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中国兽医科学 2006年第5期36卷 362-365页

作者：王彬唐志芬齐岩孙凌霜王君伟东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030

从pMD18-T-ha阳性质粒扩增了H9N2亚型禽流感病毒的ha2基因,将扩增到的 ha2基因克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A中。将其与杆状病毒共转染于Sf9昆虫细胞,经蚀斑筛选纯化重组杆状病毒,用其感染Sf9昆虫细胞,并优化表达条件。SDS-P... 详细信息

从pMD18-T-ha阳性质粒扩增了H9N2亚型禽流感病毒的ha2基因,将扩增到的 ha2基因克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A中。将其与杆状病毒共转染于Sf9昆虫细胞,经蚀斑筛选纯化重组杆状病毒,用其感染Sf9昆虫细胞,并优化表达条件。SDS-PAGE和 Western-blotting分析表明,表达产物的分子质量约为27 ku。Dot-ELISA分析表明,表达的ha2 融合蛋白可与鸡抗H9N2亚型血清发生特异性反应,而与H5和H7亚型抗血清间无交叉反应。

关键词：禽流感病毒 H9N2亚型 ha2基因重组杆状病毒抗原性

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H3N2亚型猪流感病毒ha1、ha2基因的原核表达及抗原性分析

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中国畜牧兽医 2016年第10期43卷 2762-2767页

作者：宋玉慧王翔宇王洁琼潘梦梦张剑刘琳李新生河南农业大学牧医工程学院郑州450002

血凝素(hemagglutinin,ha)蛋白是猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的一个重要蛋白,在疾病预防和治疗中具有重要作用。本试验旨在克隆和表达H3N2亚型猪流感病毒A/swine/Henan/1/2010(H3N2)的ha1和ha2基因。用含有H3N2亚型SIV的鸡胚尿囊液提取RNA,RT-PCR扩增后将目的基因定向克隆到pET-28a(+)原核表达载体上,并将其转入宿主菌BL21(DE3)pLyS进行表达,IPTG诱导后经SDS-PAGE检测并用该病毒重组ha蛋白制备的特异性单克隆抗体1C10作为一抗对两种蛋白进行Western blotting分析。SDS-PAGE结果显示,得到ha1和ha2大小分别为34.8、23.2ku的重组蛋白,Western blotting结果表明,ha1蛋白与1C10单克隆抗体具有良好的反应原性,且1C10单克隆抗体表位在ha1蛋白上。本试验结果为进一步研究血凝素蛋白的结构和功能,以及建立快速诊断方法和基因工程疫苗提供材料。

关键词： H3N2亚型猪流感病毒 ha1基因 ha2基因原核表达

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H9N2亚型AIV ha2基因在重组杆状病毒和毕赤酵母菌中的表达

H9N2亚型AIV HA2基因在重组杆状病毒和毕赤酵母菌中的表达

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作者：王彬东北农业大学

学位级别：硕士

禽流感(Aivan Influenza，AI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的传染性疾病综合症。低致病力禽流感常引起呼吸道症状，产蛋量下降。1994年首次报道H9N2亚型AIV在中国流行，并且已成为中国现有AIV的主要亚型。近几年发现，H9N2亚型AIV不... 详细信息

禽流感(Aivan Influenza，AI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的传染性疾病综合症。低致病力禽流感常引起呼吸道症状，产蛋量下降。1994年首次报道H9N2亚型AIV在中国流行，并且已成为中国现有AIV的主要亚型。近几年发现，H9N2亚型AIV不仅感染禽类，还感染猪和人。因此，开展对禽流感病毒H9N2亚型的研究，加强对H9N2亚型AIV的监控，不仅在病毒学、兽医学等学科上有重要的学术意义，而其公共卫生等方面也具有重大的社会意义。本试验根据GenBank所发表的ha基因的cDNA序列，利用Primer5.0软件，参照昆虫细胞杆状病毒表达系统的质粒图谱，设计一对引物，以本实验室所保存的pMD18-T-ha2阳性质粒为模板扩增出ha2基因，命名为Bha2。将其克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A的BamH Ⅰ和Sal Ⅰ之间的多克隆位点上，命名为pBlueBacHis2A-Bha2。纯化该重组质粒并与杆状病毒共转染Sf9昆虫细胞，5d后获得重组病毒，名为P1。将经过3轮噬斑筛选纯化P1接种Sf9细胞大量繁殖后收获，PCR鉴定结果为完全纯化的病毒命名为P2。接种P2于Sf9单层细胞上，4d后收获病变细胞，经SDS-PAGE电泳鉴定，表达产物Bha2融合蛋白分子量约为27KU，与理论值相符。该表达产物的Western-blotting和Dot-ELISA结果表明其可与鸡抗H9N2亚型血清发生特异性抗原反应，而与H5和H7亚型抗血清间无交叉反应。同时参照毕赤酵母表达系统pPIC9K质粒图谱设计引物，扩增出ha2基因，命名为Yha2。将其克隆至毕赤酵母转移载体pPIC9K的SnaB Ⅰ和Not Ⅰ之间的多克隆位点上构建重组质粒pPIC9K-Yha2。将其sal Ⅰ线性酶切，电转化将其整合到毕赤酵母菌GS115染色体上，利用MD平板筛选His阳性克隆;用含不同浓度G418-YPD平板筛选高拷贝转化子;利用PCR法筛选Mut阳性克隆。将筛选到的高拷贝进行BMMY摇瓶培养，甲醇诱导表达重组蛋白。表达产物经SDS-PAGE和Western-blotting分析，重组目的蛋白得到表达，相对分子量为35KD，较理论值27KU大，由于ha2存在糖基化位点，分析为糖基化所致。 ha2基因在昆虫细胞杆状病毒表达系统和毕赤酵母表达系统成功获得了表达，并且分析具有作为检测抗原检测H9N2亚型AIV感染的条件，为H9N2亚型AIV诊断方法的建立奠定了基础。

