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牛传染性鼻气管炎病毒gc蛋白单克隆抗体的制备与初步应用

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畜牧兽医学报 2013年第10期44卷 1637-1644页

作者：马辉边传周王永芬王鲜萍郑宝亮赵绪永郑州牧业工程高等专科学校生物工程系郑州450011 河南大学生命科学学院开封475001

为制备牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gc蛋白的特异性单克隆抗体,并分析其免疫学特性,以原核表达并纯化的重组gc蛋白为免疫原注射免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合。建立间接ELISA方法筛选分泌gc蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,获得... 详细信息

为制备牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gc蛋白的特异性单克隆抗体,并分析其免疫学特性,以原核表达并纯化的重组gc蛋白为免疫原注射免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合。建立间接ELISA方法筛选分泌gc蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,获得1株能稳定分泌gc蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3D6。3D6的亚类为IgG1型,轻链为κ链;上清、腹水抗体效价分别为6.4×103、1.28×105;Western blot和间接免疫荧光试验表明该单克隆抗体能识别牛gc蛋白。利用3D6细胞株分泌的单克隆抗体建立了检测IBRV的双抗体夹心ELISA方法,结果证明,该方法特异性和敏感性良好,为快速诊断IBRV和研究gc蛋白功能奠定了基础。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒 gc蛋白单克隆抗体 ELISA

用重组腺病毒免疫方法制备伪狂犬病病毒gc蛋白单克隆抗体

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中国兽医科学 2007年第8期37卷 684-689页

作者：陈振海杨金先宋铁英刘晓东林天龙福建省农业科学院生物技术研究所福建福州350003

将表达伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）gc基因的重组腺病毒经肌肉免疫BALB/c小鼠,测试了重组腺病毒免疫小鼠制备抗目的蛋白单克隆抗体的效果。ELISA分析表明,BALB/c小鼠接种重组腺病毒后能产生针对gc蛋白的特异性抗体。给BALB/... 详细信息

将表达伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）gc基因的重组腺病毒经肌肉免疫BALB/c小鼠,测试了重组腺病毒免疫小鼠制备抗目的蛋白单克隆抗体的效果。ELISA分析表明,BALB/c小鼠接种重组腺病毒后能产生针对gc蛋白的特异性抗体。给BALB/c小鼠用大肠杆菌表达的gc融合蛋白MBP-gc-NC加强免疫后第3 d,取小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG4000作用下进行杂交融合,经筛选、克隆,获得了3株稳定分泌抗PRV gc蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1B4、1H4和2C8。单抗特性分析结果表明,1B4、2C8属IgG2a亚类,1H4属IgG1亚类;腹水抗体的ELISA效价为1∶2×10^5～1∶2×10^6;3株单抗都具有间接免疫荧光试验（IFA）和免疫印迹试验（Western-blotting）反应特性,能够特异地识别PRV gc蛋白。证实重组腺病毒免疫可用于制备目的蛋白单克隆抗体,为制备单抗提供了一种新的方法。

关键词：重组腺病毒伪狂犬病病毒 gc蛋白单克隆抗体

鸡传染性喉气管炎病毒gc蛋白的多抗制备、细胞定位及功能研究

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畜牧兽医学报 2014年第8期45卷 1309-1316页

作者：孙永珍赵妍崔红玉王云峰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽呼吸道病创新团队哈尔滨150001 哈尔滨动物生物制品国家工程研究中心有限公司哈尔滨150001

为制备对鸡传染性喉气管炎具有诊断应用价值的抗体,并研究鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)gc蛋白在LMH细胞内的分布及gc蛋白对病毒在细胞间传播过程中的作用,本研究以ILTV—LJS09毒株基因组为模板,应用PCR方法扩增gc基因的主要抗原性片段,... 详细信息

