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Characterization of transgenic mice expressing eGFP under the control of the monkey 20α-hydroxysteroid dehydrogenase promoter

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Science China(Life Sciences) 2018年第8期61卷 966-974页

作者： Chae-Won Park Seong-Keun Jeong Tsevelmaa Nanjidsuren Munkhzaya Byambaragchaa Myung-Hwa Kang Bo-Woong Sim Kwan-Sik Min Animal Biotechnology Graduate School of Future Convergence Technology Department of Animal Life Science Institute of Genetic Engineering Hankyong National University Department of Food Science and Nutrition Hoseo University National Primate Research Center Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology

To directly assess the molecular function of the monkey 20α-hydroxysteroid dehydrogenase(20α-HSD) promoter, we generated transgenic mice(tg) expressing enhanced green fluorescent protein(eGFP) under control of this promoter. We demonstrated that prostaglandin F2α induced 20α-HSD promoter activity in CHO cells in a dose-dependent manner. Furthermore, forskolin treatment markedly reduced 20α-HSD promoter activity, and prolactin exhibited weak inhibitory activity. The transgenic mouse obtained one positive founder male. The transgene was propagated in 10 successive generations without any notable defects to the progeny. eGFP and 20α-HSD in the tg mice were colocalized in the luteal cells of the ovary during late pregnancy. Strong eGFP and 20α-HSD protein signals were also detected in the adult testis. Immunohistochemical analysis revealed high eGFP levels in the seminiferous epithelium, whereas 20α-HSD was expressed in the seminiferous tubules. Our data suggest that the ovaries in monkey and mouse exhibit similar expression patterns of 20α-HSD during pregnancy. However, the expression pattern of eGFP in tg mice testis slightly differed from that of the endogenous 20α-HSD. Further investigation is required to elucidate the functional mechanisms underlying regulation of the monkey 20α-HSD promoter in the tg mice.

关键词： eGFP 转基因脱氢酶老鼠猴子控制 forskolin HSD

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鼠伤寒沙门氏菌荧光定位报告菌株的构建及其在猪肺泡巨噬细胞的示踪应用

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华北农学报 2023年第2期38卷 232-238页

作者：肖红何珍田棋黄鑫淼廖卫东黄廷华姚敏长江大学动物科学学院湖北荆州434020

利用增强型绿色荧光蛋白基因(eGFP)表征鼠伤寒沙门氏菌株14028(Sal-14028),以研究其在猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)中的示踪作用,首先将增强型绿色荧光蛋白基因通过电击法转入Sal-14028,经卡那霉素抗性培养基筛选和测序鉴定,获得了具有绿色... 详细信息

利用增强型绿色荧光蛋白基因(eGFP)表征鼠伤寒沙门氏菌株14028(Sal-14028),以研究其在猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)中的示踪作用,首先将增强型绿色荧光蛋白基因通过电击法转入Sal-14028,经卡那霉素抗性培养基筛选和测序鉴定,获得了具有绿色荧光信号的阳性菌株并检测其荧光稳定性,命名为Sal-pPpagC-eGFP。接着在同等条件下对比荧光菌株和野生菌株(WT)的生长特性,通过小鼠感染试验检测eGFP基因的插入对荧光菌株毒力有无明显影响,以分析荧光菌株的生物学特性;应用荧光显微镜和间接免疫荧光法检测荧光菌株在猪肺泡巨噬细胞3D4/21吞噬溶酶体中的定位情况。结果显示,在不同时间点,eGFP标记的鼠伤寒沙门氏菌在荧光显微镜下发出强烈的绿色荧光,且所带荧光不受抗性选择的影响,可稳定遗传。相同培养条件下,荧光菌株Sal-pPpagC-eGFP生长曲线的变化趋势与野生株基本相同。另外,经过改良寇氏法计算出的LD_(50)与野生株相比无显著差异(P>0.05),说明eGFP基因的插入对荧光菌株毒力无明显影响。荧光菌株在感染猪肺泡巨噬细胞后,吞噬溶酶体内可观察到标记菌株,并随着时间增加菌株数量呈现增长趋势。表明荧光菌株除了具备发光特性外,其他生物学性状没有明显改变。

关键词：鼠伤寒沙门氏菌 eGFP 电转化生物学特性胞内示踪

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新型二合一PiggyBac转座系统的构建及功能验证

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中国生物工程杂志 2022年第6期42卷 39-46页

作者：张尧仓彭玉丁可昕台福敏郑晓飞秦宜德付汉江安徽医科大学基础医学院合肥230032 军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所放射生物学北京市重点实验室北京100850

