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法螺g型溶菌酶重组蛋白的原核表达及抑菌活性探究

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海洋科学 2022年第10期46卷 32-42页

作者：贾慧霞张华张成龙何毛贤刘文广中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室广东省应用海洋生物学重点实验室中国科学院南海海洋研究所广东广州510301 中国科学院大学北京100049 南方海洋科学与工程广东省实验室(广州) 广东广州511458 三沙市海洋和渔业局海南三沙573199

g型溶菌酶(g-type lysozyme,***)是一种富含半胱氨酸的天然免疫因子,在无脊椎动物的免疫防御过程中起重要作用。本研究旨在通过揭示法螺(Charonia tritonis)g型溶菌酶(***)重组蛋白的抑菌功能,为进一步认识法螺的分子免疫机理及病害防... 详细信息

g型溶菌酶(g-type lysozyme,***)是一种富含半胱氨酸的天然免疫因子,在无脊椎动物的免疫防御过程中起重要作用。本研究旨在通过揭示法螺(Charonia tritonis)g型溶菌酶(***)重组蛋白的抑菌功能,为进一步认识法螺的分子免疫机理及病害防治提供新思路。首先对***序列进行了分析,利用实时荧光定量PCR检测***的组织分布,然后以pgEX-4T-1为表达载体,构建重组质粒***,进行重组蛋白表达,并检测了重组蛋白的抑菌活性。结果显示:1)*** cDNA的5′非翻译区(UTR)为66 bp,3′UTR为186 bp,开放阅读框为789 bp,编码262个氨基酸,有1个可溶性转糖苷酶(SLT)结构域(72~255 aa),包含6个半胱氨酸残基和3个酶活性催化位点(glu72、Asp85、Asp96);2)多序列比对及系统发育分析表明,***与亲缘关系较近的福寿螺g型溶菌酶氨基酸的同源性最高;3)***在所有被检测组织中均表达,其中在肝脏、外套膜表达量较高;4)16℃,0.5 mmol/L IPTg诱导表达10 h后,重组蛋白在上清液和包涵体均表达分子量约为51.91 kDa,纯化后得到浓度为1.2 mg/mL的重组蛋白;5)抑菌实验表明,重组蛋白***具有抗金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus、藤黄微球菌Micrococcus luteus、施罗氏弧菌Vibrio shilonii的活性,对革兰氏阳性细菌的抑菌作用大于革兰氏阴性细菌。研究结果为进一步解析法螺免疫防御的分子机理提供了参考数据和科学依据。

关键词：法螺 g型溶菌酶原核表达抑菌活性

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七鳃鳗g型溶菌酶的分子特征和抗菌活性

中国生物化学与分子生物学报 2015年第5期31卷 495-504页

作者：赵春晖徐玮冯斌刘欣李庆伟辽宁师范大学生命科学学院辽宁省生物技术与分子药物研发重点实验室辽宁大连116081 大连医科大学生物技术系辽宁大连116044 辽宁师范大学七鳃鳗研究中心辽宁大连116081

溶菌酶是先天免疫系统中对抗细菌病原体感染的一种关键蛋白.本研究从七鳃鳗中克隆g型溶菌酶基因.其酶基因c DNA为701 bp(gen Bank序列号KP204854),开放阅读框为555 bp,编码由184个氨基酸组成的多肽,理论分子质量为20.24 k D,等电点为5.... 详细信息

溶菌酶是先天免疫系统中对抗细菌病原体感染的一种关键蛋白.本研究从七鳃鳗中克隆g型溶菌酶基因.其酶基因c DNA为701 bp(gen Bank序列号KP204854),开放阅读框为555 bp,编码由184个氨基酸组成的多肽,理论分子质量为20.24 k D,等电点为5.48,含有1个半胱氨酸残基,无信号肽.实时荧光定量PCR分析表明,七鳃鳗g型溶菌酶基因在各组织中广泛表达,其中在肠中表达量最高.脂多糖(LPS)体内刺激七鳃鳗后发现,溶菌酶在口腔腺和头肾表达量显著升高.以溶壁微球菌和哈维弧菌为底物检测重组g型溶菌酶的活性时,均表现出抗菌活性,最适p H为7.5,最适温度为35℃.扫描电镜分析表明,重组酶能够使溶壁微球菌破裂.以上结果均表明,g型溶菌酶在七鳃鳗的先天免疫系统防御病菌感染中起到重要作用.