关键词：禽流感病毒 ha基因 ha2基因重组杆状病毒毕赤酵母

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牙龈卟啉单胞菌血凝集素黏附结构域ha2基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化

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遵义医学院学报 2019年第4期42卷 378-382页

作者：曾凤娇杨琳刘建国田源陈靖白国辉遵义医科大学研究生院贵州遵义563099 贵州省普通高等学校口腔疾病研究特色重点实验室贵州遵义563099 贵阳市口腔医院贵州贵阳550002

目的在原核表达质粒pET21a-ha2成功构建的基础上,诱导目的基因在大肠杆菌中表达,进行表达产物的纯化及鉴定。方法原核表达质粒pET21a-ha2经PCR鉴定后,转入大肠杆菌Rosetta感受态细胞诱导筛选,经SDS-PAGE电泳检测,IPTG诱导表达。通过包... 详细信息

目的在原核表达质粒pET21a-ha2成功构建的基础上,诱导目的基因在大肠杆菌中表达,进行表达产物的纯化及鉴定。方法原核表达质粒pET21a-ha2经PCR鉴定后,转入大肠杆菌Rosetta感受态细胞诱导筛选,经SDS-PAGE电泳检测,IPTG诱导表达。通过包涵体的变复性、Millipore超滤系统的滤浓缩、Ni-TA层析分离纯化ha2蛋白。结果原核表达质粒pET21a-ha2转化大肠杆菌经IPTG诱导后,成功表达ha2蛋白,大小约15 kD,与预计目的蛋白大小相同。ha2纯化蛋白浓度为0.449 mg/mL,经测序与NCBI蛋白数据库比对无突变。结论pET21a-ha2可在大肠杆菌中成功表达,并成功得到纯化的ha2蛋白。

关键词：原核表达质粒 ha2基因包涵体纯化

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新型沙门菌载体递送H9N2亚型禽流感病毒ha2抗原的分子免疫机制研究

新型沙门菌载体递送H9N2亚型禽流感病毒HA2抗原的分子免疫机制研究

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作者：王占楠吉林农业大学

学位级别：硕士

禽流感(Avian influenza,AI)因其高致病性导致禽类大批量死亡,不但给我国养禽业造成了巨大的经济损失,而且严重威胁人类的公共卫生安全。迄今为止,控制禽流感的最有效的方法仍是接种疫苗,但由于该病毒的高突变性,普通的传统疫苗很难达... 详细信息

