耐受等多... 详细信息

hfq(Host factor of the RNA bacteriophage Qβ,简称 hfq)是细菌中普遍存在的全局调控因子,作为RNA分子伴侣,通过介导小RNA和信使RNA(sRNA-mRNA)的碱基配对影响其靶向转录物的翻译速率和寿命,涉及细菌的生长增殖、毒性和逆境耐受等多种生理生化过程。滞留菌指在遗传信息不发生改变的情况下逃避抗生素杀菌作用的细菌细胞。与耐药菌不同,滞留菌是一种处于休眠状态的表型变异细胞,几乎停止所有的生命活动,几乎对所有药物耐受。hfq对细胞生长的重要性,推测其可能与滞留形成相关。hfq相关的研究报道众多,但其在维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)中的研究尚未发现,且hfq关联滞留菌形成的实验只有大肠杆菌(Escherichia coli)背景下的少数案例报道。本论文基于维氏气单胞菌C4为背景,根据同源重组原理,构建维氏气单胞菌hfq突变株C4-Δhfq,并从转录水平证明敲除成功;接着检测C4-Δhfq的生长曲线及9种抗生素药物的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度(MC/MBC)。实验表明,hfq基因敲除显著延缓维氏气单胞菌的生长速率,并且敲除菌表现为抗生素易敏。hfq回补株Δhfq/pBBR-hfq表现出不同程度的功能回复。选择MIC/MBC中测定所得的四种维氏气单胞菌易敏抗生素:氯霉素、四环素、噻孢霉素和环丙沙星,测定抗生素药物敏感曲线,发现相较维氏气单胞菌野生型(WT),hfq敲除明显降低了滞留菌形成。继而利用实时定量PCR(RT-qPCR)检测clpB、oxyR、dnaK、rpoS、oppA、oppB、phoU、smpB、relE、recA、cspD 共11 个基因在Δhfq与WT中的转录水平。结果表明,相比于WT,Δhfq中的clpB、oxyR、rpo1S、relE、cspD基因表达水平显著下调,而oppB上调达到极显著,其余几个基因没有显著性变化。与之前的实验结果相印证,推测维氏气单胞菌中hfq通过多条细胞途径调节滞留的形成,敲除hfq会导致滞留形成水平的显著下降。本研究获得的hfq基因敲除菌株,有助于进一步研究维氏气单胞菌中hfq调控因子的功能及其调控机制。滞留菌的形成机制仍不明确,本研究通过证明维氏气单胞菌hfq敲除与滞留形成之间的相关性,提出细菌发生滞留的一种潜在调控机制;同时,鉴于hfq在细胞代谢中的重要作用,有理由推测其可成为治疗顽固性滞留致病菌的有力候选药物靶点。

关键词： hfq 滞留菌滞留形成抗生素药物维氏气单胞菌

沙门菌hfq依赖型小RNA GcvB靶基因trpE的鉴定

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中国兽医学报 2020年第9期40卷 1777-1782页

作者：潘永杨阳李晨刘丽娟杨琦贵州大学动物科学学院贵州贵阳550025 贵州大学动物疫病研究所贵州贵阳550025 贵州省畜禽资源遗传管理站贵州贵阳550025 都匀市动物疫病预防控制中心贵州都匀558000 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室贵州贵阳550025

trpE基因在鼠伤寒沙门菌中编码邻氨基苯甲酸合酶Ⅰ并参与氨基酸生物合成和代谢。为鉴定鼠伤寒沙门菌hfq依赖型小RNA GcvB所调控的基因trpE,本研究基于前期鼠伤寒沙门菌hfq基因敲除株及gcvB基因敲除株转录组分析基础上,利用Red同源重组... 详细信息

