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Smac基因的克隆及其对Burkitt′s淋巴瘤

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中华儿科杂志 2005年第7期43卷 503-506页

作者：陆超吴升华陈吉庆赵非池霞潘晓勤费莉郭梅黄松明郭锡熔陈荣华南京医科大学第一附属医院儿科 210029 南京市儿童医院肾科南京医科大学儿科研究所

目的克隆人促凋亡基因(secondmitochondriaderivedactivatorofcaspases,Smac),研究Smac基因转染对Burkitt′s淋巴瘤Raji细胞的促凋亡作用。方法从人胚肾293细胞中扩增人Smac基因全长的cDNA;构建含Smac基因全长cDNA的真核表达载体pcDNA3.1/Smac,并转染人Burkitt′s淋巴瘤Raji细胞;用Westernblot测定外源基因的表达;Hoechest33258和碘化丙锭双荧光染色,结合激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡形态;流式细胞仪分析细胞凋亡百分率;比色法测定caspase3酶活性。结果成功克隆人Smac基因全长cDNA,并构建真核表达载体pcDNA3.1/Smac;转染人Smac基因全长cDNA的真核表达载体24h,可显著诱导Burkitt′s淋巴瘤Raji细胞的凋亡,凋亡百分率达(43.7±2.5)%;转染人Smac基因全长cDNA的真核表达载体24h,可显著诱导Raji细胞中caspase3酶活性上调,吸光度为0.936±0.041,与正常对照组(0.138±0.026)及空载体转染对照组(0.136±0.036)相比,Pcaspase3酶活性上调有关。

关键词： Burkitt Smac基因促凋亡作用 caspase-3酶活性淋巴瘤细胞真核表达载体pcDNA3.1 真核表达载体pcDNA3.1 Raji细胞全长cDNA activator caspases 人胚肾293细胞 Western 流式细胞仪分析细胞凋亡促凋亡基因激光共聚焦

Par-4基因在PC12细胞缺氧后的表达及其反义寡核苷酸的抗凋亡作用

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江苏医药 2005年第6期31卷 451-453,i001页

作者：陈吉庆陆超黄松明郭锡熔陈荣华南京医科大学第一附属医院儿科 210029 南京医科大学儿科研究所

目的研究前列腺凋亡反应基因4(Par4)在PC12细胞缺氧后的表达及其反义寡核苷酸(ASODN)的抗凋亡作用。方法在正常或缺氧条件下培养PC12细胞,分组将不同浓度Par4反义寡核苷酸转染PC12细胞,吖啶橙/溴化乙锭荧光染色观察PC12细胞形态,流式细... 详细信息

目的研究前列腺凋亡反应基因4(Par4)在PC12细胞缺氧后的表达及其反义寡核苷酸(ASODN)的抗凋亡作用。方法在正常或缺氧条件下培养PC12细胞,分组将不同浓度Par4反义寡核苷酸转染PC12细胞,吖啶橙/溴化乙锭荧光染色观察PC12细胞形态,流式细胞分析评价凋亡百分率。Westernblot测定Par4蛋白表达量,比色法检测caspase3的酶活性。结果缺氧24h,PC12细胞中Par4蛋白表达量上调157.42±7.53,明显高于正常对照组10.51±3.36(P31.79±3.09,明显低于缺氧组157.42±7.53(P34.5±3.5)%,明显低于缺氧组的(69.3±5.7)%(Pcaspase3的酶活性上调,10μmol/LASODN使其活性降为0.549±0.078,与缺氧组0.917±0.051相比,差别有显著性意义(Pcaspase3酶活性下调有关。

关键词： Par-4基因抗凋亡作用细胞缺氧表达及 caspase-3酶活性 PC12细胞凋亡 AS-ODN 反义寡核苷酸转染 Western 缺氧诱导缺氧条件下正常对照组 mol/L 反应基因不同浓度细胞形态染色观察溴化乙锭分析评价流式细胞 blot

左旋—二脱水伊地醇双甲磺酸酯体外抗肿瘤效应及其机制初步研究

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左旋—二脱水伊地醇双甲磺酸酯体外抗肿瘤效应及其机制初步研究

作者：曾春广西医科大学

学位级别：硕士

左旋-二脱水伊地醇双甲磺酸酯（DMDAI-L）主要以甘露醇为原料合成,属于烷化剂类细胞抑制剂。根据文献报道,DMDAI-L具有明显体内抗肿瘤活性,尤其是对于相对广谱的动物移植性固体及腹水肿瘤均有显著的抑制作用。DMDAI-L的体外抗肿瘤活性... 详细信息