关键词：七鳃鳗 g型溶菌酶表达分析抗菌活性

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斑马鱼g型溶菌酶基因序列分析及其原核表达

南方农业学报 2022年第1期53卷 229-237页

作者：陈华林晨韬陈曦葛均青福建省农业科学院生物技术研究所福州350003 福建师范大学生命科学学院/南方海洋研究院福建省微藻种质改良工程技术研究中心/福建省特色海洋生物资源可持续利用重点实验室福州350117

【目的】实现斑马鱼g型溶菌酶在大肠杆菌中表达,以获得高纯度且具溶菌活性的融合蛋白,为探究g型溶菌酶在斑马鱼抗菌过程中的作用机制及其开发利用打下基础。【方法】通过ClustalW、ExPASy、SignalP-5.0 Server及PSIPRED等在线软件对斑马... 详细信息

【目的】实现斑马鱼g型溶菌酶在大肠杆菌中表达,以获得高纯度且具溶菌活性的融合蛋白,为探究g型溶菌酶在斑马鱼抗菌过程中的作用机制及其开发利用打下基础。【方法】通过ClustalW、ExPASy、SignalP-5.0 Server及PSIPRED等在线软件对斑马鱼g型溶菌酶进行生物信息分析,经密码子优化后合成斑马鱼g型溶菌酶基因,亚克隆至pET-28a(+)表达载体并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,以IPTg进行诱导表达,并通过非干扰型蛋白浓度测定试剂盒和溶菌酶测定试剂盒(比浊法)测定其浓度及溶菌活性。【结果】从genBank检索获得的斑马鱼溶菌酶基因g1(NM_001002706.1)和g2(XM_002664371.5)分别命名为Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2。Zeb-Lys-g1基因开放阅读框(ORF)长591 bp,共编码196个氨基酸残基,其编码蛋白分子量约21.6 kD;Zeb-Lys-g2的ORF长576 bp,共编码191个氨基酸残基,其编码蛋白分子量约21.1 kD;2种斑马鱼g型溶菌酶序列中均含有2个半胱氨酸残基及3个保守的催化残基位点(glu、Asp和Asp)。Zeb-Lys-g1的N端含有17个氨基酸的信号肽,而Zeb-Lys-g2不存在典型的信号肽结构,但其三级结构均具有多个α-螺旋结构。在基于溶菌酶序列相似性构建的系统发育进化树中,Zeb-Lys-g1序列与金鱼g型溶菌酶序列的亲缘关系最近,而Zeb-Lys-g2序列与鲈形目和鲽形目鱼类的g型溶菌酶序列亲缘关系较近。将合成的斑马鱼g型溶菌酶基因(Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2)亚克隆至pET-28a(+)表达载体并转化BL21(DE3)感受态细胞,20℃下经IPTg(终浓度0.5 mmol/L)诱导16 h,可获得融合蛋白Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2,纯化后的浓度分别为1.01和1.66 mg/mL,对应的溶菌活性分别为689.68和44.39 U/mg。【结论】鱼类g型溶菌酶的基因变异较保守,经密码子优化及全基因合成方式合成的斑马鱼g型溶菌酶基因Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2可通过原核表达获得高纯度、高溶菌活性的融合蛋白,为探究斑马鱼溶菌酶的抗菌机制提供了技术支持。