目的:PiggyBac(PB)转座子是一种可移动的遗传元件,采用“剪切和粘贴”机制在载体和染色体之间进行转座;通过将转座子元件和转座酶表达框整合到一个表达载体中,构建简便易用的二合一PB转座系统。方法:通过聚合酶链式反应(polymerase chai... 详细信息

目的:PiggyBac(PB)转座子是一种可移动的遗传元件,采用“剪切和粘贴”机制在载体和染色体之间进行转座;通过将转座子元件和转座酶表达框整合到一个表达载体中,构建简便易用的二合一PB转座系统。方法:通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)获取PiggyBac转座系统所需转座子元件和转座酶表达框,利用T4 DNA连接酶将转座酶表达框插入到pUC18载体上,再利用Gibson同源重组技术将转座子元件与重组载体结合构建二合一PB转座系统;使用该系统携带的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)以及功能性损伤抑制蛋白(damage-suppressing protein,DSUP)检测其有效性及可靠性。结果:在所有筛选获得的嘌呤霉素抗性细胞中,eGFP都是明亮可见;利用此二合一PB转座系统成功获得了可高效表达功能性损伤抑制蛋白的稳定细胞系,证明外源基因可被有效整合到基因组DNA中并表达。结论:成功构建了新型二合一PB转座系统,使稳定表达细胞系的建立更加经济简便。

关键词： PiggyBac转座子稳定转染 eGFP

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基于流式细胞技术SARS⁃CoV⁃2假病毒中和试验方法的建立

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病毒学报 2023年第4期39卷 913-922页

作者：张绪磊温莺芬钟可馨邢晓敏庾蕾广州医科大学附属市八医院广州510060

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS⁃CoV⁃2)是新型冠状病毒肺炎感染(Coronavirus disease 2019,COVID⁃19)的致病病毒。面对此类高传播风险及高致病性病毒,常采用复制缺陷型假病毒替代... 详细信息

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS⁃CoV⁃2)是新型冠状病毒肺炎感染(Coronavirus disease 2019,COVID⁃19)的致病病毒。面对此类高传播风险及高致病性病毒,常采用复制缺陷型假病毒替代活病毒用于疫苗及药物的抗病毒活性评估。本研究旨在建立了一种基于流式细胞技术(Flow cytometry,FCM)的高通量中和试验方法。使用HIV⁃1慢病毒骨架蛋白包装系统,将psPAX2、pLVX⁃eGFP、SARS⁃CoV⁃2 S三质粒共转染HEK293T细胞,包装一种带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,eGFP)的假病毒。通过优化S蛋白密码子序列、采用S蛋白C⁃端氨基酸(Amino acids,AA)截短和包装时间的优化,确定了假病毒包装最适条件。包装假病毒的滴定采用293T⁃hACE2细胞作为感染靶细胞,经流式细胞仪测定eGFP荧光细胞比率即为感染假病毒细胞比率。采用包装的野生型(Wild type,WT)和Omicron假病毒对感染Omicron变异株的COVID⁃19患者血浆抗体中和活性进行了检测。结果显示,12例COVID⁃19患者血浆对SARS⁃CoV⁃2 WT和Omicron假病毒均具有中和作用,平均半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)分别为631.2和139.0(血浆稀释倍数),且对WT株中和活性大于Omicron变异株。研究中我们将建立的中和试验方法与荧光素酶报告基因检测方法(Luciferase assay,LUCA)进行了比较,结果表明建立的FCM方法与常规使用的LUCA法具有同等的敏感性。本研究建立的基于流式细胞技术SARS⁃CoV⁃2假病毒中和试验方法,不需要裂解靶细胞等后续步骤即可直接对细胞进行检测。为疫苗的评估及抗病毒药物的筛选提供了一种高通量方法,同时为抗病毒机制的研究提供了一种手段。

关键词：新型冠状病毒假病毒流式细胞技术荧光素酶 eGFP 血浆抗体

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siRNA介导的甘蔗鞭黑粉菌基因沉默方法的建立

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基因组学与应用生物学 2022年第2期41卷 296-304页

作者：吴昊鸣张沛然卢姗仇金凤李茹陈保善广西大学生命科学与技术学院亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室南宁530004 广西大学农学院南宁530004 广西壮族自治区甘蔗生物学重点实验室南宁530004