左旋-二脱水伊地醇双甲磺酸酯（DMDAI-L）主要以甘露醇为原料合成,属于烷化剂类细胞抑制剂。根据文献报道,DMDAI-L具有明显体内抗肿瘤活性,尤其是对于相对广谱的动物移植性固体及腹水肿瘤均有显著的抑制作用。DMDAI-L的体外抗肿瘤活性目前未见国内外相关文献报道,本课题通过选用多种人肿瘤细胞进行体外筛选实验,研究DMDAI-L的体外抗肿瘤谱及其作用机制。目的： 1.考察DMDAI-L对多种人肿瘤细胞的增殖抑制作用,初步了解其抗肿瘤谱。 2.通过DMDAI-L对人正常肝细胞、人胚肾细胞的毒性实验,初步考察DMDAI-L的用药安全性。 3.以人原髓细胞白血病细胞HL-60为例,观察DMDAI-L对其的诱导凋亡作用,初步探讨其作用机制。方法： 1.采用CCK-8法检测不同浓度的DMDAI-L对多种人肿瘤细胞作用不同时间后的增殖抑制活性。 2.同样采用CCK-8法检测不同浓度的DMDAI-L对人正常肝细胞、人胚肾细胞生长的影响。 3.同时给予DMDAI-L以及五种临床上治疗白血病的药物包括顺铂、柔红霉素、阿糖胞苷、环磷酰胺、全反式维甲酸,比较DMDAI-L与这五种药物对HL-60细胞的增殖抑制作用。 4.以人原髓细胞白血病细胞HL-60为例,倒置显微镜观察细胞给药前后的形态改变,并通过Hoechst33258荧光染色法观察凋亡小体形成,同时透射电镜观察凋亡细胞内部结构。 5.通过流式细胞术PI单染法观察不同浓度DMDAI-L对HL-60细胞内DNA含量的影响以分析周期变化;流式细胞术Annexin-V/FITC-PI法检测细胞凋亡率变化。 6.通过酶解可见光底物DEVD-pNA测定给药前后HL-60细胞内的caspase-3酶活性变化。 7.膜电位依赖性结合的荧光探针JC-1标记法观察给药前后HL-60细胞内线粒体膜电位（△Ψm）的荧光变化。结果： 1. DMDAI-L对所选的多个系统来源的人肿瘤细胞（包括胃肠道、呼吸、生殖系统等）的抑制作用不明显。但是对血液系统来源的HL-60细胞抑制作用十分明显,并呈浓度时间依赖关系。DMDAI-L作用于HL-60细胞24h、48h、72h的IC50分别为57.514±2.089、5.234±0.754.2.451±0.092μg/mL 2. DMDAI-L在体外对人正常肝细胞HL-7702及人胚肾细胞293的生长影响非常小,例如DMDAI-L对人胚肾细胞293作用72h的IC50仅为109.992±0.983μg/mL 3.环磷酰胺及全反式维甲酸作用于HL-60细胞48h的增殖抑制作用不明显,DMDAI-L、柔红霉素、顺铂、阿糖胞苷作用于HL-60细胞48h的IC50分别为5.234±0.754、7.75±0.78、10.86±2.08、38.89±1.02μg/mL 4. Hoechst33258荧光染色分析显示DMDAI-L处理后的HL-60细胞呈现明显的凋亡细胞形态改变;透射电子显微镜观察可见到凋亡细胞皱缩,核染色质呈高度浓缩、边移,胞浆空泡化明显,可见高电子密度的凋亡小体产生。 5. DMDAI-L各剂量组随着作用时间延长,对HL-60细胞周期的影响表现为阻滞细胞于S期及G2/M期;同时,在一定的作用时间内（12h、24h、48h）,细胞凋亡率呈明显上升趋势。 6. DMDAI-L各剂量组作用24h,HL-60细胞内的caspase-3酶活性显著上升;在DMDAI-L作用下,随着浓度增加及作用时间延长,HL-60细胞内线粒体膜电位明显降低。结论： 1. DMDAI-L体外抗肿瘤活性具有一定选择性,对血液系统来源的人原髓细胞白血病细胞HL-60抑制作用明显。 2. DMDAI-L体外对人正常肝细胞HL-7702及人胚肾细胞293的生长影响非常小,初步判断DMDAI-L对人正常肝肾细胞的毒性很低。 3.与全反式维甲酸（ATRA）,顺铂（CDDP）,阿糖胞苷（ARAC）,柔红霉素（DNR）,环磷酰胺（CTX）五种临床抗白血病药物相比,DMDAI-L对人原髓细胞白血病HL-60细胞有更强的针对性及较强的增殖抑制作用。 4. DMDAI-L体外可诱导HL-60细胞凋亡,其作用机理可能是：①影响细胞周期分布,阻滞细胞于S期及G2/M期;②在一定剂量范围及作用时间内,激活或调节细胞内的caspase-3酶活性;③降低细胞线粒体膜电位。