关键词：斑马鱼 g型溶菌酶序列特征原核表达溶菌活性

鲤鱼g型溶菌酶基因的cDNA克隆及其在毕赤酵母中的表达

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福建农林大学学报（自然科学版） 2017年第1期46卷 81-88页

作者：李雯陶妍上海海洋大学食品学院/上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心上海201306

从鲤鱼鳃组织中分离克隆到一种新的g型溶菌酶同工型基因(CLYg).该基因的全长cDNA为558 bp,除去终止密码子,编码185个氨基酸,推断的氨基酸序列没有信号肽,含3个催化位点(谷氨酸73、脯氨酸86和天冬氨酸97),具有鱼类g型溶菌酶的基本特征.通... 详细信息

从鲤鱼鳃组织中分离克隆到一种新的g型溶菌酶同工型基因(CLYg).该基因的全长cDNA为558 bp,除去终止密码子,编码185个氨基酸,推断的氨基酸序列没有信号肽,含3个催化位点(谷氨酸73、脯氨酸86和天冬氨酸97),具有鱼类g型溶菌酶的基本特征.通过PCR方法在CLYg基因的5'和3'端分别引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点.扩增到的目的片段与表达载体pPICZαA连接构建重组表达载体pPICZαA-CLYg后,电转至毕赤酵母X-33,筛选得到的阳性转化子在1.0%甲醇、29℃、pH 6.0的条件下诱导表达72 h,获得重组体***-PAgE和蛋白质印迹分析显示,在毕赤酵母中成功表达了重组体CLYg.

关键词：鲤鱼 g型溶菌酶毕赤酵母重组表达

扎那纹胸鮡g型溶菌酶的cDNA克隆及组织表达分析

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安徽医科大学学报 2023年第5期58卷 711-717页

作者：王运娇吕梦蔡莎莎山东第一医科大学(山东省医学科学院)研究生院济南250000

目的鉴定扎那纹胸鮡g型溶菌酶(gzLysg)编码序列,分析其在宿主免疫系统中的作用。方法通过巢氏PCR技术克隆了gzLysg cDNA序列,通过ExPASy、SignalP 5.0、CDD、Clustal Omega等在线软件对gzLysg蛋白进行生物信息学分析,利用RT-qPCR技术分... 详细信息

目的鉴定扎那纹胸鮡g型溶菌酶(gzLysg)编码序列,分析其在宿主免疫系统中的作用。方法通过巢氏PCR技术克隆了gzLysg cDNA序列,通过ExPASy、SignalP 5.0、CDD、Clustal Omega等在线软件对gzLysg蛋白进行生物信息学分析,利用RT-qPCR技术分析了gzLysg mRNA在不同组织中的表达情况。结果gzLysg cDNA的开放阅读框全长558 bp,编码185个氨基酸,其蛋白序列分子量为20478.20 u,理论等电点为9.16,是一种稳定的碱性亲水性蛋白质。该蛋白无信号肽,含有g型溶菌酶典型的催化活性位点、gEWL结构域和SLT结构域。高级结构分析发现,gzLysg蛋白以α螺旋和无规则卷曲结构为主,其分子表面有一条与溶菌酶活性密切相关的狭长裂缝。系统进化分析表明溶菌酶在物种进化过程中较为保守,且gzLysg与斑马鱼来源的溶菌酶表现出较近的亲缘关系。组织表达谱分析发现,gzLysg mRNA在免疫保护相关的皮肤、肌肉和鳃组织中具有较高表达量。结论gzLysg在扎那纹胸鮡固有免疫防御中可能发挥重要作用。

关键词：扎那纹胸鮡 g型溶菌酶生物信息学分析组织表达谱

虾夷扇贝beta-actin基因和g型溶菌酶基因的克隆与表达研究

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虾夷扇贝beta-actin基因和G型溶菌酶基因的克隆与表达研究