trpE基因在鼠伤寒沙门菌中编码邻氨基苯甲酸合酶Ⅰ并参与氨基酸生物合成和代谢。为鉴定鼠伤寒沙门菌hfq依赖型小RNA GcvB所调控的基因trpE,本研究基于前期鼠伤寒沙门菌hfq基因敲除株及gcvB基因敲除株转录组分析基础上,利用Red同源重组系统构建trpE基因lac融合菌株,并利用P22噬菌体转导技术构建gcvB和hfq基因单缺失和双缺失菌株,通过β半乳糖苷酶试验检测trpE基因在不同情况下蛋白表达活性,结合生物信息学系统TargetRNA2预测GcvB R1区与trpE mRNA的作用位点。结果表明,与野生型菌株相比,gcvB基因敲除导致trpE基因蛋白表达量增加1.2倍,hfq基因敲除后表达量增加1.1倍,而双敲除增加量仅为0.5倍。Target RNA2预测trpE mRNA与GcvB R1区可形成8个连续或18个不连续的碱基互补。以上结果表明trpE基因受GcvB和hfq调控,且极大可能受GcvB直接调控。本研究为鼠伤寒沙门菌GcvB的作用机理研究奠定理论基础,丰富了GcvB的靶基因数目。

关键词：鼠伤寒沙门菌小RNA hfq β半乳糖苷酶试验 trpE基因

hfq辅助sRNA N155介导维氏气单胞菌亮氨酸代谢并影响生物膜形成

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Hfq辅助sRNA N155介导维氏气单胞菌亮氨酸代谢并影响生物膜形成

作者：何金花海南大学

学位级别：硕士

维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)是一种新型病原菌,可使人-兽-鱼致病,其致病机理尚不完全清楚。hfq是RNA结合蛋白,协助小RNA(small RNA,又称作sRNA)介导基因转录后调控,扮演全局调控角色。现有研究表明,hfq对于病原菌***的致病性、毒... 详细信息

维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)是一种新型病原菌,可使人-兽-鱼致病,其致病机理尚不完全清楚。hfq是RNA结合蛋白,协助小RNA(small RNA,又称作sRNA)介导基因转录后调控,扮演全局调控角色。现有研究表明,hfq对于病原菌***的致病性、毒力等方面均具重要作用。本研究以hfq缺失株为研究对象,寻求hfq介导的信号通路变化,以便更好地理解hfq在***致病性调控中的功能。首先,采用转录组学和代谢组学多组学分析方法,发现hfq缺失导致亮氨酸生物合成相关基因ilvD上调以及细菌体内亮氨酸浓度增加,并导致生物膜形成缺陷。通过外源添加10 mM亮氨酸证明亮氨酸的积累对生物膜形成具有抑制活性。其次,通过转录组数据分析发现在hfq缺失株中显著下调的一段新型sRNAN155,通过同源双交换手段构建sRNAN155基因敲除菌株,证明该sRNA对细菌成膜、运动和氧化耐受能力产生影响,且表型均与hfq缺失株一致。最后,通过构建增强型绿色荧光报告基因(eGFP)融合表达载体,采用双质粒转化结合荧光检测方法证明,sRNAN155对ilvD具有负调控作用;并且通过点突变结合补偿性突变验证实验,证明sRNAN155与ilvD编码区1358 bp-1382 bp区域通过碱基配对结合,尤其1366-1372 bp处的结合最为重要,从而影响ilvD基因的转录水平。进一步通过外源添加10 mM亮氨酸检测hfq缺失株、sRNAN155缺失株成膜能力及泳动性,证实了亮氨酸存在会加强对菌株生物膜形成、泳动性的抑制。基于本研究的结果,我们提出hfq经由sRNAN155及其下游调控靶标ilvD,介导亮氨酸代谢影响生物膜形成的分子机制。在该机制中,hfq作为RNA分子伴侣协助sRNA N155参与ilvD转录后调控,hfq的缺失导致sRNAN155调控缺陷,ilvD转录水平上调并导致亮氨酸在细菌内积累,从而抑制了生物膜形成能力。本研究对于挖掘致病新靶点、设计合成新型药物具有重要意义,可为***致病机制研究提供新的思路和手段。

关键词：维氏气单胞菌 hfq ilvD sRNA 亮氨酸代谢

鼠伤寒沙门菌hfq依赖型sRNA GcvB对Ⅲ型分泌系统相关基因调控作用的研究

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中国畜牧兽医 2021年第12期48卷 4597-4606页

作者：段世宇杨阳张家莉潘永杨琦周碧君贵州大学动物科学学院贵阳550025 贵州省动物疫病研究室贵阳550025 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室贵阳550025

