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江苏农业科学 2024年第17期 58-64页

作者：操义恒贾开文党士荣胡亚辉王巧梅俞杰郭云霞周霞黄新钟发钢韩猛立吴桐忠张倩石河子大学动物科技学院新疆农垦科学院畜牧兽医研究所

为研究绵羊肺源大肠杆菌cyaa基因的分子特征、抗原性及其遗传进化关系，采用PCR技术对绵羊肺源大肠杆菌XJ10菌株的cyaa基因进行扩增、克隆并测序，应用定量PCR检测cyaa基因在不同培养阶段的mRNA表达量，利用在线软件对其进行编码蛋白分... 详细信息

为研究绵羊肺源大肠杆菌cyaa基因的分子特征、抗原性及其遗传进化关系，采用PCR技术对绵羊肺源大肠杆菌XJ10菌株的cyaa基因进行扩增、克隆并测序，应用定量PCR检测cyaa基因在不同培养阶段的mRNA表达量，利用在线软件对其进行编码蛋白分子特征、抗原性及其遗传进化分析。结果显示，cyaa基因全长2 547 bp,编码848个氨基酸；cyaa基因在细菌对数期的mRNA表达量最高，其次是稳定期及迟缓期，在衰亡期的mRNA表达量最低；氨基酸序列分析发现，分子式为C4 389H6 759N1 193O1 273S30,理论分子质量为97.57 ku,理论等电点为5.82,为酸性亲水性蛋白，稳定性较低；二级结构中α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-折叠所占比例分别为42.81%、39.03%、14.27%和3.89%。AC蛋白无信号肽与跨膜区，保守结构域位于1～848位氨基酸，属于腺苷酸环化酶超家族，具有14个开放阅读框，存在81个磷酸化位点。AC蛋白B细胞优势表位共16个，分别位于第44～51、61～65、248～250、259～267、296～304、355～366、436～439、456～456、476～481、489～490、540～559、589～597、634～640、717～722、766～773、806～806区段；遗传进化分析发现大肠杆菌XJ10菌株AC蛋白与志贺氏菌AC蛋白相似性最高。本试验结果为进一步研究大肠杆菌AC蛋白的功能及其作为大肠杆菌疫苗候选抗原奠定了基础。

关键词：绵羊肺源大肠杆菌 cyaa基因分子特征抗原性遗传进化

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cyaa基因对绵羊肺源肠外致病大肠杆菌XJ10毒力的影响研究

cyaA基因对绵羊肺源肠外致病大肠杆菌XJ10毒力的影响研究

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作者：柴迎锦石河子大学

学位级别：硕士

肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic ***,ExPEC)能引起人和动物脑膜炎、败血症、泌尿道感染、肺炎等疾病,导致动物较高的死亡率。研究发现ExPEC的毒力与其携带的毒力因子密不可分。由cyaa基因编码的环腺苷酸合成酶(Adenylat... 详细信息

肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic ***,ExPEC)能引起人和动物脑膜炎、败血症、泌尿道感染、肺炎等疾病,导致动物较高的死亡率。研究发现ExPEC的毒力与其携带的毒力因子密不可分。由cyaa基因编码的环腺苷酸合成酶(Adenylate Cyclase,AC)可以催化ATP形成的环腺苷酸(Cyclic Adenosine Monophosphate,cAMP)与其受体蛋白结合可调节大肠杆菌(***)近50%的包括毒力因子在内的基因的转录。作者所在实验室从表现为严重呼吸道感染死亡的羊肺脏组织中分离鉴定得到10株ExPEC(XJ01-XJ10),并在XJ10菌株中检测到cyaa基因。目的:为研究cyaa基因对XJ10毒力及其他特性的影响,本论文通过构建cyaa基因的缺失株和互补株,分析cyaa基因对XJ10 BF形成能力、细胞黏附和侵袭能力以及LD等的影响。方法:(1)采用同源重组的方式构建XJ10的cyaa基因缺失株;扩增cyaa全长并克隆至pHSG396质粒得到pHSG396-cyaa重组质粒,将其电转入缺失株的感受态细胞中,筛选正确的互补株,对3株菌的菌落形态和生长曲线进行观察。(2)应用实时荧光定量PCR检测cyaa基因对XJ10碳源利用和黏附侵袭相关基因的转录调控影响;采用96孔细胞板培养细菌结合结晶紫染色法定性和定量菌株BF的形成能力,寇氏标准法测定LD检测cyaa基因对XJ10毒力的影响。(3)通过活菌计数的方式检测cyaa基因在XJ10对TC-1细胞黏附和侵袭能力的影响;采用实时荧光定量PCR法检测不同菌株人工感染小鼠后肺脏紧密连接和基膜相关基因表达情况。结果:(1)成功构建XJ10的cyaa基因缺失株XJ10-Δcyaa和互补株cyaa/Δcyaa,3株菌的菌落形态一致,但XJ10-Δcyaa利用乳糖的能力下降且生长速率显著低于XJ10;cyaa/Δcyaa的乳糖利用能力与生长速率虽低于XJ10,但要高于XJ10-Δcyaa。(2)与XJ10相比,XJ10-Δcyaa碳源利用和黏附侵袭相关的8种基因转录水平下调,其中gltA、fabB和pap基因的表达量差异显著(P基因表达量差异不显著(P>0.05);XJ10-Δcyaa只在第12和24 h形成了BF的碎片,未见明显BF网状结构,cyaa/Δcyaa的BF形成规律与XJ10的一致,但形成的BF形态较为松散稀疏;XJ10-Δcyaa的LD较XJ10升高了1.8倍,差异显著(Pcyaa/Δcyaa的LD较XJ10-Δcyaa下降了1.3倍。(3)XJ10-Δcyaa对TC-1细胞的黏附菌数少于XJ10,差异显著(Pcyaa/Δcyaa的黏附菌数少于XJ10但多于XJ10-Δcyaa,差异显著(Pcyaa对TC-1的侵袭菌数在各个时间点均减少,差异显著(Pcyaa/Δcyaa菌株各个时间点的侵袭菌数少于XJ10,但多于XJ10-Δcyaa且差异均显著(Pcyaa的occluding、zo-1 mRNA表达量减少,差异均显著(Pcyaa基因缺失降低了XJ10的生长速率和对乳糖的利用能力。(2)cyaa基因缺失导致XJ10碳源利用和黏附侵袭相关基因的转录水平下调,降低了BF形成能力和毒力。(3)cyaa基因缺失减少了XJ10对TC-1细胞的黏附和侵袭能力,同时也降低了感染XJ10后小鼠的肺脏紧密连接和基膜相关基因的转录水平。

关键词：绵羊肺大肠杆菌XJ10 cyaa基因细胞黏附和侵袭生物被膜毒力基因

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绵羊肺源大肠杆菌cyaa基因缺失对小鼠肺泡巨噬细胞感染的影响

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中国预防兽医学报 2023年第3期45卷 295-301页

作者：操义恒王子杰王巧梅党士荣张丽媛马雪张乾义周霞黄新张星星吴桐忠钟发钢石河子大学动物科技学院新疆石河子832003 新疆农垦科学院省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室新疆石河子832000 中国兽医药品监察所北京100081

为研究cyaa基因编码的腺苷酸环化酶(AC)在绵羊肺源大肠杆菌XJ10感染小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S)中的作用,本研究以绵羊肺源大肠杆菌XJ10野毒株(XJ10WT)为对照,通过荧光定量PCR检测XJ10 cyaa基因缺失株(XJ10Δcyaa)在感染MH-S细胞过程中与黏... 详细信息

为研究cyaa基因编码的腺苷酸环化酶(AC)在绵羊肺源大肠杆菌XJ10感染小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S)中的作用,本研究以绵羊肺源大肠杆菌XJ10野毒株(XJ10WT)为对照,通过荧光定量PCR检测XJ10 cyaa基因缺失株(XJ10Δcyaa)在感染MH-S细胞过程中与黏附侵袭相关的motA、crl、fimH、pap基因的m RNA转录水平,结果显示,与XJ10WT相比,XJ10Δcyaa在感染MH-S细胞过程中与黏附侵袭相关的motA、crl、fimH、pap基因的m RNA转录水平在感染后0和6 h时均极显著降低(P基因的m RNA转录水平分别在2 h和12 h时均极显著上调(Pcyaa黏附MH-S细胞情况,采用细胞和细菌共培养方式分析XJ10Δcyaa对MH-S细胞的黏附及侵袭能力,并通过CCK-8法分析细菌对MH-S细胞增殖的抑制情况。结果显示,XJ10Δcyaa和XJ10WT在感染后3 h黏附MH-S细胞的活菌数量达峰值并持续至5 h,随后逐渐下降,在感染后1 h~5 h的时间段内,XJ10Δcyaa黏附MH-S细胞的活菌数量均极显著低于XJ10WT(Pcyaa和XJ10WT侵袭MH-S细胞的活菌数量随着感染时间的延长逐渐升高,5 h时达到峰值,后持续下降,XJ10Δcyaa在感染后1 h~10 h侵袭MH-S细胞的活菌数量均显著或极显著低于XJ10WT。在感染MH-S细胞后的3 h~6 h,XJ10Δcyaa对细胞增殖的抑制率均极显著低于XJ10WT(Pcyaa基因表达的AC可以显著上调绵羊肺源***与黏附侵袭相关基因的转录水平,并参与绵羊肺源***对MH-S细胞的黏附与侵袭,抑制MH-S细胞增殖。本研究为绵羊肺源***致病机制的研究奠定了基础。