作者：傅立元辽宁师范大学

学位级别：硕士

虾夷扇贝是20世纪80年代有日本引入我国,现已成为我国北方重要的贝类养殖品种,但近年来,虾夷扇贝陆续爆发大规模死亡,不但造成了巨大的经济损失,还严重影响了该产业的健康发展。病害的不断爆发以及病因的多样性迫切要求我们对此进行更... 详细信息

虾夷扇贝是20世纪80年代有日本引入我国,现已成为我国北方重要的贝类养殖品种,但近年来,虾夷扇贝陆续爆发大规模死亡,不但造成了巨大的经济损失,还严重影响了该产业的健康发展。病害的不断爆发以及病因的多样性迫切要求我们对此进行更加深入的研究。虾夷扇贝中抗病基因的克隆和表达无疑是研究养殖动物免疫防御机制,提高机体抗病力,实现遗传改良的基础和关键。为进一步研究虾夷扇贝功能基因的表达调控。利用SMART cDNA文库构建试剂盒成功构建了健康虾夷扇贝外套膜和肾脏两种组织的cDNA文库。对随机选取的4009个克隆进行5’端测序,比对,从虾夷扇贝肾脏文库中筛选出1条β肌动蛋白同源序列,对此EST序列两端进行扩增、测序,得到肌动蛋白基因cDNA全长序列。该cDNA全长为1536bp,5’端非编码区84 bp, 3’端非编码区321 bp,编码区1131 bp,编码377个氨基酸;在基因组DNA中,该基因被一个内含子分为两段,内含子位于第41和第42个氨基酸之间,长度为1498bp。虾夷扇贝β-肌动蛋白基因可以被用于作为定量某种虾夷扇贝mRNA的标准,这为继续研究虾夷扇贝其他功能基因,及其分子生物的进一步研究、促进其他相关分子发育和系统进化研究奠定了基础。从虾夷扇贝外套膜文库中筛选出g型溶菌酶同源序列,对此EST序列两端进行扩增、测序,得到g型溶菌酶基因cDNA全长序列。该基因序列全长为731 bp,5’端非编码区25 bp, 3’端非编码区100 bp,编码区606 bp,编码202个氨基酸。经过进一步分段扩增、测序,得到该基因的五个内含子,将该基因分成六个外显子。六个外显子长度分别为55 bp,60 bp,90 bp,113 bp,148 bp和140 bp;五个内含子的长度分别为7087 bp,5178 bp,3526 bp,710 bp和1400 bp;内含子的两侧都具有RNA正确剪接所必需的识别位点(gT/Ag)。采用实时定量PCR方法,检测了虾夷扇贝g型溶菌酶基因在不同组织中的表达以及在菌注射后不同时段g型溶菌酶基因在血细胞中的表达状况。结果发现,该基因主要在外套膜和肝胰腺中表达,在鳃、肾脏、闭壳肌和血细胞中也有微量的表达,在鳗弧菌刺激后的3小时、6小时、9小时三个时段中,g型溶菌酶在血中的表达均显著高于对照组,第12小时、24小时低于对照组,第36小时高于对照组。另外,本研究随机克隆了虾夷扇贝5个不同个体的g型溶菌酶编码区并测序,发现有3个有义突变,由于测序容易产生误差,又对这3个有义突变进行了高通量SNP基因型分析,结果显示有1个有义突变是准确的。为进一步研究其物种的遗传多态性和基因表达差异奠定了基础。

关键词：虾夷扇贝 β-肌动蛋白 g型溶菌酶序列分析组织表达

团头鲂g型溶菌酶和caspase家族基因的全长cDNA克隆及在氨氮胁迫下的表达分析

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团头鲂g型溶菌酶和caspase家族基因的全长cDNA克隆及在氨氮胁迫下...

