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Preparation of anti-mouse caspase-12 mRNA hammerhead ribozyme and identification of its activity in vitro

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World Journal of Gastroenterology 2005年第26期11卷 4094-4097页

作者： ShanJiang QingXie WeiZhang Xia-QiuZhou You-XinJin Departmentofinfectiousdisease RuijinHospitalShanghaiSecondMedicalUniversityShanghai200025China StateKeyLaboratoryofMolecularBiology ShanghaiInstituteofBiochemistryChineseAcadamyofSciencesShanghai200031China

AIM:To prepare and identify specific anti-mouse caspase-12 hammerhead ribozymes in vitro, in order to select a more effective ribozyme against mouse caspase-12 as a potential tool to rescue cells from endoplasmic reticulum stress induced apoptosis. METHODS: Two hammerhead ribozymes directed separately against 138 and 218 site of nucleotide of mouse caspase-12 mRNA were designed by computer software, and their DNA sequences were synthesized. The synthesized ribozymes were cloned into an eukaryotic expression vector-neorpBSKU6 and embedded in U6 SnRNA context for further study. Mouse caspase-12 gene segment was cloned into PGEM-T vector under the control of T7 RNA polymerase promoter (containing gene sequence from positions nt 41 to nt 894) as target. In vitro transcription both the ribozymes and target utilize T7 promoter. The target was labeled with [α-32P]UTP, while ribozymes were not labeled. After gel purification the RNAs were dissolved in RNase free water. Ribozyme and target were incubated for 90 min at 37 ℃ in reaction buffer (40 mmol/L Tris-HCL, pH 7.5, 10 mmol/L Mg2+). Molar ratio of ribozyme vs target was 30:1. Samples were analyzed on 6% PAGE (containing 8 mol/L urea). RESULTS: Both caspase-12 and ribozyme gene sequences were successfully cloned into expression vector confirmed by sequencing. Ribozymes and caspase-12 mRNA were obtained by in vitro transcription. Cleavage experiment showed that in a physiological similar condition (37 ℃, pH 7.5), Rz138 and Rz218 both cleaved targets at predicted sites, for Rz138 the cleavage efficiency was about 100%, for Rz218 the value was 36.66%. CONCLUSION: Rzl38 prepared in vitro can site specific cleave mouse caspase-12 mRNA with an excellent efficiency. It shows a potential to suppress the expression of caspase-12 in vivo, thus provided a new way to protect cells from ER stress induced apoptosis.

关键词： ER stress Apoptosis caspase-12 Ribozyme

针刺对惊厥性脑损伤大鼠海马神经元caspase-12蛋白及内质网Ca^(2+)表达的影响

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针刺研究 2022年第8期47卷 673-677,683页

作者：张慧马允吴旭刘振邦吴生兵昂文平杨帆安徽中医药大学针灸推拿学院合肥230038 芜湖市中医院安徽芜湖241000 中国科技大学生命科学学院合肥230012 安徽中医药大学科研实验中心合肥230038

目的:观察针刺对惊厥性脑损伤大鼠不同时点海马神经元内质网Ca^(2+)表达、细胞凋亡和caspase-12蛋白表达的影响,探讨针刺维持内质网钙稳态及抑制细胞凋亡级联反应的可能作用机制。方法:SD大鼠随机分为正常组、模型组、针刺组,每组36只... 详细信息

目的:观察针刺对惊厥性脑损伤大鼠不同时点海马神经元内质网Ca^(2+)表达、细胞凋亡和caspase-12蛋白表达的影响,探讨针刺维持内质网钙稳态及抑制细胞凋亡级联反应的可能作用机制。方法:SD大鼠随机分为正常组、模型组、针刺组,每组36只。采用腹腔一次性注射惊厥剂量(50 mg/kg)戊四唑造成大鼠惊厥。针刺组于惊厥后即刻针刺“百会”“大椎”30 min。各组分别于惊厥发作后2、12、48 h采用TUNEL法检测海马神经元细胞凋亡情况;采用内质网Ca^(2+)荧光探针技术检测大鼠海马神经元内质网Ca^(2+)表达;采用免疫组织化学法观察各组大鼠海马组织中caspase-12蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组2、12、48 h海马神经元凋亡细胞数明显增加(Pcaspase-12蛋白表达升高(P12、48 h海马神经元凋亡减轻,凋亡细胞数明显减少(Pcaspase-12蛋白表达降低(Pcaspase-12凋亡级联反应,减少细胞凋亡,从而治疗惊厥性脑损伤。