试验旨在研究鼠伤寒沙门菌伴侣蛋白hfq依赖型sRNA GcvB对spaP和invC基因mRNA所具有的调控作用。利用λ-Red同源重组技术构建spaP和invC基因LacZ融合菌株,并利用P_(22)噬菌体转导技术分别构建GcvB和hfq基因单缺失和双缺失菌株及GcvB功能... 详细信息

试验旨在研究鼠伤寒沙门菌伴侣蛋白hfq依赖型sRNA GcvB对spaP和invC基因mRNA所具有的调控作用。利用λ-Red同源重组技术构建spaP和invC基因LacZ融合菌株,并利用P_(22)噬菌体转导技术分别构建GcvB和hfq基因单缺失和双缺失菌株及GcvB功能区域缺失株,通过β-半乳糖苷酶活性试验测定在伴侣蛋白hfq、sRNA GcvB及hfq&GcvB缺失株中spaP和invC基因β-半乳糖核苷酶活性;实时荧光定量PCR测定spaP和invC基因mRNA表达量。结果显示,利用P_(22)噬菌体转导技术成功构建出ΔGcvB(696 bp)、Δhfq(2369 bp)、ΔGcvBΔhfq(2369/696 bp)、GcvBΔR1(757 bp)、GcvBΔR2(951 bp)、GcvBΔR3(986 bp)缺失株;β-半乳糖苷酶活性检测结果显示,与野生型菌株相比,spaP基因β-半乳糖核苷酶活性在缺失株GcvBΔR2、GcvBΔR3中极显著下调(Phfq、ΔGcvBΔhfq、GcvBΔR1中极显著上调(Phfq、ΔGcvBΔhfq中极显著上调(Phfq、ΔGcvBΔhfq和GcvBΔR1缺失菌株中转录水平极显著上调(Phfq、ΔGcvBΔhfq缺失菌株转录水平极显著上调(Phfq对invC和spaP基因存在一定的调控作用。本试验结果为sRNA GcvB及伴侣蛋白hfq调控提供了理论依据,丰富了GcvB的靶基因数目。

关键词：鼠伤寒沙门菌 sRNA 同源重组 hfq Ⅲ型分泌系统

hfq对伤寒沙门菌高渗应激早期的基因表达的调节

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Hfq对伤寒沙门菌高渗应激早期的基因表达的调节

作者：谢新民江苏大学

学位级别：硕士

目的:hfq是细菌一种RNA分子伴侣,能够调节细菌很多基因尤其是毒力相关基因的表达,在伤寒沙门菌中,细菌在高渗应激条件下很多毒力相关基因表达改变。本研究的目的是探讨伤寒沙门菌hfq调节因子在高渗应激条件下对基因表达的影响。方法:1.... 详细信息