作者：章琼南京农业大学

学位级别：硕士

团头鲂(Megahbramaamblycephala)是我国重要的草食性经济鱼类,而水体中氨氮含量过高是促使团头鲂发病的重要影响因素,严重制约其高密度养殖模式的发展。溶菌酶是一种能水解粘多糖的碱性球蛋白,又称N-乙酰胞壁质聚糖水解酶,是机体免疫机... 详细信息

团头鲂(Megahbramaamblycephala)是我国重要的草食性经济鱼类,而水体中氨氮含量过高是促使团头鲂发病的重要影响因素,严重制约其高密度养殖模式的发展。溶菌酶是一种能水解粘多糖的碱性球蛋白,又称N-乙酰胞壁质聚糖水解酶,是机体免疫机能评价指标之一,它的表达可以增强巨噬细胞的吞噬功能,清理受损或感染细胞。Caspase(cysteinylaspartate specific proteinase)是一类具有天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶,几乎参与所有凋亡通路的级联反应,是细胞凋亡的核心。为了解g型溶菌酶、caspase9、caspase8基因序列特征及其在团头鲂氨氮胁迫过程中的作用,应用末端快速扩增(rapid amplication of cDNA ends,RACE)技术克隆了团头纺g型溶菌酶、caspase9以及caspase8全长cDNA序列,并应用荧光定量PCR检测了各基因在氨氮胁迫不同时间的表达变化,为进一步了解团头鲂应答氨氮胁迫分子机制提供理论依据。主要研究结果如下:1.g型溶菌酶基因全长cDNA克隆及在氨氮胁迫下的表达分析克隆得到全长719 bp的cDNA序列,包括71 bp的5'末端非翻译区(untranslated regions,UTR),90 bp 的 3'UTR,558 bp 的开放阅读框(open reading frame,ORF);氨基酸相似度比对显示,不同鱼类g型溶菌酶的氨基酸序列之间具有较高的保守性,系统进化树分析表明,该基因与草鱼(Ctenopharyngodonidella)g型溶菌酶亲缘关系较近。荧光定量PCR结果显示g型溶菌酶基因在团头鲂各组织中均有表达,肠道中表达量最高,同时在胁迫和恢复过程中该基因在肝和脑中的表达规律相似,均在胁迫时表达量上调,恢复后表达量相对下降,而g型溶菌酶在鳃中的表达有所不同,可推测g型溶菌酶基因参与氨氮应激分子过程。*** 9基因全长cDNA克隆及在氨氮胁迫下的表达分析得到全长 1613 bp 的 cDNA序列,包括 185 bp 的 5'UTR,96 bp 的 3'UTR,1332 bp的ORF。氨基酸多序列比对显示平均同源性为77.74%,表明团头鲂caspase9基因具有较高的保守性;系统进化分析表明,该基因氨基酸序列与其他鱼类caspase9聚为一支并与锦鲤(Cyprinuscarpio)caspase9亲缘关系较近;荧光光定量PCR结果显示caspase9基因在团头鲂各组织中均有表达,在脑中表达量最高,肌肉中表达量最低,同时在胁迫和恢复过程中该基因在肝和脑中的表达规律相似,均在胁迫期间出现表达量上调,整体呈类似波浪形表达谱。研究结果提示,氨氮胁迫下caspase9基因参与团头鲂的免疫防御,并与细胞凋亡分子过程有关。*** 8基因cDNA克隆及在氨氮胁迫下的表达分析克隆到caspase 8基因全长cDNA序列2034 bp,包括102 bp的5' UTR,462 bp的3'UTR,1470bp的ORF,编码489个氨基酸残基。利用该序列进行氨基酸多序列比对,显示平均同源性为59.56%,表明团头鲂caspase8基因保守型较强;系统进化树分析显示,团头鲂caspase8基因氨基酸序列与其他鱼类该基因聚为一大支并与鲤鱼(Cyprinuscarpio)和斑马鱼(Danio rerio)亲缘关系较近。荧光定量PCR结果显示caspase 8在所检测的6个组织肠道、肝脏、脑、肾脏、鳃和肌肉中均有表达,其在脑中的表达量最高,在肌肉和鳃中表达较低,同时在胁迫和恢复应激过程中,该基因在脑和肝中的表达规律相似,均在胁迫过程中表达量上升并在胁迫后72h表达量达到最大值,恢复后表达量有所回落,结果显示caspase8参与了氨氮胁迫应激过程。