关键词：绵羊肺源大肠杆菌 cyaa基因小鼠肺泡巨噬细胞黏附及侵袭细胞增殖抑制率

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绵羊肺源大肠杆菌cyaa基因缺失对细菌致病力及生物被膜形成影响的研究

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黑龙江畜牧兽医 2020年第2期 66-68,147页

作者：柴迎锦郭强强顾晓晓邬琴李劼韩猛立周霞钟发刚黄新张星星新疆农垦科学院省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室新疆石河子832000 石河子大学动物科技学院新疆石河子832003

为了研究cyaa基因缺失对XJ10的生化特性、生物被膜(BF)形成以及致病力的影响,试验将复苏后的XJ10和XJ10-Δcyaa涂布于LB培养基,37℃培养过夜后观察菌落形态;通过生化鉴定仪对XJ10和XJ10-Δcyaa的单菌落进行生化鉴定;采用96孔聚苯乙烯微... 详细信息

为了研究cyaa基因缺失对XJ10的生化特性、生物被膜(BF)形成以及致病力的影响,试验将复苏后的XJ10和XJ10-Δcyaa涂布于LB培养基,37℃培养过夜后观察菌落形态;通过生化鉴定仪对XJ10和XJ10-Δcyaa的单菌落进行生化鉴定;采用96孔聚苯乙烯微孔板培养XJ10和XJ10-Δcyaa,观察不同时间段BF形态;对昆明系小鼠进行腹腔注射,通过观察小鼠精神状态及死亡数来研究XJ10与XJ10-Δcyaa的毒力。结果表明:与XJ10相比,XJ10-Δcyaa的菌落形态未发生明显改变,但是生长缓慢,且直径明显小于XJ10的菌落;XJ10-Δcyaa对蔗糖、侧金盏花醇、D-麦芽糖、β-半乳糖苷酶、D-甘露醇、D-海藻糖、D-山梨醇反应均为阴性,失去了对它们的利用能力;XJ10可以形成完整的BF,但XJ10-Δcyaa未形成BF;小鼠毒力检测发现XJ10-Δcyaa的致病性降低。说明cyaa基因可以影响XJ10对部分碳源的利用,缺失cyaa基因的XJ10的BF形成能力以及致病力都明显下降。

关键词：绵羊肺源大肠杆菌 cyaa基因菌落形态生物被膜碳源致病力

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绵羊肺源大肠杆菌腺苷酸环化酶对小鼠肺泡巨噬细胞损伤作用的初步研究

绵羊肺源大肠杆菌腺苷酸环化酶对小鼠肺泡巨噬细胞损伤作用的初步...

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作者：操义恒石河子大学

学位级别：硕士

目的:肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic ***,Ex PEC)是人畜共患病的重要病原,能引起人和动物肺炎、新生儿脑膜炎、败血症等疾病。腺苷酸环化酶(Adenylate cyclase,AC)是一类与细菌毒力密切相关的毒力因子,其编码基因cya ... 详细信息