关键词：针刺惊厥 Ca^(2+) 神经元凋亡 caspase-12 内质网应激

Cellular apoptosis and caspase-12 expression in a rat model of progressive spinal cord compression

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Neural Regeneration Research 2009年第8期4卷 570-576页

作者： Yijian Liang Kejian Wang Shanquan Sun Wei Li Jianhua Ran Guiqiong He Department of Human Anatomy College of Basic Medicine Chongqing Medical University Chongqing 400016 China Department of Orthopaedics Second People's Hospital of Chengdu Chengdu 610017 Sichuan Province China Institute of Neuroscience Chongqing Medical University Chongqing 400016 China

BACKGROUND： Studies have demonstrated that the mechanisms underlying cellular apoptosis signal transduction focus on two pathways： intracellular mitochondria and extracellular death receptor. The current evidence supports that signal transduction of cellular apoptosis also includes endoplasmic reticulum stress signal transduction. OBJECTIVE： To observe caspase-12 expression and cellular apoptosis following ischemia in rats with progressive spinal cord compression, and to verify the influence of endoplasmic reticulum stress on the apoptosis induced by spinal cord injury. DESIGN, TIME AND SETTING： A randomized, controlled, animal trial was performed at the Institute of Neuroscience in Chongqing Medical University between January and October in 2006. MATERIALS： Immunohistochemical kit, diaminobenzidine, and TUNEL kit were purchased from Beijing Zhongshan Biotechnology, China; rabbit anti-rat caspase-12 monoclonal antibody was provided by Santa Cruz, USA. METHODS： Sixty Wistar rats, aged 3-4 months, were randomly assigned to a model group （n = 50）, which underwent spinal cord compression in the L1 segment following L1 laminectomy and articular process excision to establish a model of progressive spinal cord compression, and a sham-surgery group （n = 10）, which underwent only laminectomy. Starting with the first day after surgery, the rats were locally anesthetized, the skin was opened, and the screw was rotated by 1/4 of a cycle, twice weekly. MAIN OUTCOME MEASURES： At 3, 7, 14, 21, and 28 days after surgery, rats from each group were anesthetized, and the spinal cords were resected. Pathological changes following spinal cord compression were determined using hematoxylin-eosin staining, Nissl dye, and transmission electron microscopy. The TUNEL method was used to observe neuronal apoptosis in the compressed spinal cord segments. Immunohistochemistry and Western blot were utilized to detect caspase-12 expression in the compressed segments. RESULTS： Cellular swelling, neu

关键词： progressive spinal cord compression apoptosis caspase-12 rats endoplasmic reticulum stress

姜黄素对肺缺血/再灌注损伤小鼠caspase-12及细胞凋亡的影响

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中国中西医结合杂志 2014年第9期34卷 1118-1124页

作者：周俊辉赵珊陈海娥陈丹郝卯林应磊林丽娜王万铁温州医科大学缺血/再灌注损伤研究所浙江325035 河南省胸科医院麻醉二科郑州450008 温州医科大学附属第一医院麻醉科浙江325035

目的研究姜黄素(curcumin,CUR)对肺缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤小鼠天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-12(cysteinyl aspartate specific proteinase-12,caspase-12)及细胞凋亡的干预作用。方法采用C57BL/6J小鼠制作在体单侧肺原位I/R损伤模型。采用随机数字表法将60只小鼠分为6组,每组10只。假手术组(简称Sham组)、I/R组、I/R加二甲基亚砜(简称I/R加DMSO)组,I/R分别加100、150、200 mg/kg CUR(简称I/R加CUR-100、I/R加CUR-150、I/R加CUR-200)组。实验结束留取左肺,测定肺湿/干重比(W/D)和总肺水含量(TLW),光镜观察肺组织形态学改变,进行肺组织损伤定量评估(IQA),电镜观察肺组织超微结构改变,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测caspase-12和葡萄糖调节蛋白78(GRP78)mRNA及蛋白表达水平,原位末端标记(TUNEL)法检测肺组织细胞凋亡指数(AI)。结果与Sham组比较,I/R组caspase-12和GRP78 mRNA及蛋白表达水平均升高(Pcaspase-12 mRNA及蛋白表达水平均降低(Pcaspase-12引起的细胞凋亡有关。

