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结核分枝杆菌eis基因表达对人THP-1细胞细胞因子分泌的影响

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免疫学杂志 2015年第8期31卷 697-700页

作者：朱坤生易敏周向东李升锦重庆医科大学附属第二医院呼吸内科 400010

目的研究结核分枝杆菌eis基因表达对人单核巨噬细胞Thp-1细胞的影响,筛选出差异性表达细胞因子,探讨结核分枝杆菌eis基因在单核巨噬细胞致持留的免疫机制。方法 eis基因重组耻垢分枝杆菌MS-pmv261-eis及对照组细菌MSpmv261感染经PMA诱... 详细信息

目的研究结核分枝杆菌eis基因表达对人单核巨噬细胞Thp-1细胞的影响,筛选出差异性表达细胞因子,探讨结核分枝杆菌eis基因在单核巨噬细胞致持留的免疫机制。方法 eis基因重组耻垢分枝杆菌MS-pmv261-eis及对照组细菌MSpmv261感染经PMA诱导分化的人单核巨噬细胞Thp-1细胞;细胞信号传导通路抑制剂用于分析作用机制;ELISA方法检测细胞上清中IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、INF-γ表达水平;筛选差异性表达的细胞因子,RT-PCR进一步确定该细胞因子的基因表达。结果结核分枝杆菌eis基因可引起IL-10表达增加(P0.05),RT-PCR结果也进一步确证了IL-10基因的高表达。2-AP和U0126能明显抑制MS-pmv261-eis(MS-eis)感染引起的IL-10的释放(Peis基因可上调Thp-1细胞IL-10在蛋白水平和基因水平的表达,可能通过MEK1/2或PKR信号通路刺激IL-10的释放来增强机体的免疫功能,其作用可能与结核分枝杆菌持留性有关。

关键词：结核分枝杆菌 eis基因单核巨噬细胞白介素-10

牛分枝杆菌eis基因在耻垢分枝杆菌中的表达及其生物学活性鉴定

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中国畜牧兽医 2017年第7期44卷 2079-2085页

作者：张通明宋天琪鑫婷朱鸿飞贾红中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193

试验旨在构建牛分枝杆菌eis基因的穿梭表达载体,鉴定其在重组耻垢分枝杆菌中的生物学活性。采用PCR技术扩增并克隆牛分枝杆菌eis基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV261-Mbeis,经双酶切和测序鉴定其正确性,利用电穿孔法将重组质... 详细信息

试验旨在构建牛分枝杆菌eis基因的穿梭表达载体,鉴定其在重组耻垢分枝杆菌中的生物学活性。采用PCR技术扩增并克隆牛分枝杆菌eis基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV261-Mbeis,经双酶切和测序鉴定其正确性,利用电穿孔法将重组质粒转化至耻垢分枝杆菌mc2155中,采用SDS-PAGE和Western blotting技术检测牛分枝杆菌eis基因在耻垢分枝杆菌中的表达,质谱鉴定目的蛋白氨基酸序列。研究结果表明,成功构建了牛分枝杆菌eis基因穿梭表达载体pMV261-Mbeis;生长曲线表明负载重组质粒不会影响耻垢分枝杆菌的体外生长;SDS-PAGE和Western blotting检测证实了牛分枝杆菌eis基因在耻垢分枝杆菌中可表达出分子质量约44ku的eis蛋白;质谱检测证明了该蛋白即为牛分枝杆菌eis蛋白。本研究构建的牛分枝杆菌eis基因穿梭表达质粒pMV261-Mbeis在耻垢分枝杆菌中具有生物学活性,为下一步研究表达产物eis蛋白的功能奠定了基础。

关键词： eis基因 pMV261 耻垢分枝杆菌

结核分枝杆菌eis基因表达对人THP-1细胞细胞因子分泌的影响

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结核分枝杆菌eis基因表达对人THP-1细胞细胞因子分泌的影响

作者：朱坤生重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:结核菌的持留性和结核分枝杆菌的耐药性为目前控制结核病的两大难题,结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）的持留性,结核持留菌的存在是结核病感染呈现慢性化的最主要原因。结核持留菌在机体内的存在是临床上诊断和治... 详细信息