禽流感(Avian influenza,AI)因其高致病性导致禽类大批量死亡,不但给我国养禽业造成了巨大的经济损失,而且严重威胁人类的公共卫生安全。迄今为止,控制禽流感的最有效的方法仍是接种疫苗,但由于该病毒的高突变性,普通的传统疫苗很难达到理想的免疫效果,所以,对禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)疫苗的研究成为国内外学者的研究热点。本研究选择AIV的血凝素(Hemagglutinin,ha)颈部的一段高度保守的序列ha2片段,并将其与粘膜免疫佐剂大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(Escherichia coli heat-labile enterotoxin,LTB)基因融合,分别将ha2基因与ha2-LTB融合基因导入到延迟裂解型沙门菌载体中,构建两组重组沙门菌并对其免疫效果进行初步评价。具体研究内容及结果如下:(1)重组沙门菌χ11218(pYA4545-ha2)和χ11218(pYA4545-ha2-LTB)制备及反应原性分析本试验运用现代分子生物学技术,经PCR扩增目的基因、目的基因与载体连接转化、双酶切鉴定等方法构建了重组质粒pYA4545-ha2和pYA4545-ha2-LTB;通过脂质体转染细胞和Western-Blot等方法验证了ha2及ha2-LTB蛋白能够成功表达,并能够与抗体特异性结合,具有良好的免疫原性;再将重组质粒最终导入到沙门菌χ11218中,获得重组沙门菌χ11218(pYA4545-ha2)和χ11218(pYA4545-ha2-LTB),并验证其对阿拉伯糖具有依赖性,为下一步实验奠定基础。(2)重组沙门菌χ11218(pYA4545-ha2)和χ11218(pYA4545-ha2-LTB)免疫保护效果比较与评价将实验小鼠分为5组,每组15只。分别将成功制备的χ11218(pYA4545-ha2)和χ11218(pYA4545-ha2-LTB)两组沙门菌和本实验室已经构建的χ11218(pYA4545)沙门菌免疫小鼠,共口服免疫4次,同时设置对照组与H9N2亚型禽流感灭活疫苗组。最后一次加强免疫后一周,通过流式细胞术(Flow cytometry,FCM)和间接ELISA方法检测免疫效果;通过滴鼻攻毒实验,观察小鼠的生命体征、体重变化及生存情况;攻毒两周后,取各组小鼠肺组织,制成病理切片,通过HE染色比较各组病理变化。进一步对两组重组沙门菌的免疫保护作用进行评价。结果显示,小鼠口服免疫新型沙门菌χ11218(pYA4545-ha2)和χ11218(pYA4545-ha2-LTB),能够增加CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞数量,促进T细胞分化,提高CD3+CD4+T细胞分泌的IL-4、IL-17和IFN-r的水平,对CD3+CD8+T细胞分泌IFN-γ也有一定的促进作用,还能提高树突细胞CD40、CD80和MHCⅡ的表达量,而且对B细胞分泌型IgA的表达也有一定的影响。与Control组及χ11218(pYA4545)组相比较,重组沙门菌组和灭活疫苗组,血清中细胞因子及特异性抗体IgG浓度较高,肠道灌洗液中的特异性抗体IgA含量也相对较高。针对沙门菌LPS特异性抗体的检测中,重组沙门菌χ11218(pYA4545-ha2)、χ11218(pYA4545-ha2-LTB)及χ11218(pYA4545)组均有较高浓度的LPS抗体。感染流感病毒后,各组小鼠体重变化趋势基本相同,攻毒的前7天,各组体重均不同程度下降,在第8天达到最低,从第9天起,各组小鼠体重均逐渐恢复,最后趋于稳定。通过对小鼠肺指数及肺指数抑制率的计算,说明重组沙门菌χ11218(pYA4545-ha2)和χ11218(pYA4545-ha2-LTB)对H9N2型禽流感具有抵抗作用。肺脏病理切片结果显示χ11218(pYA4545-ha2)组、χ11218(pYA4545-ha2-LTB)组和灭活疫苗组肺组织相对完整,病理症状较轻。以上结果中,虽然重组沙门菌组的免疫效果较疫苗组差,但同样证实了递送ha2及ha2-LTB基因的延迟裂解型沙门菌对H9N2亚型流感病毒具有较好的保护作用。说明ha2能够作为作为禽流感病毒疫苗的靶标基因,同时发现ha2融合LTB能够增强机体对禽流感病毒的抵抗作用,以上结果为延迟裂解性沙门菌作为疫苗活载体提供了理论依据,为禽流感分子免疫机制的研究奠定了基础。

关键词：禽流感延迟裂解型沙门菌 ha2基因 ha2-LTB基因

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乳酸菌pSIP409-pgsA-3M2e-ha2的制备及其抗H9N2亚型禽流感免疫效果的研究

乳酸菌pSIP409-pgsA-3M2e-HA2的制备及其抗H9N2亚型禽流感免疫效...