甘蔗是全世界最重要的糖料作物。由甘蔗鞭黑粉菌(Sporisorium scitamineum)引起的甘蔗黑穗病是一个全球性的病害,对甘蔗生产造成巨大危害。RNA干扰技术是一种快速有效的研究基因功能的方法,然而尚没有在甘蔗鞭黑粉菌中利用RNA干扰研究... 详细信息

甘蔗是全世界最重要的糖料作物。由甘蔗鞭黑粉菌(Sporisorium scitamineum)引起的甘蔗黑穗病是一个全球性的病害,对甘蔗生产造成巨大危害。RNA干扰技术是一种快速有效的研究基因功能的方法,然而尚没有在甘蔗鞭黑粉菌中利用RNA干扰研究基因功能的报道。本研究以荧光蛋白基因eGFP为靶标,构建了表达eGFP的菌株JG35-eGFP和含有eGFP基因回文序列的干扰菌株JG36-eGFP-RNAi,将其进行有性配合,结果显示,eGFP基因表达量及荧光强度均显著下降,表明甘蔗鞭黑粉菌的RNA干扰系统构建成功。我们用此干扰系统对甘蔗鞭黑粉菌的效应物基因g2476的功能进行研究,发现目的基因在单倍体及有性配合形成的菌丝中表达水平均明显下调,但RNA干扰单倍体的有性配合能力并无明显变化。甘蔗鞭黑粉菌中RNA干扰方法的建立为该菌基因功能研究提供了新的工具,并为培育HIGS(Host induced gene silencing)抗病植株奠定了基础。

关键词：甘蔗鞭黑粉菌 RNA干扰报告基因 eGFP 效应物

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基于FMDV 2A肽的新城疫病毒共表达系统的构建及验证

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中国兽医科学 2023年第2期53卷 198-206页

作者：王海蓉李泽典任园园陈建余祖华魏颖丁轲陈松彪贾艳艳郁川张春杰何雷洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室河南洛阳471003 河南科技大学功能微生物与畜禽健康实验室河南科技大学动物科技学院河南洛阳471003 洛阳职业技术学院河南洛阳471003

为构建表达双外源基因的重组新城疫病毒(NDV)反向遗传学表达体系,本研究利用口蹄疫病毒(FMDV)2A序列构建同时表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因和红色荧光蛋白(RFP)基因的重组NDV(rLS-eGFP-F2A-RFP),并检测双外源蛋白的表达水平。生物... 详细信息

为构建表达双外源基因的重组新城疫病毒(NDV)反向遗传学表达体系,本研究利用口蹄疫病毒(FMDV)2A序列构建同时表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因和红色荧光蛋白(RFP)基因的重组NDV(rLS-eGFP-F2A-RFP),并检测双外源蛋白的表达水平。生物学特性检测结果显示,重组病毒保持了亲本La Sota株的鸡胚高滴度生长以及低致病力的遗传特性,生长曲线分析表明,重组病毒具有与亲本毒株相似的生长动力学特性,在细胞培养中能够稳定复制;荧光观察结果表明,eGFP和RFP蛋白在重组病毒感染细胞中均获得表达且具有生物学活性;Western-blot试验结果表明,F2A肽在重组NDV表达系统中发挥了良好的自剪切功能,双外源蛋白均可独立表达。本研究为NDV多联疫苗的研发提供实验依据和技术平台。

关键词：重组新城疫病毒 F2A肽 eGFP RFP 共表达体系

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绵羊c-Myc与eGFP融合蛋白的真核表达及其对细胞增殖的调控作用

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畜牧兽医学报 2020年第5期51卷 965-975页

作者：韩高链郭丽荣李孟心郑腾飞李俊玲秦健杜荣山西农业大学动物科技学院太谷030801 山西农业大学实验教学中心太谷030801 山西农业大学生命科学学院太谷030801

为了探讨c-Myc基因对细胞增殖及相关基因表达的调控作用,本试验构建了c-Myc-(G4S)3-eGFP融合基因的真核表达载体pc-Myc-eGFP,并利用生物信息学分析了其结构和理化特征。转染后分别通过细胞计数和qRT-PCR检测了其对绵羊胚胎成纤维细胞(sh... 详细信息