目的:hfq是细菌一种RNA分子伴侣,能够调节细菌很多基因尤其是毒力相关基因的表达,在伤寒沙门菌中,细菌在高渗应激条件下很多毒力相关基因表达改变。本研究的目的是探讨伤寒沙门菌hfq调节因子在高渗应激条件下对基因表达的影响。方法:1.伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株制备。用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌hfq向基因缺陷变异株。根据伤寒沙门菌hfq基因序列设计引物,并在引物5'-末端加上需要的酶切位点,扩增hfq向基因上、下游同源性片段,定向连接成hfq基因缺损型同源核苷酸片段,并与自杀质粒pGMB151相连后,克隆至大肠埃希菌中,筛选阳性克隆,并对重组质粒进行测序鉴定,将阳性重质粒经电击法导入伤寒沙门菌野生株,进行同源重组,用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为hfq基因的缺陷变异株,并通过相应的核苷酸序列分析加以确定。2.全基因组芯片分析伤寒沙门菌转录表达谱。利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术,体外模拟高渗环境应激,在低渗(50 mmol/LNaCl)LB培养液中分别培养伤寒沙门菌野生株和hfq基因缺陷变异株4h(37℃,250 rpm)至对数生长期,然后加入NaCl达到终浓度300 mmol/L(高渗),继续培养30 min后,分别提取野生株和hfq基因缺陷变异株的总RNA,反转录成cDNA并标记荧光(cy3或cy5),与基因组芯片杂交,扫描后根据荧光信号分析各基因转录表达水平,比较伤寒沙门菌野生株和hfq基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达谱差异。3.在伤寒沙门菌hfq缺陷变异株中回补hfq基因。根据伤寒沙门菌hfq基因序列设计引物,用PCR扩增含启动子区域hfq基因,并将其与pBAD/gⅢ质粒定向连接,筛选重组质粒并进行测序鉴定,将阳性重组质粒经热击法导入伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株,作为hfq基因回补株,同时用pBAD空质粒导入伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株作为对照株。***-ompR双缺陷菌株变异株制备。将含hfq基因同源缺失片段的阳性重组自杀质粒pGMB151用电击法导入ompR缺陷菌株,进行同源重组,用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为hfq-ompR双缺陷菌株。***-PCR分析基因表达。选择部分芯片分析显示表达差异基因,设计并合成特异性引物,应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR),验证芯片分析结果;设计tviA基因特异性引物,qRT-PCR分析伤寒沙门菌野生型菌株、hfq基因缺陷变异菌株和hfq基因回补菌株分别在持续低渗、持续高渗和高渗应激环境中tviA的表达,以探查不同环境下hfq对tviA的调节作用;并进一步分析伤寒沙门菌野生型菌株、hfq基因缺陷变异菌株、ompR基因缺陷变异菌株和hfq-ompR双缺陷菌株在高渗应激下的tviA表达的变化,察看hfq和OmpR对tviA的调节是否存在联系。结果:***及序列分析证实,hfq基因缺陷变异株中hfq基因缺失了132bp,表明成功构建hfq基因缺陷变异株。2.基因表达谱比较分析结果表明伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株在高渗应激早期有62个基因表达上调,有32个基因表达下调。这些基因主要涉及侵袭蛋白、外膜蛋白、代谢酶类和一些未知功能的推测蛋白。部分差异表达基因经qRT-PCR验证,结果显示与基因芯片表达谱分析结果一致。***及序列分析证实hfq基因回补菌株及hfq-ompR双缺陷菌株制备成功。4.在高渗应激下hfq基因缺陷变异株中tviA表达上调,hfq基因回补菌株tviA表达与野生株接近,而在持续低渗和高渗条件下野生株和hfq基因缺陷变异株中tviA的表达水平相似。在高渗应激下hfq-ompR双缺陷菌株中的tviA的表达水平与hfq基因缺陷变异株中的基本一致。结论:hfq在伤寒沙门菌高渗应激条件下对基因表达调节及侵袭力的提高等发挥重要作用;伤寒沙门菌在高渗应激后hfq能抑制tviA基因的表达,而在稳态高渗下没有作用;伤寒沙门菌hfq在高渗应激下对tviA的调节与OmpR无直接相关。

关键词：伤寒沙门菌 hfq tviA 基因芯片高渗应激

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hfq蛋白在布鲁氏菌胞内生存中作用的研究

Hfq蛋白在布鲁氏菌胞内生存中作用的研究

作者：崔明全四川农业大学

学位级别：硕士

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患传染病,能侵害多种家畜、野生动物、以及人类等,在世界各地广泛分布,对人类健康和经济发展构成严重威胁。布鲁氏菌是一种胞内寄生菌,无质粒和外毒素等毒力元件,胞内生存和复制是布鲁氏菌主要... 详细信息

