Hfq辅助sRNA N155介导维氏气单胞菌亮氨酸代谢并影响生物膜形成

作     者：何金花 

作者单位：海南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘柱

授予年度：2021年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

主      题：维氏气单胞菌 hfq ilvD sRNA 亮氨酸代谢 

摘      要：维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)是一种新型病原菌,可使人-兽-鱼致病,其致病机理尚不完全清楚。Hfq是RNA结合蛋白,协助小RNA(small RNA,又称作sRNA)介导基因转录后调控,扮演全局调控角色。现有研究表明,Hfq对于病原菌***的致病性、毒力等方面均具重要作用。本研究以hfq缺失株为研究对象,寻求Hfq介导的信号通路变化,以便更好地理解Hfq在***致病性调控中的功能。首先,采用转录组学和代谢组学多组学分析方法,发现hfq缺失导致亮氨酸生物合成相关基因ilvD上调以及细菌体内亮氨酸浓度增加,并导致生物膜形成缺陷。通过外源添加10 mM亮氨酸证明亮氨酸的积累对生物膜形成具有抑制活性。其次,通过转录组数据分析发现在hfq缺失株中显著下调的一段新型sRNAN155,通过同源双交换手段构建sRNAN155基因敲除菌株,证明该sRNA对细菌成膜、运动和氧化耐受能力产生影响,且表型均与hfq缺失株一致。最后,通过构建增强型绿色荧光报告基因(eGFP)融合表达载体,采用双质粒转化结合荧光检测方法证明,sRNAN155对ilvD具有负调控作用;并且通过点突变结合补偿性突变验证实验,证明sRNAN155与ilvD编码区1358 bp-1382 bp区域通过碱基配对结合,尤其1366-1372 bp处的结合最为重要,从而影响ilvD基因的转录水平。进一步通过外源添加10 mM亮氨酸检测hfq缺失株、sRNAN155缺失株成膜能力及泳动性,证实了亮氨酸存在会加强对菌株生物膜形成、泳动性的抑制。基于本研究的结果,我们提出Hfq经由sRNAN155及其下游调控靶标ilvD,介导亮氨酸代谢影响生物膜形成的分子机制。在该机制中,Hfq作为RNA分子伴侣协助sRNA N155参与ilvD转录后调控,hfq的缺失导致sRNAN155调控缺陷,ilvD转录水平上调并导致亮氨酸在细菌内积累,从而抑制了生物膜形成能力。本研究对于挖掘致病新靶点、设计合成新型药物具有重要意义,可为***致病机制研究提供新的思路和手段。