关键词：团头鲂 g型溶菌酶细胞凋亡因子基因克隆氨氮胁迫组织表达

栉孔扇贝和海湾扇贝g型溶菌酶基因及栉孔扇贝硒结合蛋白基因的克隆和表达研究

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栉孔扇贝和海湾扇贝G型溶菌酶基因及栉孔扇贝硒结合蛋白基因的克...

作者：邹慧斌中国海洋大学

学位级别：硕士

海湾扇贝和栉孔扇贝作为我国优良的海水养殖品种近年来得到了很大的推广,构成了海洋贝类养殖业的主体。尽管我国的扇贝养殖规模在过去的几十年中达到一定水平,养殖总产量也居国际领先地位,但贝类的分子免疫学及其相关的病害防治研究相... 详细信息

海湾扇贝和栉孔扇贝作为我国优良的海水养殖品种近年来得到了很大的推广,构成了海洋贝类养殖业的主体。尽管我国的扇贝养殖规模在过去的几十年中达到一定水平,养殖总产量也居国际领先地位,但贝类的分子免疫学及其相关的病害防治研究相对国外却相对薄弱,近年来我国养殖扇贝的病害问题一直困扰着该产业的健康和可持续发展。尽管针对扇贝养殖环境、病原以及养殖技术等方面开展了大量的研究工作,提出了许多防病治病措施,也取得了一定的成效。但由于引起养殖扇贝病害的病原和发病原因的多样性,大量使用抗菌素和农药后造成病原微生物抗药性的提高以及对环境造成的严重破坏,所以贝类养殖业要摆脱病害的困扰,必须开辟新的疾病防治途径。本研究从2个方面开展扇贝分子免疫学的工作,一是筛选和克隆了参与调控免疫防御的功能基因,根据抗病功能基因的结构以及这些基因在个体或群体感染后或环境胁迫条件下的表达情况,深入研究扇贝的防御抗病机制,探讨提高机体抗病力的方法和途径,并作为抗病良种选育的分子标记,指导扇贝的遗传改良和抗病品系的培育。二是筛选研制新型的具有抗微生物活性的多肽或蛋白基因,并对这些基因实现体外大量表达,在扇贝养殖业上作为新型的病害预防治疗制剂,取代目前普遍使用的抗菌素和化学药物。 1.栉孔扇贝硒结合蛋白cDNA的克隆与免疫相关性研究含硒的生物大分子在免疫系统中发挥着重要的作用。本研究采取大规模的EST(Expressed Sequence Tag)测序方法,结合锚定PCR技术克隆得到了1个栉孔扇贝硒结合蛋白的全长cDNA序列。栉孔扇贝硒结合蛋白zSeBP全长1664bp,包括一个33bp的5’末端非编码(untranslated region,UTR)和一个188bp的3’UTR,其开放式读码框(open reading frame,ORF)长1443bp,可编码480个氨基酸组成的zSeBP前体蛋白,预测分子量为54kDa,等电点为6.5。同源性分析表明克隆的zSeBP cDNA序列与哺乳动物、鱼类、鸟类、昆虫甚至微生物和植物的硒结合蛋白基因都具有很高的相似性。这表明从栉孔扇贝中克隆得到的cDNA序列是硒结合蛋白家族的成员比且硒结合蛋

关键词：栉孔扇贝海湾扇贝硒结合蛋白 g型溶菌酶 EST 半定量RT-PCR MDA 免疫相关性分析分子进化

长丰鲫c型和g型溶菌酶基因的克隆及其在细菌感染条件下的表达分析

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长丰鲫c型和g型溶菌酶基因的克隆及其在细菌感染条件下的表达分析