为制备对鸡传染性喉气管炎具有诊断应用价值的抗体,并研究鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)gc蛋白在LMH细胞内的分布及gc蛋白对病毒在细胞间传播过程中的作用,本研究以ILTV—LJS09毒株基因组为模板,应用PCR方法扩增gc基因的主要抗原性片段,并克隆至原核表达载体pET-32a(+)构建pET-32a—gc质粒,经IPTG诱导表达并纯化,获得His—gc重组蛋白,免疫新西兰大白兔制备抗血清。Western blot结果表明,所制备的兔抗-ILTV gc抗体能与纯化的His—gc蛋白发生特异性反应且能检测到内源性gc蛋白。间接免疫荧光试验结果表明,所制备的兔抗ILTV-LJS09 gc蛋白的多抗能与ILTV LJS09、HLJ0507、MDJ0442、SD0203、Zhj1298毒株反应,特异性良好。采用获得的抗gc抗体观测LJS09-gc蛋白在LMH细胞内的分布,发现gc蛋白主要存在于病毒感染细胞的胞质和胞膜上,细胞核和未感染的细胞中没有gc蛋白。利用抗体中和ILTV gc蛋白的试验结果表明,gc蛋白可能直接参与病毒在细胞间传播,从而影响病毒蚀斑的形成。本研究成功制备了具有诊断价值的兔抗ILTV-LJS09 gc蛋白的多克隆抗体,并证实LJS09 gc蛋白在分布及功能上具有a-疱疹病毒的保守性,为gc蛋白生物学特性和ILTV感染机制的研究提供了重要数据。

关键词： ILTV gc蛋白多克隆抗体细胞定位功能

基于原核表达鸭瘟病毒gc蛋白建立的表面等离子共振检测技术的研究

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中国兽医科学 2020年第12期50卷 1509-1514页

作者：徐超王超群段志刚张子宏李轲郑州海关技术中心河南郑州450003 许昌海关河南许昌461000 郑州市动物卫生监督所河南郑州450000

本研究旨在应用表面等离子共振技术(surface plasmon resonance,SPR)建立鸭瘟血清的SPR检测方法。PCR扩增鸭瘟g C基因全长,亚克隆于原核表达载体pET32a中,诱导、表达、纯化鸭瘟g C蛋白,将其作为捕获蛋白偶联芯片,建立了鸭瘟的SPR检测方... 详细信息

本研究旨在应用表面等离子共振技术(surface plasmon resonance,SPR)建立鸭瘟血清的SPR检测方法。PCR扩增鸭瘟g C基因全长,亚克隆于原核表达载体pET32a中,诱导、表达、纯化鸭瘟g C蛋白,将其作为捕获蛋白偶联芯片,建立了鸭瘟的SPR检测方法。敏感性、特异性和实用性分析结果显示,该SPR方法仅与鸭瘟阳性血清有明显反应,而对鸭流感病毒、番鸭细小病毒、传染性喉气管炎病毒、小鹅瘟病毒、马立克病毒、鸭源沙门菌和鸭源大肠杆菌等血清为阴性反应;倍比稀释鸭瘟阳性血清,SPR的灵敏度可达0.1?g;对留存的19份疑似鸭瘟血清的SPR检测与商业化ELISA的检测结果完全一致。上述结果表明,本研究建立的表面等离子共振技术具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、样品免标记等特点,适用于鸭瘟血清的快速检测。

关键词：鸭瘟原核表达 gc蛋白表面等离子共振检测

裂谷热病毒gc蛋白主要抗原区的表达、纯化及鉴定

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中国动物传染病学报 2015年第1期23卷 15-20页

作者：夏鹏沈丽魏建超钟登科陆莹梅李蓓蓓刘珂邵东华邱亚峰温贵兰马志永贵州大学动物科学学院贵阳550025 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 上海农林职业技术学院动物科学技术系上海201600

根据裂谷热病毒(Rift valley fever virus,RVFV)M基因(Gen Bank登录号:DQ380206)序列,用PCR方法扩增其主要抗原区,将目的基因克隆至原核表达质粒p ColdⅠ中,将重组质粒转化到BL21感受态细胞中,诱导表达重组蛋白,将表达蛋白利用His-tag N... 详细信息

根据裂谷热病毒(Rift valley fever virus,RVFV)M基因(Gen Bank登录号:DQ380206)序列,用PCR方法扩增其主要抗原区,将目的基因克隆至原核表达质粒p ColdⅠ中,将重组质粒转化到BL21感受态细胞中,诱导表达重组蛋白,将表达蛋白利用His-tag Ni柱进行亲和层析纯化。纯化后的蛋白分别应用SDS-PAGE、Western blot方法鉴定,结果显示,本研究不仅成功表达出gc蛋白的主要抗原区,而且具有良好抗原性,为后续裂谷热抗原ELISA试剂盒的研制奠定了物质基础。