目的:结核菌的持留性和结核分枝杆菌的耐药性为目前控制结核病的两大难题,结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）的持留性,结核持留菌的存在是结核病感染呈现慢性化的最主要原因。结核持留菌在机体内的存在是临床上诊断和治疗结核病时结核菌的潜伏感染、结核病复发、结核菌耐药、迁延不愈,结核病治疗期限延长、预后不佳等一系列问题发生的原因,持留菌通过多种渠道和方式从抗结核药物的灭菌和机体的免疫系统杀伤中逃逸出来,保持了结核分枝杆菌在环境中的稳定性和对机体内环境的适应性和无反应性,导致耐药和持留。至今结核分枝杆菌的持留的机制尚未完全明确,持留的途径尚未完全揭开,因此临床上迄今为止并没有针对结核持留菌进行完全有效治疗的方法,并进一步控制结核病。而研究发现MTB能进入巨噬细胞,且被巨噬细胞吞噬后,由于巨噬细胞内特殊基因的表达,导致了结核菌对巨噬细胞胞内环境的适应,从而达到持留作用。结核分枝杆菌基因组者全序列的阐明基础研究中为临床上根除持留菌从基因和分子生物学的角度为揭开结核杆菌持留生存的机制提供了理论支持。MTBeis基因仅存在于致病性MTB中,可抑制细胞保护性免疫反应,增加非致病性MTB在宿主细胞内的持留,eis基因产物eis蛋白为一可溶性分泌蛋白,分子量大致为42kd,能作用于巨噬细胞,有研究证实该42kd蛋白能够影响巨噬细胞肿瘤坏死因子（tunlornecrosisfactor,tnf）-a和白介素（interlukin,il）-10的分泌,有效的抑制了单核巨噬细胞细胞的活化而与持留的的关联。本课题组之前何师姐的实验结果已经证实结核分枝杆菌eis基因的产物eis蛋白能够提升巨噬细胞吞噬耻垢分枝杆菌之后耻垢杆菌于宿主巨噬细胞内的生存率,结核分枝杆菌在单核巨噬细胞内的比较具体的持留机制尚不清楚。目前已有文献指出,机体细胞因子表达和分泌的变化对机体的免疫和结核分枝杆菌在巨噬细胞的持留和潜伏感染都会产生影响,eis基因可增加结核菌在巨噬细胞的持留是否与其可能影响吞噬细胞细胞因子的分泌和作用有关,目前文献中报到的很少。IL-10具有非常广泛的生物学的活性,其为一种多功能的机体负性免疫调节的细胞因子,是一种免疫抑制性的细胞因子,且有高效性。能改变机体免疫应答和mhcⅡ类抗原表达,也可选择性抑制巨噬细胞某些方面的功能,也抑制了对t细胞和b细胞的功能。本次实验的主要目的即使为了要探索eis基因对结核分枝杆菌感染单核巨噬细胞之后的巨噬细胞分泌和表达的各种细胞因子影响,筛选出具有差异性表达的细胞因子,为进一步从细胞免疫入手研究eis基因持留机制提供实验依据。方法:1.以rpmi1640培养基（内含10%胎牛血清）培养浓度为1×105的thp-1细胞,之后pma诱导细胞使thp-1细胞分化,将重组结核分枝杆菌ms-pmv261-eis及对照菌ms-pmv261培养7天后离心集菌,少量培养基用力吹打、震荡混合均匀,紫外光分光光度计计算细菌浓度,最后按moi=10:1感染thp-1细胞分化的巨噬细胞。2.取细胞上清液,用elisa方法检测eis基因对thp-1细胞中il-10的影响将thp-1细胞种至6孔板,以pma诱导分化24小时后以pbs清洗细胞并以重组分枝杆菌感染细胞,18h收集细胞上清液,室温下1000g离心15min,取100hul以elisa检测il-4,il-6,il-10,il-12,inf-γ表达情况;根据标准品浓度和测得的od值绘制成为标准曲线,根据描绘的标准曲线计算出各实验组细胞因子的浓度。3.收集细胞提取细胞总rna,rt-pcr检测试剂盒进一步检测il-10的浓度,在基因层面的表达。18h后收集细胞,提取总rna,根据上述elisa检查结果设计特异性表达il-10细胞因子的引物,rt-pcr检测进一步确证该细胞因子的基因表达。引物序列:上游引物:5’-ggcttcctaactgctaca-3’下游引物:5’-ctcctgacctcaagtgat-3;反应条件:pcr反应条件为:95oc预变性5min;95oc变性30s,60oc退火30s,72oc延伸30s,共35个循环后再72oc延伸10min。pcr扩增结束,pcr扩增的产物进行收集,后进行1%琼脂糖凝胶电泳。4.用统计学分析数据,spss15.0统计软件,以x±s表示,两组进行t检验。结果:1.pma成功诱导thp-1细胞转化为巨噬细胞,重组结核分枝杆菌MS-pmv261-eis及对照菌MS-pmv261,按MOI=10:1感染Thp-1细胞分化的巨噬细胞。2.ELISA结果显示,结核分枝杆菌eis基因可引起IL-10 OD值明显增加（P＜0.05）,而对细胞因子IL-4、IL-6、IL-12、INF-γ的表达无显著影响（P＞0.05）3.收集细胞后提取的巨噬细胞细胞RNA,之后进行的RT-PCR的检测,测定的结果为IL-10的mRNA条带的表