关键词：左旋-二脱水伊地醇双甲磺酸酯(DMDAI-L) 人原髓细胞白血病细胞HL-60 增殖抑制作用细胞周期细胞凋亡 caspase-3酶活性

Ce3+对蒙古韭老化种子萌发及生理生化基础的影响

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Ce3+对蒙古韭老化种子萌发及生理生化基础的影响

作者：王佳琪内蒙古农业大学

学位级别：硕士

本实验用贮藏3年、5年和7年的蒙古韭种子作为实验材料,用Ce(Ce Cl),VC(活性氧抑制剂),caspase-3抑制剂(Ac-DEVD-C HO),VC+Ce和caspase-3抑制剂+Ce进行浸种处理,测定其萌发指标、离子含量、抗氧化酶系统、细胞色素c含量,caspase-3酶活性,... 详细信息

本实验用贮藏3年、5年和7年的蒙古韭种子作为实验材料,用Ce(Ce Cl),VC(活性氧抑制剂),caspase-3抑制剂(Ac-DEVD-C HO),VC+Ce和caspase-3抑制剂+Ce进行浸种处理,测定其萌发指标、离子含量、抗氧化酶系统、细胞色素c含量,caspase-3酶活性,MAPK3酶活性等生理指标,研究Ce及抑制剂对老化蒙古韭种子的影响。主要研究结论如下:1.不同处理对贮藏3年和5年的蒙古韭种子的各项萌发指标均有促进作用,对贮藏7年的蒙古韭种子萌发指标影响不大。VC+Ce处理显著提高贮藏3年的蒙古韭种子萌发率、发芽势、发芽指数和活力指数,与CK对比,显著提高1.19倍、3.33倍、1.38倍和1.36倍。caspase-3抑制剂处理对贮藏5年蒙古韭种子处理效果最好,其萌发率、发芽势、发芽指数和活力指数与CK相比,显著提高1.27倍、2.56倍、1.93倍和1.56倍***和caspase-3抑制剂+Ce处理均能提高不同贮藏年限蒙古韭种子各部位的Na、P、S和K元素相对含量,VC处理对元素相对含量无促进作用,caspase-3抑制剂处理能够促进各部位P元素相对含量的吸收,并且能够提高贮藏3年的S、K元素相对含量,VC+Ce处理促进P和S元素相对含量的吸收。***处理能够显著提高不同贮藏年限的蒙古韭种子SOD、APX酶的活性,不同处理均能提高不同贮藏年限的蒙古韭种子POD、CAT酶活性,各处理对提高贮藏7年的蒙古韭种子抗氧化酶活性效果更好。4.不同处理均能降低不同贮藏年限蒙古韭种子O产生速率。Ce处理并未降低其HO含量,而其它处理均能降低贮藏7年蒙古韭种子HO含量。Ce处理能够降低不同年限蒙古韭种子MDA含量,其它处理对降低MDA含量作用不大。***、VC+Ce和caspase-3抑制剂+Ce处理均能提高caspase-3酶活性,细胞色素c含量,MAPK3酶活性。而VC和caspase-3抑制剂处理则会降低caspase-3酶活性,细胞色c含量,MAPK3酶活性。

关键词：铈蒙古韭老化种子抗氧化酶系统 caspase-3酶活性

左旋-二脱水伊地醇双甲磺酸酯诱导HL-60细胞凋亡机制的研究

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中国药师 2015年第2期18卷 186-189页

作者：曹斌刘元曾春杨小叶杨斌广西中医药研究院南宁530022 广西医科大学药学院

目的:以人原髓细胞白血病细胞HL-60为例,观察左旋-二脱水伊地醇双甲磺酸酯(DMDAI-L)对HL-60细胞的诱导凋亡作用,初步探讨其作用机制。方法:通过酶解可见光底物DEVD-p NA测定给药前后HL-60细胞内的caspase-3酶活性;膜电位依赖性结合的荧... 详细信息