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患传染病,能侵害多种家畜、野生动物、以及人类等,在世界各地广泛分布,对人类健康和经济发展构成严重威胁。布鲁氏菌是一种胞内寄生菌,无质粒和外毒素等毒力元件,胞内生存和复制是布鲁氏菌主要的毒力特征,而适应胞内环境又是布鲁氏菌实现胞内生存的关键。hfq (host factor for RNA phage Qβ replicase)是一个高度保守的RNA结合蛋白,已测序的细菌中近一半存在hfq蛋白。hfq蛋白是一种转录调控因子,具有RNA伴侣分子的活性,能够与富含A/U的RNA序列紧密结合。hfq主要生物学功能是通过结合RNA来影响其稳定性或者是通过辅助sRNA (small non-coding RNA)与mRNA结合来调节靶基因的表达。已有研究表明,hfq蛋白是细菌中重要的转录后整体调控子,能同时调控大量靶标基因的表达,进而在包括致病在内的多个细胞过程中发挥整体调控作用。结合其它病原菌hfq研究现状和布鲁氏菌的自身特点,我们推测布鲁氏菌hfq蛋白可能通过影响靶基因的表达发挥重要调节功能,进而在布鲁氏菌适应胞内恶劣环境及胞内生存中发挥重要作用。因此,深入研究hfq的功能以及寻找受hfq调控的蛋白和基因,将有助于布鲁氏菌致病机制的研究。为了分析hfq蛋白在布鲁氏菌胞内生存中的作用,并寻找hfq调控的靶基因,我们首先构建了hfq缺失突变株和互补株。基于同源重组的基因突变原理,以KmR(卡那抗性盒)替代了布鲁氏菌中的hfq基因,构建了布鲁氏菌的hfq缺失突变株16MAhfq。随后,将hfq基因克隆至能够在布鲁氏菌内复制的pBBR1-MCS5载体上,构建了互补质粒,将该互补质粒转入到突变株中,得到相应的互补菌株16M△hfq-C。用半定量RT-PCR的方法对构建的突变株和互补株进行验证,结果表明突变株中没有hfq基因的转录活性,而互补株中hfq的转录活性得到恢复,表明突变株和互补株构建成功。hfq缺失株和互补株的构建为布鲁氏菌hfq的相关研究奠定了基础。成功构建了hfq突变株和互补株以后,对野生株、hfq突变株和互补株的相关表型进行了比较,分析hfq的缺失对布鲁氏菌表型的影响,尤其是与胞内生存相关的表型。首先分析了hfq对布鲁氏菌生长速度的影响,根据菌液的光密度(OD;optical density)值,绘制了16M、16M△hfq、16M△hfq-C的生长曲线。结果显示,与野生株16M相比,16M△hfq突变株的生长速度明显减慢,而互补株的生长速度和野生株一致。结果提示hfq与布鲁氏菌的生长代谢有关。巨噬细胞内生存和繁殖是布鲁氏菌致病的关键,巨噬细胞内环境中包含多种杀(抑)菌物质,而布鲁氏菌必须适应这种环境才能在胞内生存和繁殖。因此,我们分析了16M△hfq突变株在模拟巨噬细胞内生存环境的多种体外胁迫条件下的生存能力,包括：高渗透压、氧压、低pH、热应激。实验结果表明：在各种体外刺激条件下,16M△hfq突变株的生存率均低于野生株,而互补株的生存率则与野生株接近。结果提示hfq与布鲁氏菌适应环境压力相关,在适应胞内的恶劣环境中发挥一定作用。为了明确hfq蛋白与布鲁氏菌的胞内生存和毒力的关系,我们又分析了16M△hfq突变株在巨噬细胞和小鼠体内的生存能力。实验结果表明,16M△hfq突变株虽然可以入侵巨噬细胞并在小鼠的脾脏细胞内生存,但生存能力明显减弱,提示hfq对于布鲁氏菌在宿主细胞内的复制,长期生存以及建立慢性感染是必须的。该结果进一步证实了hfq与布鲁氏菌的胞内生存和毒力密切相关。hfq蛋白作为转录后调节因子,主要通过调节靶基因的表达来发挥整体调控作用。因此,我们第四章的工作是利用DNA芯片转录谱和比较蛋白质组分析,分别从全基因组和蛋白水平鉴定hfq调控的靶基因,并对这些基因的功能进行阐述,为hfq调控网络的研究提供靶标基因。首先,利用RT-PCR分析了物在模拟巨噬细胞内环境的体外不同刺激条件下的转录水平,确定了hfq体外高效表达的条件。结果显示,在酸性基础培养基(GEM4.0)中hfq转录水平最高。然后,我们利用布鲁氏菌的全基因组芯片,比较分析了16M△hfq突变株与16M野生株在hfq基因高表达条件下(GEM4.0)转录谱的差异。结果显示,当hfq基因缺失后,共有359个基因的转录变化在2倍以上,占羊布鲁氏菌16M全部编码基因的11%。这些差异表达的基因主要涉及物质转运和代谢,转录、翻译、膜功能、胞内运输及分泌等。此外,利用双向电泳-质谱的蛋白质组学研究方法比较了16M和16M△hfq在hfq基因高表达条件下全菌蛋白表达差异。结果表明,hfq基因缺失后,布鲁氏菌的蛋白表达也发生了明显的变化。这些差异表达的蛋白主要包括：转运和代谢相关蛋白、翻译后修饰和分子伴侣、外膜蛋白