关键词： caspase-12 肺姜黄素缺血/再灌注细胞凋亡

大鼠脑缺血/再灌注后神经元凋亡及caspase-12 mRNA和蛋白表达的改变

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中国药理学通报 2008年第8期24卷 1069-1072页

作者：张鸿宋利春贾春红刘艳艳吕永利中国医科大学附属盛京医院神经内科辽宁沈阳110004 天津市天和医院天津300050 中国医科大学基础医学院解剖学教研室辽宁沈阳110001

目的研究大鼠局灶性脑缺血/再灌注后caspase-12 mRNA及蛋白的表达,明确内质网信号通路在脑缺血后神经元凋亡调控中的作用。方法60只Wistar♂大鼠随机分为假手术组和缺血组。应用线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血/再灌注模型,应用原位末端... 详细信息

目的研究大鼠局灶性脑缺血/再灌注后caspase-12 mRNA及蛋白的表达,明确内质网信号通路在脑缺血后神经元凋亡调控中的作用。方法60只Wistar♂大鼠随机分为假手术组和缺血组。应用线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血/再灌注模型,应用原位末端标记法(TUNEL)、免疫组化染色、RT-PCR技术检测脑缺血/再灌注后各组凋亡细胞数和caspase-12 mRNA及蛋白的表达。结果脑缺血/再灌注后,随着再灌注时间的延长,凋亡细胞数和caspase-12mRNA及蛋白的表达逐渐增高。在脑缺血/再灌注后24h达高峰。与假手术组相比,缺血组在各时间点凋亡细胞数、caspase-12 mRNA及蛋白表达均明显升高(Pcaspase-12 mRNA及蛋白的表达明显升高,提示内质网通路参与了脑缺血/再灌注后神经元凋亡的调控。

关键词：脑缺血凋亡 caspase-12 内质网

caspase-12介导的内质网通路凋亡相关蛋白在大鼠肾发育中的表达

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解剖学杂志 2017年第1期40卷 1-3,F0004页

作者：牛微微宋小峰锦州医科大学组织学与胚胎学教研室锦州121001

目的:探讨caspase-12介导的内质网通路凋亡相关蛋白在大鼠肾发育中的表达规律。方法:应用免疫组织化学显色与免疫印迹法,对大鼠肾发育中内质网通路凋亡相关蛋白caspase-12和cleaved-caspase-3的表达进行定性和定量观察。结果:免疫组织... 详细信息

目的:探讨caspase-12介导的内质网通路凋亡相关蛋白在大鼠肾发育中的表达规律。方法:应用免疫组织化学显色与免疫印迹法,对大鼠肾发育中内质网通路凋亡相关蛋白caspase-12和cleaved-caspase-3的表达进行定性和定量观察。结果:免疫组织化学显示在大鼠肾发育中,caspase-12和cleaved-caspase-3的阳性表达由肾皮质区深层逐渐扩展到整个肾皮质区,其表达主要位于近端小管,而远端小管表达较微弱;免疫印迹结果显示在肾发育中,caspase-12被分解为cleavedcaspase-12,caspase-12和cleaved-caspase-12的蛋白表达在胚胎期较高,在生后(P)1 d达到高峰,随后其表达逐渐降低。而cleaved-caspase-3的蛋白表达在胚胎肾发育中较弱,在P1d其表达水平突然升高,随后维持在较高的水平。结论:caspase-12介导的内质网通路凋亡相关蛋白可能参与大鼠胚胎肾发育中近端小管的细胞凋亡。