目的:肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic ***,Ex PEC)是人畜共患病的重要病原,能引起人和动物肺炎、新生儿脑膜炎、败血症等疾病。腺苷酸环化酶(Adenylate cyclase,AC)是一类与细菌毒力密切相关的毒力因子,其编码基因cya A是某些细菌基因组中具有调节毒力功能的最重要基因之一,对细菌多种生理功能具有调节作用。为了研究引起绵羊肺炎的Ex PEC XJ10的AC如何作用呼吸道感染重要屏障——肺泡巨噬细胞(MH-S),本试验将分离于绵羊肺炎的Ex PEC XJ10和cya A基因缺失株感染MH-S,收集细胞进行转录组学和蛋白质组学测定,系统分析绵羊肺源Ex PEC XJ10的AC在呼吸系统感染中对MH-S的作用,为阐明绵羊肺源***感染机制提供有意义数据。方法:(1)以绵羊肺炎Ex PEC野毒株XJ10(XJ10WT)为对照,用q PCR方法检测缺失cya A基因的XJ10(XJ10Δcya A)粘附侵袭相关基因m RNA表达水平;用细胞和细菌共培养方法分析XJ10Δcya A对MH-S细胞的粘附侵袭能力以及CCK-8法分析细菌对MH-S细胞增殖抑制情况;用流式细胞仪检测与细菌共培养后的细胞的凋亡率。(2)将XJ10WT和XJ10Δcya A分别与MH-S细胞共培养,收集细胞进行m RNA转录组学的测定,对数据进行差异性分析,筛选出差异显著的基因、信号通路,通过q PCR方法验证。(3)将XJ10WT和XJ10Δcya A分别与MH-S细胞共培养,收集细胞进行TMT蛋白质组学的测定,对数据进行差异性分析,筛选出差异显著的蛋白、信号通路,通过Western blot方法验证,同时用ELISA方法检测细胞上清中IL-1β、Il-6、TNF-α的含量。结果:(1)与野毒株相比,缺失株与粘附侵袭相关的6个基因转录水平均下调,其中crl、csg A、flu、pap、mot A基因的差异极显著。以感染复数100感染MH-S细胞时,缺失株和野毒株粘附菌量在2h到达饱和并持续至5h,侵袭菌量从1h上升至5h达到峰值,后持续下降;两株菌以感染比10感染MH-S细胞时,粘附细胞的菌量在5h到达峰值后开始下降,侵袭细胞的菌量在7h到达顶峰后逐渐减少。在不同感染复数和不同时间段内,缺失株的黏附侵袭菌量均少于野毒株。两株菌在感染复数为100时的细胞增殖抑制率在3h-6h时,缺失株对细胞增殖的抑制率显著低于野毒株;在1h-6h时,感染复数100的菌量对细胞的增殖抑制率明显高于感染复数10的菌量。(2)m RNA转录组测序结果显示,与野毒株感染组相比,缺失株感染组共筛选出73个差异表达基因,其中表达显著上调的有56个,表达显著下调的有17个;GO分析的分子功能、细胞组分及参与的生物过程共3项本体中分别富集到2571、271及357条GO term,KEGG分析中共富集到包括JAK-STAT信号通路、坏死性凋亡、NF-κB信号通路在内的131条pathway,其中富集到急性炎症反应上的基因的m RNA表达量都发生了显著上调;q PCR验证结果与转录组测序结果一致。(3)TMT蛋白质组测序结果表明,与野毒株感染组相比,缺失株感染组从鉴定的7070个蛋白中共筛选出123个差异表达蛋白,其中表达显著上调的有54个,表达显著下调的有69个;在GO分析的分子功能、细胞组分及参与的生物过程共3项本体中分别富集到499、369及2948条GO term,在KEGG分析中共富集到包括细胞因子-细胞因子受体的相互作用,NF-κB信号通路,TNF信号通路在内的87条pathway。联合组学分析发现筛选到的Bcl2a1和Il1b主要参与NF-κB信号通路和细胞凋亡;Western blot验证结果蛋白质组测序结果一致;ELISA方法检测细胞上清中IL-1β、Il-6、TNF-α的含量发现XJ10Δcya A感染组能刺激MH-S细胞分泌产生更多的IL-1β、IL-6和TNF-α。结论:(1)cya A基因缺失导致XJ10的粘附侵袭相关基因转录水平下调,对MH-S细胞的粘附侵袭能力下降,对细胞增殖抑制率下降,对细胞凋亡率下降。(2)AC可通过NF-κB信号通路影响大肠杆菌感染宿主细胞,诱导宿主细胞凋亡和抑制炎性因子分泌。(3)Bcl2a1和Il1b是转录组和蛋白质组学关联筛选到两个显著上调的数据,参与NF-κB信号通路和细胞凋亡。

关键词：绵羊肺源大肠杆菌XJ10 cyaa基因小鼠肺泡巨噬细胞细胞转录组学蛋白质组学

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