作者：姚佳俊华中农业大学

学位级别：硕士

长丰鲫(Chang Feng Carassius auratus gibelio)(品种登记号:gS-04-01-2015)肉质嫩、生长快、遗传稳定,市场应用前景非常广阔。但近年来,随着我国水产养殖规模的日益扩大,鲫(Carassius auratus)大规模养殖过程中细菌性病害越来越严重。... 详细信息

长丰鲫(Chang Feng Carassius auratus gibelio)(品种登记号:gS-04-01-2015)肉质嫩、生长快、遗传稳定,市场应用前景非常广阔。但近年来,随着我国水产养殖规模的日益扩大,鲫(Carassius auratus)大规模养殖过程中细菌性病害越来越严重。溶菌酶(Lysozyme,lys)具有广谱的杀菌功能,在鱼类非特异免疫中占有重要地位。本文以长丰鲫和普通鲫为研究对象,克隆长丰鲫c-lys和g-lys c DNA基因全长;检测c-lys和g-lys基因在长丰鲫和普通鲫中的组织表达情况;两种鱼分别感染迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌后,分析两种基因在长丰鲫和普通鲫肝脏、肾脏、脾脏和鳃中的表达变化特征,同时检测四种组织的形态学变化,初步评价它们的免疫防御功能,为探讨长丰鲫抗细菌性疾病能力提供一定的理论依据。本研究的实验结果如下:1.长丰鲫c-lys和g-lys基因克隆长丰鲫c-lys全长698 bp,开放阅读框(ORF)438 bp,编码145个氨基酸。含有glu 53和Asp 69两个保守的氨基酸催化位点,八个保守的Cys,可形成四对二硫键。N端具有信号肽,是一种分泌蛋白;长丰鲫g-lys全长861 bp,开放阅读框(ORF)558 bp,编码185个氨基酸。含有glu(第73位)、Pro(第86位)和Asp(第97位)三个保守的催化位点。存在一个Cys残基,但不形成二硫键,不存在N端信号肽,是一种胞内蛋白。氨基酸序列比对和进化树分析结果表明:长丰鲫c-lys和g-lys基因在鲤形目鱼类进化过程中均较为保守。2.三种细菌刺激后,长丰鲫和普通鲫溶菌酶基因组织表达变化c-lys和g-lys基因在长丰鲫和普通鲫所检测组织中均有表达,且均在肾脏中表达量最高。感染细菌后,肝脏、肾脏、脾脏和鳃组织中,长丰鲫和普通鲫c-lys和g-lys基因表达量均呈现不同程度的上调,但两种基因在两种鱼同一组织中升幅、出现高峰的时间等均有差异。3.三种细菌感染后,长丰鲫和普通鲫各组织的病理变化长丰鲫和普通鲫发病后鳞片脱落,体表、肛门和鳍等部位伴有不同程度充血和出血现象,但两种鱼在体色和不同细菌感染剖检后各组织颜色变化存在一定差异。三种细菌刺激后,长丰鲫和普通鲫出现症状相似:肝脏表现为肝细胞排列紊乱,分布不均,细胞核大小不一致,固缩,碎裂坏死,细胞肿胀,肝血窦和中央静脉淤血,肝细胞滴状玻璃样变等症状;肾脏呈现出肾小球肿大,肾小管上皮细胞脱落,颗粒样变,单核巨噬细胞增多,肾间质炎性细胞浸润等症状;脾脏组织红髓白髓出现明显分界,细胞核碎裂,固缩坏死,脾动脉周围网状细胞、淋巴细胞减少。鳃小片呼吸上皮细胞浮离,鳃丝变粗变短,血管扩张,鳃小片基部水肿,部分患病鱼鳃小片组织细胞解体、脱落。

关键词：长丰鲫普通鲫 c型溶菌酶 g型溶菌酶克隆表达分析病理切片