关键词：结核分枝杆菌 eis基因单核巨噬细胞白介素-10

结核分枝杆菌eis基因抑制人肺腺癌A549细胞自噬

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基础医学与临床 2013年第2期33卷 129-132页

作者：易敏周向东李升锦陈维贤重庆医科大学附属第二医院呼吸内科重庆400010 重庆医科大学附属第二医院检验科重庆400010

目的构建结核分枝杆菌eis基因表达质粒,探讨其对人肺腺癌A549细胞自噬的影响。方法采用PCR技术扩增eis基因片段并插入空载质粒pcDNA3.1-3flag中,双酶切、测序鉴定克隆质粒的正确性;将重组质粒与对照空载质粒分别与自噬体荧光表达质粒GFP... 详细信息

目的构建结核分枝杆菌eis基因表达质粒,探讨其对人肺腺癌A549细胞自噬的影响。方法采用PCR技术扩增eis基因片段并插入空载质粒pcDNA3.1-3flag中,双酶切、测序鉴定克隆质粒的正确性;将重组质粒与对照空载质粒分别与自噬体荧光表达质粒GFP-LC3共转染细胞并以自噬诱导剂雷帕霉素处理,荧光显微镜下观察自噬荧光并计数,Western blot检测eis蛋白及自噬蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ的表达水平。结果成功构建eis基因重组表达质粒PcDNA3.1-eis-3flag,该质粒共转染细胞组自噬荧光小点较对照组明显减少(Peis基因可抑制A549细胞自噬的形成,其抑制作用与结核分枝杆菌持留性相关。

关键词：结核分枝杆菌 eis基因自噬

肠出血性大肠埃希菌eis基因的克隆与植物表达载体的构建

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贵州农业科学 2014年第5期42卷 12-15页

作者：吴仙花李贺施利利罗峰夏卜贤陈晓木孙守钧裴忠有天津农学院农学与资源环境学院天津300384 四平市农村经济管理局吉林四平136000

为给利用转基因植物生产出血性大肠杆菌疫苗的研究奠定基础,应用PCR扩增技术从原核表达载体pET-28a(+)-eis上克隆对出血性大肠杆菌具有保护性免疫的eis基因序列,并采用T-A克隆方法克隆到pUC18上,通过酶切、连接、转化等技术构建植物表... 详细信息

为给利用转基因植物生产出血性大肠杆菌疫苗的研究奠定基础,应用PCR扩增技术从原核表达载体pET-28a(+)-eis上克隆对出血性大肠杆菌具有保护性免疫的eis基因序列,并采用T-A克隆方法克隆到pUC18上,通过酶切、连接、转化等技术构建植物表达载体,经酶切、测序验证后将构建植物表达载体导入农杆菌中。结果:扩增到约为1 800bp的eis基因,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1300-eis,并导入到农杆菌EHA105中。