关键词：羊种布鲁氏菌 hfq 胞内生存毒力比较蛋白质组比较转录组

不同碳源对溶藻弧菌黏附相关表型的影响初探及hfq对其的调控

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海洋科学 2016年第11期40卷 99-107页

作者：邓益琴赵哲刘松林陈偿中国科学院南海海洋研究所中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室广东广州510301 中国科学院南海海洋研究所广东省应用海洋生物学重点实验室广东广州510301 中国科学院南海海洋研究所西沙、南沙深海海洋环境观测研究站广东广州510301 中国科学院大学北京100049

为探讨不同碳源对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)黏附相关表型的影响及hfq对其的调控作用,研究了D-葡萄糖、D-麦芽糖、D-海藻糖和D-果糖对溶藻弧菌ZJ-T野生株、hfq缺失株及回补株的运动性、菌落形态、鞭毛、胞外多糖及生物膜合成的影... 详细信息

为探讨不同碳源对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)黏附相关表型的影响及hfq对其的调控作用,研究了D-葡萄糖、D-麦芽糖、D-海藻糖和D-果糖对溶藻弧菌ZJ-T野生株、hfq缺失株及回补株的运动性、菌落形态、鞭毛、胞外多糖及生物膜合成的影响。研究结果显示,4种碳源均使溶藻弧菌群集运动(swarmming)显著增强(Phfq正调控;游动性(swimming)显著减弱(Phfq调控;菌落变得褶皱,并受hfq负调控;4种碳源不影响溶藻弧菌鞭毛及胞外多糖合成,但D-果糖使其生物膜合成减少,并受hfq负调控。实验分析表明:4种碳源可能通过调控溶藻弧菌黏性阻力及能量代谢来调控其运动性;并可能通过调控胞外多糖分子结构及理化性质影响其菌落形态;另外,D-果糖在调控生物膜形成过程中具有重要作用;因此,添加不同碳源会影响溶藻弧菌黏附相关表型,可能影响其致病性,但具体调控机制需进一步研究。

关键词：碳源溶藻弧菌 hfq 黏附相关表型

hfq对霍乱弧菌环境适应能力的影响及相关基因的转录调控

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Hfq对霍乱弧菌环境适应能力的影响及相关基因的转录调控

作者：陈秀琴青岛大学

学位级别：硕士

目的构建霍乱弧菌C7258菌株的hfq基因的缺失株和缺失回补株,分析hfq蛋白对霍乱弧菌环境适应能力的影响,验证hfq对环境生存及致病相关基因转录的调控。方法***方法扩增霍乱弧菌C7258菌株hfq基因的上、下游片段,作为上和下游同源臂,搭桥... 详细信息