关键词：裂谷热病毒 gc蛋白原核表达抗原性

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暴发性肝衰竭时血清gc蛋白的变化及意义

国外医学（流行病学．传染病学分册） 1996年第2期23卷 56-58页

作者：王小红顾长海第三军医大学西南医院传染病中心

血清gc蛋白又称维生素D结合蛋白,是细胞外肌动蛋白清除系统的重要组成部分,主要合成于肝脏,半衰期较短,在血清中以天然蛋白、与25-羟-维生素D及肌动蛋白结合等形式存在(后者所占比例甚少)。当细胞损伤致细胞内肌动蛋白大量外释时,gc迅... 详细信息

血清gc蛋白又称维生素D结合蛋白,是细胞外肌动蛋白清除系统的重要组成部分,主要合成于肝脏,半衰期较短,在血清中以天然蛋白、与25-羟-维生素D及肌动蛋白结合等形式存在(后者所占比例甚少)。当细胞损伤致细胞内肌动蛋白大量外释时,gc迅速与之结合成更多的gc:肌动蛋白复合物,并使gc水平降低,它是反映肝细胞坏死和肝脏储备能力的可靠指标,对患者的预后判断具有重要的参考价值。

关键词：肝疾病暴发性血清检验肝功能衰竭 gc蛋白

猪伪狂犬病毒gB和gc蛋白B细胞表位编码序列的融合表达及活性测定

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河南农业科学 2016年第1期45卷 119-123页

作者：张冲刘芳赵东邓瑞广张改平李学伍河南科技大学动物科学技术学院河南洛阳471003 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002 河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002

依据猪伪狂犬病毒g B和g C蛋白的B细胞表位编码序列,分别设计g B和g C蛋白B细胞表位编码序列的融合扩增引物,利用融合PCR技术,将g B和g C蛋白B细胞表位编码序列有机地融合为g B-C表位编码序列。将融合基因片段插入到原核表达载体p ET28a... 详细信息

依据猪伪狂犬病毒g B和g C蛋白的B细胞表位编码序列,分别设计g B和g C蛋白B细胞表位编码序列的融合扩增引物,利用融合PCR技术,将g B和g C蛋白B细胞表位编码序列有机地融合为g B-C表位编码序列。将融合基因片段插入到原核表达载体p ET28a,并转化大肠杆菌BL21(DE3),1.0 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白g B-C能够高效表达,重组蛋白的分子质量约为38 ku;经Western blot鉴定分析,小鼠抗His标签单克隆抗体和PRV阳性血清均能识别表达的重组蛋白。表明成功表达了融合蛋白g B-C,且表达的重组蛋白具有较好的免疫学活性。

关键词：猪伪狂犬病毒 gB蛋白 gc蛋白 B细胞表位融合表达

表达SFTSV Gn/gc蛋白重组狂犬病病毒的构建与免疫原性研究

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表达SFTSV Gn/Gc蛋白重组狂犬病病毒的构建与免疫原性研究

作者：傅倩芸山东大学

学位级别：硕士

背景:SFTS（Severe fever with thrombocytopenia syndrome）是由 SFTSV（SFTSvirus,SFTS病毒）引起的以发热和血小板减少为典型临床特征的自然疫源性人兽共患传染病。2009年该病在中国首次被发现,该病病原体是一种可感染人类并致死的... 详细信息