关键词：肠出血性大肠埃希菌 eis基因植物表达载体 PCR 克隆疫苗

结核分枝杆菌eis基因对鼠巨噬细胞Raw264.7自噬影响的研究

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中国微生态学杂志 2014年第7期26卷 779-781,785页

作者：易敏李升锦牟方红重庆开县人民医院呼吸内科重庆开县405400 重庆医科大学第二临床学院呼吸内科重庆400000

目的探讨结核分枝杆菌eis基因对巨噬细胞自噬的影响。方法将鼠巨噬细胞Raw264.7以自噬体荧光表达质粒GFP-LC3转染,将含eis基因的重组耻垢分枝杆菌MS-pmv261-eis与不含eis基因的耻垢分枝杆菌MS-pmv261分别感染宿主巨噬细胞,透射电镜下观... 详细信息

目的探讨结核分枝杆菌eis基因对巨噬细胞自噬的影响。方法将鼠巨噬细胞Raw264.7以自噬体荧光表达质粒GFP-LC3转染,将含eis基因的重组耻垢分枝杆菌MS-pmv261-eis与不含eis基因的耻垢分枝杆菌MS-pmv261分别感染宿主巨噬细胞,透射电镜下观察自噬小体形成情况,荧光显微镜下观察自噬荧光并计数,Western blot检测eis基因表达的蛋白及自噬蛋白LC3-II的表达水平。结果结核分枝杆菌eis基因可抑制感染宿主细胞自噬小体的形成,并显著抑制自噬荧光小点形成(Peis基因对Raw264.7细胞自噬有抑制作用。

关键词：结核分枝杆菌 eis基因巨噬细胞细胞自噬

农杆菌介导甜高粱Bar基因再生体系建立及水稻eis基因转化研究

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农杆菌介导甜高粱Bar基因再生体系建立及水稻EIS基因转化研究

作者：吴仙花天津农学院

学位级别：硕士

甜高粱作为重要的饲料和能源作物，得到人们的广泛重视。本研究以10种个不同基因型甜高粱品种的3种不同外植体为材料，通过愈伤组织诱导、分化培养以及农杆菌介导的Bar基因遗传转化研究，以期建立高效的甜高粱再生体系，并尝试建立其农... 详细信息

甜高粱作为重要的饲料和能源作物，得到人们的广泛重视。本研究以10种个不同基因型甜高粱品种的3种不同外植体为材料，通过愈伤组织诱导、分化培养以及农杆菌介导的Bar基因遗传转化研究，以期建立高效的甜高粱再生体系，并尝试建立其农杆菌介导的遗传转化体系，为甜高粱转基因育种打下坚实基础。研究结果表明： 1.在2个甜高粱品种的成熟种子组织培养中，甜3号的诱导率为60.29%，绿能2号的诱导率为57.55%;辽甜3号的分化率为2.78%，绿能2号的分化率为0，分化率差异极显著。 2.在5个甜高粱品种的幼穗组织培养中，M81-E的诱导效果最好，诱导率为60.4%，其次是07-27，诱导率为51.23%，BJ-285、罗马和考利的诱导率均在50%以下，差异显著;07-27的分化效果最好，获得了35株再生苗，分化率为13.13%，其次是BJ-285，获得了1株再生绿苗，分化率为0.71%，M81-E、罗马和考利则未能分化出苗，分化率为0，差异极显著。综合比较，07-27的再生效果最好，其次是BJ-285。 3.在7个甜高粱品种的幼胚组织培养中，忻粱52号的诱导效果最好，诱导率为72.97%，其次是罗马、甜杂2号和BJ-299，再次是07-27和M81-E，最差是BJ-285，差异显著;07-27的分化效果最好，分化率为20.56%，并获得了80株再生植株，其次是忻粱52号，分化率为11.43%，再次是BJ-285、M81-E和甜杂2号，分化率分别为1.35%、1.08%和0.84%，而BJ-299和罗马的分化率为0，差异极显著。综合比较，07-27的再生效果最好，其次是忻粱52号，再次是BJ-285、M81-E和甜杂2号。 4.在忻粱52号幼胚、幼胚愈伤组织和M81-E的幼胚愈伤组织遗传转化中，忻粱52号幼胚转化获得17个抗性愈伤组织，转化率为5.67%，通过分化培养获得1株转基因苗，分化率为5.88%，而愈伤组织转化则未能获得转基因苗。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，目前已建立其高效的转基因体系。本研究以水稻成熟种子愈伤组织为受体，将肠出血性大肠杆菌局部免疫保护作用基因eis转入到水稻中，为以植物生产疫苗打下坚实基础。研究结果表明： 1.在水稻组织培养中，津原45成熟种子在NB基本培养+2,4-D2.0mg/L培养基上每天16/8h光照/黑暗条件下的诱导率最高，达56.95%，继代3周的愈伤组织分化率最高，达90.48%，建立了其高效的体外再生体系。 2.根据eis基因序列和载体序列设计特异性扩增引物，利用PCR技术扩增出eis基因序列，先T-A克隆到pUC19上，再通过酶切、连接转化技术构建到pCAMBIA1300植物表达载体上，成功建构了eis基因的双元植株表达载体，并导入到农杆菌EHA105中。 3.在津原45愈伤组织eis基因的遗传转化研究中，获得了11个抗性愈伤组织，转化率为13.7%，其中5个抗性愈伤组织分化出苗，分化率为45.5%，最终获得34株再生植株，经PCR检测，有19株表现为阳性。