目的构建霍乱弧菌C7258菌株的hfq基因的缺失株和缺失回补株,分析hfq蛋白对霍乱弧菌环境适应能力的影响,验证hfq对环境生存及致病相关基因转录的调控。方法***方法扩增霍乱弧菌C7258菌株hfq基因的上、下游片段,作为上和下游同源臂,搭桥PCR方法扩增将上、下游同源臂连接。搭桥PCR片段和自杀质粒pWM91分别进行双酶切,之后用连接酶进行连接,获得重组自杀质粒△hfq-pMW91,转化入大肠杆菌SM10λpir株。采用同源重组方法,通过结合将自杀质粒△hfq-pMW91转入霍乱弧菌C7258菌株,利用庆大霉素和氨苄青霉素双抗平板和口pWM91质粒的sacB基因在蔗糖平板上杀死供体菌的方法构建霍乱弧菌C7258菌株的hfq基因的缺失株,并进行PCR鉴定。***方法扩增hfq基因,获得完整的基因片段△fhq-C,将△fhq-C片段和(?)pUC18克隆载体分别进行XbaI和HidⅢ限制性内切酶双酶切,连接酶连接2酶切产物,转化入大肠杆菌SM10λpir菌株中,获得重组克隆载体△hfq-C-pUC18。将△hfq-C-pUC18重组克隆载体电转入△hfq缺失株中,获得△hfq-C回补株,筛选阳性克隆病用PCR鉴定。***方法扩增hfq基因,获得hfq-P片段,限制性内切酶BamHI和HIDⅢ分别双酶切hfq-P片段和表达载体pET28a,将酶切产物连接,转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,获得hfq蛋白表达株hfq-P-BL21(DE3),经IPTG诱导,进行12%SDS-PAGE蛋白电泳。4.通过对野生株、突变株、回补株在富氧、缺氧、胆盐、M9环境下的生长状态,从初始培养到平台期整个过程,每隔1小时测定D600mm,重复三次,用平均值绘成生长曲线,统计学方法比较差异;将野生株、突变株、回补株点在Swim平板上,30℃培养24小时,观察细菌的游动能力,光学显微镜观察野生株、突变株、回补株菌落的透明度及褶皱程度,对野生株、突变株、回补株培养24小时进行结晶紫染色,并测定D570nm;野生株和突变株对不同浓度的去污剂SDS及庆大霉素的抗性能力比较及应对H2O2刺激的敏感性测定,从而比较霍乱弧菌野生株和hfq突变株在营养受限条件下细菌的生长状况,细菌的运动能力、生物膜形成、外膜抗性和氧化应激能力上的差异。5.针对霍乱弧菌△hfq缺失株表型实验结果,推测可能的相关调控基因,并提取霍乱弧菌野生株和缺失株的RNA,应用荧光定量PCR(RT-qPCR)技术对hfq可能调控的相关基因的转录水平进行比较,靶基因涉及鞭毛合成,胞外多糖合成,外膜蛋白,整体调控子以及氧化应激相关。结果1.通过基因敲除-同源重组技术成功构建了霍乱弧菌C7258菌株的△hfq缺株。2.通过融合PCR技术和电转化技术成功构建了霍乱弧菌△hfq缺失株的△hfq-C/△hfq回补株。3.通过融合PCR技术和钙转化技术成功构建了大肠杆菌hfq-P-BL21(DE3)-DH5αλpir蛋白表达株。***蛋白激活与鞭毛合成及功能相关基因fliA,flaA,flaC,motA,motX转录从而增强霍乱弧菌的游动能力;但hfq蛋白不调控galU和galE的转录,提示hfq蛋白不影响霍乱弧菌的脂多糖结构;hfq蛋白抑制胞外多糖的合成基因vpsT和vpsA转录,同时抑制VPS合成的转录调节子vpsR转录,达到抑制生物膜形成的作用。***蛋白激活外膜蛋白OmpU和OmpT转录,起到提高外膜抗性能力。***蛋白抑制katE和sodC的转录,激活ohoB和katG的转录,相对作用的最终结果是hfq蛋白提高抵御氧化应激的能力。***蛋白作为sRNA伴侣分子可能与phoB,HapR,ToxR等调控子一起,协同控制上述基因的表达,从而使霍乱弧菌感知外界环境变化以抵御不利环境而生存下去。结论hfq蛋白作为RNA伴侣分子,能够通过调控一些生存及致病相关基因的转录进而影响霍乱弧菌的游动性、生物膜形成、氧化应激反应、抗生素抗性等能力,表明hfq可能与其它调控子一起,在霍乱弧菌的生存、代谢以及致病因子转录的协调控制上起着关键性的作用。

关键词：霍乱弧菌 hfq 同源重组环境适应转录调控

固氮施氏假单胞菌RNA分子伴侣蛋白hfq与碳代谢抑制蛋白Crc在碳代谢途径中的协同作用

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固氮施氏假单胞菌RNA分子伴侣蛋白Hfq与碳代谢抑制蛋白Crc在碳代...