背景:SFTS（Severe fever with thrombocytopenia syndrome）是由 SFTSV（SFTSvirus,SFTS病毒）引起的以发热和血小板减少为典型临床特征的自然疫源性人兽共患传染病。2009年该病在中国首次被发现,该病病原体是一种可感染人类并致死的新型布尼亚病毒,该病毒除感染人之外,还可以感染牛、羊、猪、狗、猫等家畜和鼠、鼩鼱等啮齿类动物。现在尚没有公认的特异性治疗方法,更无批准的人和动物的SFTSV疫苗。狂犬病病毒（rabies virus,RABV）感染引起的狂犬病（Rabies）是全球流行、危害严重的人兽共患传染病,病死率高达100%。我国是全球第二大狂犬病高发区,仅次于印度。全球每年因RABV感染的病犬传播造成的狂犬病死亡人数约5.9万,造成86亿美元的经济损失,严重危害人类健康。消除人类狂犬病最为经济有效的措施就是主动免疫,通过动物大规模接种狂犬病疫苗消除犬狂犬病,进而显著降低人类狂犬病发病率。鉴于SFTSV和RABV都是家养动物的常见人兽共患病原体,因此,研制一种安全、高效、经济的二联疫苗保护动物健康,具有非常重要的公共卫生学意义。目的:1.将SFTSV的保护性抗原Gn和gc基因分别插入至RABV SAD（Street Alabama Dufferln）株基因组的假基因区,构建表达SFTSV Gn和gc蛋白的重组狂犬病病毒SAD-Gn和SAD-gc。2.检测SAD-Gn和SAD-gc重组病毒的生物学特性、免疫原性、安全性和保护性,评价SAD-Gn和SAD-gc作为二联重组活载体疫苗的潜力。方法:1.构建表达SFTSV Gn/gc蛋白的重组狂犬病病毒SAD-Gn和SAD-gc,通过RT-PCR、荧光抗体染色和Western blot实验鉴定重组病毒的生物学特性。2.安全性评价,免疫小鼠后,在21d观察期内,检测小鼠饮食、外形和体重,评价重组病毒SAD-Gn和SAD-gc的安全性。3.免疫原性评价,分离第2、4、6、8周的血清,利用荧光抗体病毒中和试验（FAVN）和终点法中和试验分别检测RABV中和抗体效价和SFTSV中和抗体效价,检测重组病毒SAD-Gn和SAD-gc的免疫原性。***攻毒保护实验,重组病毒SAD-Gn和SAD-gc免疫小鼠21d后,肌肉注射RABV固定毒CVS-24,在观察期21d内,记录小鼠发病状况和死亡情况,评价重组病毒SAD-Gn和SAD-gc对RABV的保护作用。***攻毒保护实验,重组病毒SAD-Gn和SAD-gc免疫小鼠4周后,肌肉注射攻毒SFTSV,7d后分离小鼠脾脏,分析病理损伤并利用荧光探针法qRT-PCR检测SFTSV病毒载量,评价重组病毒SAD-Gn和SAD-gc对SFTSV攻毒的保护作用。结果:1.通过RT-PCR、荧光抗体染色和Western blot实验均检测到SFTSV Gn蛋白和RABV G蛋白的表达,RT-PCR实验检测到SFTSV gc蛋白表达,且分子量与预期大小相符。2.中和抗体水平检测结果显示,SAD-Gn和SAD-gc重组病毒能诱导小鼠产生强烈的体液免疫,SAD-Gn组4周时中和抗体效价达到峰值,RABV中和抗体效价为4.13 IU/ml,SFTSV中和抗体效价为1:277;SAD-gc组6周时中和效价达到峰值,RABV中和抗体为4.97 IU/ml,SFTSV中和抗体效价为1:256。3.在21 d观察期内,与空白组和SAD对照组相比,SAD-Gn和SAD-gc重组病毒对小鼠饮食和体重影响较小,未出现任何狂犬病病症。***攻毒保护实验结果显示,攻毒后观察期结束时,空白组小鼠均出现典型的狂犬病病症,存活率为0,RT-PCR结果显示,死亡小鼠死于RABV的感染。SAD组、SAD-Gn组和SAD-gc组小鼠未出现任何异常病症,小鼠存活率为100%。***-PCR检测SFTSV病毒载量结果显示,与空白组和SAD组相比,SAD-Gn和SAD-gc重组病毒组SFTSV核酸定量明显减少。SAD-Gn组SFTSV核酸定量最少。结论:1.成功构建表达SFTSV Gn和gc蛋白的重组狂犬病病毒SAD-Gn和SAD-gc。***-Gn和SAD-gc重组病毒在小鼠体内可诱导小鼠产生强烈的免疫应答,保护小鼠抵抗RABV致死性攻击,对SFTSV攻毒起到一定保护作用。为进一步研制预防狂犬病和SFTS的二联疫苗奠定了基础。