关键词：内质网 caspase-12 凋亡肾大鼠

右美托咪定对缺氧/复氧诱导的A549细胞凋亡及caspase-12表达的影响

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生理学报 2017年第4期69卷 437-444页

作者：罗梓垠项冰倩高慧邱晓晓郝卯林王万铁温州医科大学缺血-再灌注损伤研究所温州325035 湖北省中西医结合医院病理科武汉430015

本研究旨在探讨右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)对缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)诱导的A549细胞凋亡以及caspase-12表达的影响。取对数生长期的A549细胞,随机分为对照组、DEX组、H/R组和DEX+H/R组。对照组和DEX组细胞常氧培养30 h,H/R组和DEX+H/R组细胞缺氧6 h、复氧24 h建立H/R模型,其中DEX组和DEX+H/R组给予1 nmol/L DEX干预。造模结束后用倒置显微镜观察细胞形态学的变化;原位末端标记(TUNEL)法检测A549细胞的凋亡指数(apoptotic index,AI);CCK-8法检测A549细胞活力;caspase-3活性检测试剂盒检测各组caspase-3酶的活性;Western blot和RT-PCR分别检测A549细胞GRP78、caspase-12蛋白和mRNA的表达水平。结果显示,与对照组相比较,H/R组细胞发生融合现象,形态呈多边型改变,细胞活力明显降低(Pcaspase-3酶活性上升(Pcaspase-12蛋白和m RNA表达显著上升(Pcaspase-3酶活性显著下降(Pcaspase-12蛋白和mRNA表达下降(Pcaspase-12的表达、抑制细胞凋亡有关。

关键词：右美托咪定肺缺氧/复氧损伤 A549细胞细胞凋亡 caspase-12

caspase-12短发夹状RNA在内质网应激性凋亡中的作用

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中华实验外科杂志 2005年第12期22卷 1568-1570页

作者：刘芳邹萍陈敏张敏吴耀辉肖娟华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所武汉430022 华中科技大学同济医学院附属协和医院泌尿外科武汉430022

目的构建凋亡因子caspase-12的短发夹状RNA(siRNA),观察其在体外对鼠粒单系白血病细胞WEHI-3细胞对凋亡的抵抗作用。方法设计并合成一对针对caspase-12编码基因的siRNA,构建表达此siRNA的重组质粒psiRNA-caspase-12,转染入WEHI-3细胞。... 详细信息

目的构建凋亡因子caspase-12的短发夹状RNA(siRNA),观察其在体外对鼠粒单系白血病细胞WEHI-3细胞对凋亡的抵抗作用。方法设计并合成一对针对caspase-12编码基因的siRNA,构建表达此siRNA的重组质粒psiRNA-caspase-12,转染入WEHI-3细胞。检测胞内Cas- pase-12的mRNA和蛋白的表达。并检测转染后WEHI-3细胞的抗凋亡能力。结果酶切分析和测序证实构建成功,siRNA对caspase-12的表达均有明显的抑制作用。染后WEHI-3细胞的抗凋亡能力增加。结论构建的重组质粒能有效抑制caspase-12基因在白血病细胞株WEHI-3中的表达。并对内质网应激性凋亡具有抵抗能力。

关键词： RNA干扰 caspase-12 益康唑内质网应激性凋亡白血病

抗caspase-12核酶的制备与体外活性鉴定

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中华肝脏病杂志 2005年第2期13卷 121-124页

作者：姜山谢青张韡周霞秋俞红金由辛上海第二医科大学附属瑞金医院感染科 200025 中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所

目的设计针对小鼠内质网应激凋亡途径中caspase-12 mRNA的锤头状核酶(Rz138、Rz218),通过靶基因及核酶的体外转录、切割,进行核酶活性鉴定,评估其应用前景。方法小鼠caspase-12基因的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增片段克隆于PGEM-... 详细信息

目的设计针对小鼠内质网应激凋亡途径中caspase-12 mRNA的锤头状核酶(Rz138、Rz218),通过靶基因及核酶的体外转录、切割,进行核酶活性鉴定,评估其应用前景。方法小鼠caspase-12基因的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增片段克隆于PGEM-T载体的T7启动子下游,通过α-32P UTP标记的体外转录物作为靶RNA。设计合成针对小鼠caspase-12 mRNA的核酶,通过PCR方法扩增核酶的转录模板,采用非同位素标记法行体外转录,核酶与靶RNA进行体外切割实验。结果在37℃,Rz138、Rz218均有切割活性,Rz138的切割效率较高,几乎100％。结论 Rz138在体外具有良好的特异催化切割活性,它有望通过切割caspase-12 mRNA而抑制内质网应激介导的细胞凋亡发生。

关键词： caspase-12 核酶 RNA 小鼠抗C 体外活性内质网应激 T7启动子体外转录克隆