为了探讨c-Myc基因对细胞增殖及相关基因表达的调控作用,本试验构建了c-Myc-(G4S)3-eGFP融合基因的真核表达载体pc-Myc-eGFP,并利用生物信息学分析了其结构和理化特征。转染后分别通过细胞计数和qRT-PCR检测了其对绵羊胚胎成纤维细胞(sheep embryonic fibroblasts,SEF)增殖及相关基因表达的影响,并利用启动子分析软件解析了相应的表达调控机制。酶切鉴定和测序结果表明,载体构建成功。生物信息学分析表明,绵羊c-Myc蛋白主要定位于细胞核,含有螺旋环螺旋(helix-loop-helix,HLH)结构域,其分子量为48474.78 u。融合蛋白c-Myc-(G4S)3-eGFP有较强的亲水性,且含有31个磷酸化位点。因(G4S)3有较高的灵活度(9.8485),两侧的c-Myc和eGFP都保持各自的空间构象且互不干扰。进一步的细胞试验结果表明,重组质粒pc-Myc-eGFP在SEF中能够表达。过表达c-Myc促进了SEF的增殖,使cyclin D2、Cdk4、Cdk6、cyclin E1、cyclin A2、cdc25A mRNA的表达水平分别升高至5.20、3.10、6.54、6.52、23.37和8.22倍(P<0.01),E2F1 mRNA的表达升高至1.83倍(P<0.05)。启动子分析结果表明,各基因的5′调控区存在c-Myc和E2F1的结合元件。综上所述,绵羊c-Myc通过上调细胞周期相关基因的表达促进SEF细胞增殖,c-Myc的作用机制可能是通过直接作用于靶基因5′调控区的E-box元件,也可能是通过其他转录因子(如E2F1)的间接调控作用而实现。

关键词：绵羊 c-Myc基因 eGFP 真核表达生物信息学细胞周期相关基因调控元件

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噬菌体展示技术筛选抗eGFP纳米抗体

噬菌体展示技术筛选抗EGFP纳米抗体

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作者：周建松云南大学

学位级别：硕士

增强绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,eGFP)是绿色荧光蛋白(GFP)的突变体,发光强度较GFP提高35倍,因其产生自发荧光且发光稳定,被广泛应用于分子标记、显像与示踪等科学研究中。针对eGFP的抗体研究更多的还是传统的多... 详细信息

增强绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,eGFP)是绿色荧光蛋白(GFP)的突变体,发光强度较GFP提高35倍,因其产生自发荧光且发光稳定,被广泛应用于分子标记、显像与示踪等科学研究中。针对eGFP的抗体研究更多的还是传统的多克隆及单克隆抗体,不过传统抗体分子量较大,应用中会因此受限,而纳米抗体是目前已知的具有抗原识别活性的最小抗体单位,其有体积小、穿透性强、易改造等传统抗体不具备的优势,因此本文致力于寻找高亲和力抗eGFP纳米抗体并开展相关研究。本研究利用噬菌体展示技术,从羊驼(Vicugna pacos)来源的天然噬菌体库中筛选得到抗eGFP纳米抗体,经测序得知其基因序列后,将其构建到真核表达载体上,并转染到HEK293细胞中共表达,通过免疫共沉淀技术检测抗原eGFP与纳米抗体之间的相互作用。由于从天然噬菌体库中得到的抗eGFP纳米抗体亲和力一般,因此本研究对纳米抗体的互补决定区3(complementarity determining region3,CDR3)进行氨基酸定点突变,以期获得亲和力更高的纳米抗体。主要研究内容如下:1、利用大肠杆菌BL21(DE3)表达系统,经镍柱亲和纯化得到eGFP作为噬菌体展示技术中所需抗原;2、采用固相亲和生物淘选的方法筛选得到14个抗eGFP阳性噬菌体克隆,通过酶联免疫吸附检测(ELISA)发现筛选得到的纳米抗体与牛血清白蛋白(BSA)无交叉反应且特异性较好,因此进一步进行多序列比对分析,得到3种纳米抗体基因序列:VHH1、VHH2和VHH3;3、利用基因工程技术将E1-2、E1-12、A2-9和G2-5四个克隆的抗eGFP纳米抗体分别与flag标签融合于pc DNA3.0真核表达载体上,eGFP则与myc标签融合于pc DNA3.0真核表达载体上;然后通过免疫共沉淀技术检测抗原与抗体的相互作用。实验结果显示,两种纳米抗体序列(VHH2和VHH3)的四个实验组(E1-12-(1)、E1-12-(2)、A2-9和G2-5)与抗原eGFP在细胞内有相互作用,但互作能力一般;4、对筛选得到的E1-12纳米抗体的CDR3区进行氨基酸定点突变,结合免疫共沉淀技术,检测到结果中有三个突变体亲和力得到提高,其中突变体E1-12-S104K的亲和力最高,E1-12-S104R和E1-12-S104Q次之。突变体E1-12-S104W、E1-12-S104G、E1-12-S104E的亲和力较E1-12不增反减,突变体E1-12-A99V、E1-12-G100N、E1-12-P103F则失去了与eGFP的亲和力。结果说明CDR3区上的氨基酸对于抗eGFP纳米抗体结合抗原很重要,特别是该区域的热点序列,因此推测可能是由于这些氨基酸参与抗体结合区的结构微调,导致其亲和力变化。