关键词：狂犬病病毒 SFTS病毒 Gn蛋白 gc蛋白反向遗传学二联疫苗

伪狂犬病毒不同毒株间gc蛋白的抗原差异性研究

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伪狂犬病毒不同毒株间gC蛋白的抗原差异性研究

作者：刘春晓中国农业科学院

学位级别：硕士

伪狂犬病（PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的一种对养猪业危害极大的传染病。2011年下半年,PRV变异株在我国免疫猪群中开始流行。本实验室率先分离到变异株,命名为He N1株。研究表明接种现有疫苗株不能使易感动物... 详细信息

伪狂犬病（PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的一种对养猪业危害极大的传染病。2011年下半年,PRV变异株在我国免疫猪群中开始流行。本实验室率先分离到变异株,命名为He N1株。研究表明接种现有疫苗株不能使易感动物获得对变异株的完全保护,血清中和试验显示疫苗株Bartha-K61与HeN1株之间存在明显的抗原差异。gc蛋白是PRV重要的中和性抗原,其变异可能会导致疫苗株免疫猪体后产生的中和抗体不能对PRV变异株进行有效的中和。因此我们利用酵母表面展示技术获取疫苗株Bartha-K61与变异株HeN1 gc蛋白的抗原区,来探究毒株间的抗原性差异。为了解PRV变异株的流行及变异情况,2016～2017年间,对来自安徽、河北、山东等省份的大中型猪场送检的疑似PRV病料进行PCR检测,鉴定出16份PRV阳性病料,对其gc、gE基因进行序列分析,两者氨基酸序列与2012年以来的变异株的相应氨基酸序列同源性分别为98.2%00%与99.3～100%,与经典株的相应氨基酸序列同源性相对较低,分别为92.5%4.8%与95.3%9.1%。变异株的gE蛋白均在第48位和第492位各插入1个天冬氨酸,在gc蛋白的64～70位处连续插入7个氨基酸,分离株具有与变异株相同的分子标记,并且分离的16株PRV与GenBank下载的近年来国内报道的PRV变异毒株在系统进化树上处于同一分支,与经典株位于不同分支,表明HeN1株仍是目前PRV流行毒株的代表毒株。本研究利用DNase I将疫苗株Bartha-K61与变异株He N1的gc基因随机酶切成100～250 bp的小片段,然后连接到酵母展示载体pCTCON2中,将连接产物电转入大肠杆菌DH5α中构建随机的酵母展示文库。提取两个文库的质粒并电转入制备的酿酒酵母EBY-100感受态中进行培养诱导。用抗Bartha-K61与抗HeN1株的猪阳性血清分别对两个诱导表达后的酵母文库进行染色,通过流式细胞仪对阳性酵母进行经两轮分选富集,提取富集后阳性酵母的质粒进行测序分析,通过分析克隆的分布及个数来绘制抗原区图谱。结果显示,HeN1-gc蛋白的主要抗原区位于A1区（23-152位aa）、次要抗原区位于A3区（337-487位aa）、非抗原区位于A2区（153-336位aa）;Bartha-K61-gc蛋白的主要抗原区位于B1区（23-130位aa）、次要抗原区位于B2区（131-222位aa）、非抗原区位于B3区（223-480位aa）。将两毒株gc蛋白的各抗原区片段进行酵母展示表达与原核表达,进行流式分析与ELISA分析,结果验证了两毒株gc蛋白的各抗原区的抗原特性,抗原区与血清交叉分析表明两毒株gc蛋白的主抗原区的抗原性差异不大,次要抗原区的抗原性存在差异,非抗原区与血清交叉分析存在一定的抗原性,本研究推测PRV两毒株gc蛋白之间的抗原差异性可能与氨基酸的同源性关系较小,而与病毒自身的调控有关。综上所述,本研究利用酵母展示技术将构建的疫苗株Bartha-K61与变异株HeN1的gc蛋白抗原文库展示于酵母表面,筛选并鉴定了两毒株gc蛋白的主抗原区与次抗原区,以上研究为揭示PRV毒株间的变异及免疫逃避的机制提供基础。

关键词：伪狂犬病毒 gc蛋白酵母表面展示技术抗原差异性