关键词：甜高粱水稻再生体系建立 eis基因 Bar基因农杆菌转化

小毛莨内酯对重组耻垢分枝杆菌eis基因表达影响的研究

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小毛莨内酯对重组耻垢分枝杆菌eis基因表达影响的研究

作者：王开金重庆医科大学

学位级别：硕士

目的：结核病病程的延绵和复发所显示的持留现象，已经是久为人知的临床事实，但至今对结核分枝杆菌持留菌本质、发生机制及临床治疗仍无确切的认识和明确的界定，尤其是在结核分枝杆菌持留菌的临床药物治疗方面，几乎处于停滞状态... 详细信息

目的：结核病病程的延绵和复发所显示的持留现象，已经是久为人知的临床事实，但至今对结核分枝杆菌持留菌本质、发生机制及临床治疗仍无确切的认识和明确的界定，尤其是在结核分枝杆菌持留菌的临床药物治疗方面，几乎处于停滞状态，目前为止，还没有针对结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）持留菌的有效药物，而研究发现MTB能够进入巨噬细胞，并且进入巨噬细胞后，由于特殊的基因在巨噬细胞内的表达，从而达到适应巨噬细胞胞内环境从而达到持留作用。而近期的研究发现eis（Enhance intracellular survival）基因特异性的表达于致病的MTB复合群，具有提高MTB在巨噬细胞中的生存能力，能够达到长期持留。eis基因产物是一种可溶性分泌型蛋白，分子量约为42kd，能作用于巨噬细胞内及细胞外，有研究证实该种42kd蛋白能够影响巨噬细胞白介素（interlukin,IL）-10及肿瘤坏死因子（tunlornecrosisfactor，TNF）-a分泌，抑制巨噬细胞活化，于MTB的持留有一定关系。在机体免疫力下降时，持留MTB就会在体内复燃，发生结核病，结核病有卷土重来的趋势，其发病率及死亡率明显上升，持留态结核分枝杆菌是结核病内源性复燃和病程绵延的根源，以增殖期结核分枝杆菌为靶标的抗结核药对处在非增殖期的持留态MTB无效，这是目前全球防治结核病的主要障碍之一。近年来中草药在结核病的慢性感染治疗中日益得到重视，研究发现猫爪草的有效成分小毛莨内酯（Ternatolide，Tern）能显著增强细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxiclymphocyte,CTL）杀菌能力，达到杀灭持留菌作用[3]，我们的前期实验研究表明MTBeis（Enhance intracellular survival，eis）基因特异性表达于致病MTB复合群，具有提高MTB在巨噬细胞中的生存能力，与MTB的持留性密切相关。 Tern是从猫爪草（Ranunculus ternatus Thunb）的有效成分，祖国医学认为其性味辛甘，并有化痰散结、解毒消肿，归类于养阴药，临床主要用于治疗肺结核、淋巴结结核，而Tern对eis基因的影响目前尚无研究，本实验旨在探索Tern对重组耻垢分支杆菌（Mycobacteriumsmegmatis，MS）生长增殖情况、eis基因、蛋白表达的影响。进一步研究猫爪草对持留分支杆菌的有效成分、作用机理及作用强度。方法： 1从平板上挑取5×105MS-eis-PMV261分别接种于有Tern（200mg/L）卡那霉素抗性的LB肉汤培养基中作为试验组，MS-eis-PMV261单独培养作为对照组，同样于37℃，250r/min震摇培养，于第1、2、3、4、5和6天在两组中各取200μL测量菌液在波长600nm处A值，根据所测A值绘制增殖曲线。 