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作者：赵亮吉林农业大学

学位级别：硕士

禽流感(Avian influenza,AI)是全球范围内广为流行的禽类急性高度传染性疾病之一,近几十年来不仅给我国的养禽业造成了重大的经济损失、而且引起威胁人类健康的严重公共卫生学问题。目前,接种疫苗仍然是控制禽流感的最有效的方法,由于... 详细信息

禽流感(Avian influenza,AI)是全球范围内广为流行的禽类急性高度传染性疾病之一,近几十年来不仅给我国的养禽业造成了重大的经济损失、而且引起威胁人类健康的严重公共卫生学问题。目前,接种疫苗仍然是控制禽流感的最有效的方法,由于传统的疫苗多为灭活疫苗,虽安全性较好、但其免疫效果不理想,所以研制新型的口服黏膜免疫的通用型微生物制剂将具有更广阔的应用前景。本研究选用乳酸菌作为外源蛋白的递送载体,将禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的血凝素基因ha2与主要保护性抗原M2e蛋白基因融合在一起,研制了ha2融合M2e基因的重组新功能型乳酸菌并对其免疫效果进行初步评价。具体研究内容及结果如下:(1)乳酸菌p SIP409-pgs A-3M2e-ha2、p SIP409-pgs A-ha2的制备及反应原性分析本文通过酶切、连接、转化等方法制备了两个重组质粒p SIP409-pgs A-3M2e-ha2和质粒p SIP409-pgs A-ha2。将该质粒电转入受体菌植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NC8中,并用诱导肽Spp IP诱导表达,利用Western blotting分析乳酸菌表达蛋白的反应原性,结果表明新功能型乳酸菌p SIP409-pgs A-3M2e-ha2和p SIP409-pgs A-ha2所表达的外源蛋白均具有良好的反应原性,为下一步实验奠定基础。(2)乳酸菌pSIP409-pgsA-3M2e-ha2和pSIP409-pgsA-ha2免疫保护效果比较与评价将实验雏鸡分6组,每组20只。分别将已成功制备的p SIP409-pgs A-3M2e-ha2和p SIP409-pgs A-ha2两组乳酸菌和本实验室已经构建的p SIP409-pgs A-3M2e和的p SIP409-pgs A共四种乳酸菌对雏鸡进行初次免疫和加强免疫,同时设计空白对照组与H9N2亚型禽流感灭活疫苗组。初免从21天开始,连续3天,间隔14天之后加强免疫,连续3天。间隔3天后杀鸡取样,通过流式细胞术和淋巴细胞增殖检测各组雏鸡脾脏中的T淋巴细胞的活化与增殖情况,从而来检测新功能型乳酸菌对雏鸡的免疫保护效果。此外,分别收取各组雏鸡的血清和气管灌洗液,并用间接ELISA方法检测雏鸡特异性的Ig G抗体和分泌型抗体SIg A(Secretory immunoglobulin A,SIg A)的表达水平。雏鸡加强免疫后一周后通过滴鼻方式感染鹤源和鸭源两种不同源的H9N2亚型禽流感病毒,攻毒后观察雏鸡的精神状态并记录雏鸡的体重变化。攻毒后10天宰杀雏鸡并取肺脏和喉头,制成病理切片,通过HE染色观察并比较肺脏和喉头病理变化。更进一步检测并评价新功能型乳酸菌对雏鸡的免疫保护效果。结果显示,雏鸡口服免疫新功能型乳酸菌p SIP409-pgs A-3M2e-ha2、p SIP409-pgs A-ha2和p SIP409-pgs A-3M2e后雏鸡的脾脏中的T淋巴细胞数量相比空白对照组显著增高,其中p SIP409-pgs A-3M2e-ha2组和p SIP409-pgs A-ha2组差异极显著(P2e-ha2组和p SIP409-pgs A-ha2组差异极显著(P2e-ha2组和p SIP409-pgs A-ha2组雏鸡先呈现精神不振、采食量下降等状态,但随后逐渐恢复正常,而空白对照组则持续呈现发病状态。感染两种病毒后雏鸡体重变化规律基本相同,结果显示p SIP409-pgs A-3M2e-ha2和p SIP409-pgs A-ha2组雏鸡体重开始逐渐下降,第6天达到最低,随后体重开始增加,而空白对照组雏鸡体重持续下降。肺脏及喉头病理切片结果显示p SIP409-pgs A-3M2e-ha2和p SIP409-pgs A-ha2组雏鸡的病理症状较轻。以上结果表明新功能型乳酸菌对H9N2亚型流感病毒的不同毒株均有保护作用,并且p SIP409-pgs A-3M2e-ha2和p SIP409-pgs A-ha2乳酸菌的免疫保护效果更好。说明ha2作为禽流感病毒的血凝素的保守抗原针对不同的禽H9N2亚型流感病毒都有较强的保护效果,同时发现了共表达M2e基因的融合新功能型乳酸菌更能增强机体抵抗AIV攻击的能力,以上结果为研制抗禽流感的新功能型微生态制剂提供了理论依据。

关键词：禽流感乳酸菌 ha2基因 M2e基因免疫效果

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