目的:以人原髓细胞白血病细胞HL-60为例,观察左旋-二脱水伊地醇双甲磺酸酯(DMDAI-L)对HL-60细胞的诱导凋亡作用,初步探讨其作用机制。方法:通过酶解可见光底物DEVD-p NA测定给药前后HL-60细胞内的caspase-3酶活性;膜电位依赖性结合的荧光探针JC-1标记法观察给药前后细胞线粒体膜电位(△Ψm)的荧光变化。结果:DMDAI-L 1.25,2.5,5,10和20μg·ml-1剂量组作用24 h后,HL-60细胞内的caspase-3酶活性显著上升(Pcaspase-3酶活性、降低细胞线粒体膜电位有关。

关键词：左旋-二脱水伊地醇双甲磺酸酯 HL-60细胞细胞凋亡 caspase-3酶活性

乙酰二脱水卫矛醇对L1210细胞caspase-3活性的影响

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四川生理科学杂志 2005年第4期27卷 159-161页

作者：邓晓慧范文燕郑风劲杨锦南刘小康四川大学基础医学与法医学院药理教研室成都610041 新乡医学院形态学教研室新乡453003

目的:探讨半胱氨酶-3(caspase-3)在二乙酰二脱水卫矛醇(d iacetyld ianhydrogalactitol,DADAG)诱导小鼠白血病L1210凋亡过程中的作用。方法:MTT法观察DADAG对L1210细胞的生长抑制作用;透射电镜检测细胞凋亡;caspase-3试剂盒测定细胞内Ca... 详细信息

目的:探讨半胱氨酶-3(caspase-3)在二乙酰二脱水卫矛醇(d iacetyld ianhydrogalactitol,DADAG)诱导小鼠白血病L1210凋亡过程中的作用。方法:MTT法观察DADAG对L1210细胞的生长抑制作用;透射电镜检测细胞凋亡;caspase-3试剂盒测定细胞内caspase-3的酶活性。结果:DADAG对L1210细胞有较强的体外增殖抑制作用,其IC50值为24.6 mg/L;DADAG可诱导L1210细胞发生凋亡及时间依赖性地升高caspase-3酶活性。结论:caspase-3在DADAG诱导的细胞凋亡中可能起重要作用。

关键词：二乙酰二脱水卫矛醇 L1210细胞凋亡半胱氨酶-3 caspase-3活性 caspase-3酶活性白血病L1210 细胞凋亡生长抑制作用增殖抑制作用

TNFα单克隆抗体对（狗）体外循环术后心肌细胞凋亡的影响

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中华国际医学杂志 2002年第1期2卷 65-69页

作者：张顺业哈斯朝鲁等华中科技大学同济医学院协和医院心脏外科，中国武汉430022 山西医科大学第一临床医院中心实验室

目的观察抗TNF－α单克隆体（MaTA)对（狗）常规CPB术后心肌细胞凋亡及其对caspase-3酶活性的影响。方法 10条用于模拟常规CPB手术的成年家犬随机分为对照组和MaTA处理组，每组各5条。MaTA处理组动物CPB前和开放升主动脉后分别经静... 详细信息

目的观察抗TNF－α单克隆体（MaTA)对（狗）常规CPB术后心肌细胞凋亡及其对caspase-3酶活性的影响。方法 10条用于模拟常规CPB手术的成年家犬随机分为对照组和MaTA处理组，每组各5条。MaTA处理组动物CPB前和开放升主动脉后分别经静脉注射MaTA(0.5μg/100ml）对照组动物不用MaTA处理。留取CPB前、中及CPB后3h的全层左心室标本，液氮保存，用原位TUNEL技术检测心肌细胞凋亡并记录每10^5个心肌细胞中凋亡阳性细胞数目。用Z－DEVD－AMC底物降解方法测定caspase-3酶活性。结果 CPB前手CPB中两组的心肌细胞凋亡数及caspase-3酶活性在组内和组间均无显著性差异（P＞0．05）。CPB术后3h两组的心肌细胞凋亡数均较CPB前和CPB中明显增高（P分别＜0．05），而处理组CPB术后心肌细胞凋亡数明显低于对照组（P＜0．05）；CPB术后3h两组的caspase-3酶活性也均较术前和术中显著性增高（P＜0．01，0．01，0．05和0．05），与对照组比较，MaTA处理组caspase-3活性也明显受到抑制（P＜0．02）。结论抗TNFα单克隆抗体可以明显地降低CPB术后心肌细胞凋亡。这一抑制作用伴随有对caspase-3酶活性的抑制。

关键词：抗TNF-α单克隆抗体心肌细胞凋亡体外循环 caspase-3酶活性