关键词： eGFP 抗eGFP纳米抗体噬菌体展示技术抗体亲和力成熟

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Use of electroporation as an option to transform the horn fly, Haematobia irritans： a species recalcitrant to microinjection

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Insect Science 2016年第4期23卷 621-629页

作者： Qiang Xu Felix D. Guerrero Azhahianambi Palavesam Adalberto A. Perez de Leon Department of Biology Abilene Christian University Abilene TX 79699 USA USDA-ARS Knipling-Bushland U.S. Livestock Insects Research Laboratory 2700 Fredericksburg Rd. Kerrville TX 78028 USA USDA-ARS Veterinary Pest Genomics Center Kerrville TX 78028 USA

The horn fly, Haematobia irritans, is a serious pest of cattle in North America. The control of horn flies has primarily relied on insecticides. However, the heavy use of insecticides has led to the development of insecticide resistance in horn flies. Novel methods to control horn flies are greatly needed. Transgenic technology is an effective tool to genetically modify insects and may lead to novel methods of pest control based on genomic approaches. Here we report apiggyBac-mediated transformation of the horn fly via electroporation. Transformation with a DsRed fluorescent marker protein coding region was verified by PCR analysis of individual fly bodies and pupal cases and sequencing of PCR products. However, Southern blot analysis failed to indicate the DsRed gene was integrated into the horn fly genome. Thus, the electroporation protocol may have caused the DsRed gene to be integrated into bacterial symbionts of the horn fly.

关键词： DsRed eGFP electroporation Haematobia irritans horn fly transformation transgenic insect

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高亲和力抗eGFP纳米抗体的筛选与应用

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南昌大学学报（理科版） 2021年第1期45卷 34-40页

作者：刘晓芳刘贝周方月黄云祥钟引凤张茹云梁宇芳王丹付金衡南昌大学生命科学学院江西南昌330031 南昌大学中德联合研究院江西南昌330047 江西农业大学江西南昌330045

将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,eGFP)免疫羊驼后构建纳米抗体免疫库,固相淘选eGFP纳米抗体;构建E.coli Rosetta表达载体,诱导表达纳米抗体,并鉴定其结合活性及特异性;辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase... 详细信息

将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,eGFP)免疫羊驼后构建纳米抗体免疫库,固相淘选eGFP纳米抗体;构建E.coli Rosetta表达载体,诱导表达纳米抗体,并鉴定其结合活性及特异性;辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)标纳米抗体,确定其工作浓度及稳定性;将纳米抗体与纳米磁珠偶联应用于免疫沉淀B13-eGFP融合蛋白。四免后抗血清滴度超过1.28×10^(6),获得库容量为1.85×10^(8) cfu的抗eGFP纳米抗体噬菌体展示文库;原核表达10种独特基因序列的纳米抗体,均为可溶性表达;采用ForteBio Octet确定出纳米抗体4-28与eGFP的亲和常数(KD)最高,达到9.67×10^(-11)M;纳米抗体4-28与eGFP、绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)特异性结合;HRP标记纳米抗体4-28检测范围是1:10000~1:25000(浓度100~40 ng·mL^(-1)),比市场上现有的检测二抗(稀释范围1:5000~1:20000)灵敏度更高;纳米抗体4-28偶联羧基化纳米磁珠,免疫沉淀B13-eGFP融合蛋白,实现了简单快速分离目的蛋白B13-eGFP。

关键词：纳米抗体 eGFP 噬菌体展示 ELISA IP

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