2提取菌液DNA以RT-PCR方法检测Tern对eis基因表达的影响取培养6天Tern干预的试验组及对照组各3ml离心收集菌液后提取细菌DNA，溶于20ul双蒸水中。取1ul为模板RT-PCR扩增eis基因。eis基因的检测引物序列为上游：5’-ATGTTCCTACTGGCCGCGGC-3’;下游：5’–TCAGAACTCGAACGCGGTCTGG-3’。PCR反应条件为：95oC预变性3min;95oC变性30s，60oC退火30s，72oC延伸30s,共35个循环后再72oC延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖电泳分析，并以Quantity One软件分析其条带灰度值量化基因表达水平。 3免疫印迹法SDS-PAGE及western blot检测Tern对eis蛋白表达的影响分别取培养6天的3ml菌液以12000g,2min离心保留细菌及30ul菌液并加入5x蛋白上样缓冲液后沸水浴10min。电泳开始前，配制12%的分离胶以及5%的浓缩胶，收集的菌液蛋白离心后取上清，并进行SDS-PAGE电泳，电泳后，使用R-250考马斯亮蓝染色30min,脱色液脱色过夜后观察两组间42kd处蛋白表达情况。采用半干电转移方式将蛋白条带转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，以稀释的痰菌阳性结核患者血清（1:100）为一抗，过氧化物酶标记的羊抗人IgG（1:5000）为二抗，用DAB显色观察并分析蛋白条带。 4统计学方法数据以均数标准差x±s表示,采用SPSS18.0统计软件,两组间比较进行t检验。结果： 1Tern干预的试验组与未干预对照组MS-eis-PMV261的增殖曲线无明显差异。 2在给予Tern试验组eisDNA条带与对照组比较明显减弱。 3菌液处理后行SDS-PAGE电泳及western blot，结果显示含eis基因的MS-eis-PMV261未给予Tern药物干预独立培养的对照组在42ku处可表达

关键词：持留分枝杆菌 eis基因小毛莨内酯

小毛莨内酯对重组耻垢分枝杆菌eis基因表达的影响

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中国微生态学杂志 2013年第1期25卷 14-16页

作者：王开金易敏李升锦重庆医科大学附属第二医院呼吸内科重庆400010

目的研究小毛莨内酯(Ternatolide,Tern)对重组耻垢分枝杆菌生长增殖及其eis基因表达的影响。方法将5×105MS-eis-PMV261接种于LB培养基培养并加入200 mg/L的Tern作为实验组,MS-eis-PMV261单独培养作为对照,不同时间点测量取菌液波长为60... 详细信息

目的研究小毛莨内酯(Ternatolide,Tern)对重组耻垢分枝杆菌生长增殖及其eis基因表达的影响。方法将5×105MS-eis-PMV261接种于LB培养基培养并加入200 mg/L的Tern作为实验组,MS-eis-PMV261单独培养作为对照,不同时间点测量取菌液波长为600 nm的A值,根据所测A值绘制增殖曲线;提取菌液DNA以RT-PCR方法检测Tern对eis基因表达的影响;免疫印迹法SDS-PAGE及Western Blot检测Tern对eis蛋白表达的影响。结果 Tern对两组重组耻垢分枝杆菌增殖差异无统计学意义(P>0.05);Tern可抑制eis基因的表达(Peis蛋白的表达(Peis基因及其表达的蛋白。该结果对研究持留性结核分枝杆菌的药物治疗提供了实验依据。

关键词：耻垢分枝杆菌 eis基因小毛莨内酯持留性