作者：柯琪西南科技大学

学位级别：硕士

微生物在多种碳源存在的情况下,优先选择优势碳源而抑制非优势碳源的利用,这种现象称为碳代谢物抑制。在假单胞菌中,全局调控因子Crc被认为是参与碳代谢抑制调控的核心蛋白,可通过与靶标基因的mRNA互作进而发挥调控作用。近年来,有研究... 详细信息

微生物在多种碳源存在的情况下,优先选择优势碳源而抑制非优势碳源的利用,这种现象称为碳代谢物抑制。在假单胞菌中,全局调控因子Crc被认为是参与碳代谢抑制调控的核心蛋白,可通过与靶标基因的mRNA互作进而发挥调控作用。近年来,有研究认为RNA分子伴侣hfq参与了Crc与靶标mRNA的分子互作,hfq可通过与mRNA分子的互作进而调节其稳定性目前关于两种不同的学术观点仍存在争议,而hfq和Crc在固氮菌中的研究尚未见报道。固氮施氏假单胞菌A1501分离自水稻根际,如何高效利用根际环境中复杂的碳源对该菌的根际定殖及环境适应至关重要,但是该菌中Crc与hfq蛋白在碳源利用调控过程中的功能及其协同作用缺乏分子证据。本研究在实验室已有hfq突变株和crc突变株基础上,通过hfq和crc双突变株的构建,重点分析了hfq和Crc在混合碳源利用中的生理生化表型,初步研究了hfq及Crc在碳代谢调控中的作用机制,取得了以下结果:1、研究了hfq和Crc蛋白在碳代谢途径中的生物学功能。分别测定了hfq和crc单突变株和双突变株在单一碳源及混合碳源(优势碳源与非优势碳源混合)条件下的生长能力,结果发现,在优势碳源(乳酸钠和琥珀酸)为单一碳源条件下,突变株与野生型的生长能力均无显著差异,而在两种非优势碳源(苯甲酸和葡萄糖)为唯一碳源条件下,crc和hfq单突变株生长能力显著下降,而双突变株基本不能生长。在优势碳源乳酸钠与非优势碳源苯甲酸混合培养条件下,crc和hfq单突变株生长能力增强,而双突变株生长能力较弱。以上结果表明,在非优势碳源存在的情况下(无论单一碳源或混合碳源),crc和hfq双突变株产生的表型变化水平都显著强于单突变株,暗示两者可能存在功能上的叠加。以苯甲酸代谢为研究对象,通过实时定量RT-PCR分析了苯甲酸存在条件下(单一、混合碳源)苯甲酸降解关键基因的表达变化,结果表明,与野生型和单突变株相比,crc和hfq双突变株中苯甲酸代谢基因benA、benR、benK表达量显著下调。根据以上结果,推测在A1501菌中,hfq和Crc在碳源代谢途径中发挥着协同作用。2、采用原核表达体系表达纯化了Crc和hfq蛋白,并通过微量热涌动实验(MST)检测了Crc和hfq蛋白与靶标分子BenR(苯甲酸降解调控基因)的mRNA的体外互作。结果显示,hfq可与苯甲酸降解调控基因benR特异性结合。说明hfq参与了以Crc为主要调控蛋白的碳代谢抑制途径。3、施氏假单胞菌A1501中hfq和crc基因的同时突变并不影响菌株在LB培养基中的生长。在低氨、微好氧条件下的固氮酶活测定显示hfq和crc基因突变后施氏假单胞菌A1501的固氮酶活明显下降。并且氮代谢调控基因(nifA、nifK、glnA、glnK)表达量都发生下调。与此同时hfq和crc基因突变后使A1501丧失趋化能力,说明hfq和Crc在A1501的固氮过程中同时发挥重要的功能,从而影响其它代谢途径。综上所述,施氏假单胞菌A1501调控蛋白Crc与hfq在碳代谢抑制调控中存在协同作用,同时Crc与hfq蛋白可能以某种未知的调控方式协同参与了该菌固氮、逆境胁迫及运动等生理过程。本研究为施氏假单胞菌A1501的碳氮代谢调控网络研究奠定了重要的理论基础。

关键词：固氮施氏假单胞菌A1501 Crc hfq 协同作用