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人睾丸酵母双杂交cdna文库的构建与鉴定

中华男科学杂志 2012年第4期18卷 310-313页

作者：郑英张露萍贾筱琴王海燕扬州大学医学院组织学与胚胎学教研室江苏扬州225001 扬州大学医学院病理学教研室江苏扬州225001

目的:构建应用于酵母双杂交系统的人睾丸组织cdna文库。方法:从正常人睾丸组织总RNA中纯化出mRNA,以SMARTШTM和CDSШ为引物,合成两端具有同源臂的双链cdna,后者与线性质粒pGADT7-Rec共转化入感受态酵母细胞Y187,两者在酵母细胞中同源... 详细信息

目的:构建应用于酵母双杂交系统的人睾丸组织cdna文库。方法:从正常人睾丸组织总RNA中纯化出mRNA,以SMARTШTM和CDSШ为引物,合成两端具有同源臂的双链cdna,后者与线性质粒pGADT7-Rec共转化入感受态酵母细胞Y187,两者在酵母细胞中同源重组成环形的cdna文库质粒,收集在营养缺陷培养板上筛选出的所有克隆,即为人睾丸酵母双杂交cdna文库。结果:构建了具有基因多样性和库容量足够大的人睾丸cdna文库,共获得2×106个转化子,插入的双链cdna片段的长度在0.3～4.0 kb之间。结论:利用ClontechSMART技术,成功构建了应用于酵母双杂交的人睾丸组织cdna文库,为探讨人精子发生的分子机制奠定了基础。

关键词：酵母双杂交 cdna文库人睾丸

球毛壳菌(Chaetomium globosum)cdna文库的构建

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哈尔滨工业大学学报 2005年第2期37卷 262-263页

作者：金红星杨谦宋金柱哈尔滨工业大学生命科学与工程系黑龙江哈尔滨150001

以质粒pBluesciptIIsk( +)为载体,以E. coliDH5α为受体菌,通过加接头定向克隆的方法构建了球毛壳菌的cdna文库. 该文库的滴度为 2. 25×l04pfu/ml, 重组率为 96. 4%.

关键词：球毛壳菌 cdna文库生物防治菌

cdna文库的差异筛选与抑制性减数杂交相结合分离胡萝卜体细胞胚根发育相关基因

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自然科学进展 2002年第3期12卷 261-265页

作者：张雷杨志攀刘一鸣黄美娟吴乃虎中国科学院发育生物学研究所北京100080 北京大学生命科学学院北京100871

应用cdna文库差异筛选与抑制性减数杂交相结合的技术程序,并通过反向Northern分析进一步验证,成功地从解调控12 h的胡萝卜体细胞胚的cdna文库中,分离到7个在解调控12h特异表达的基因.其中4个含有完整的编码框,分别编码木质葡聚糖内转糖... 详细信息

应用cdna文库差异筛选与抑制性减数杂交相结合的技术程序,并通过反向Northern分析进一步验证,成功地从解调控12 h的胡萝卜体细胞胚的cdna文库中,分离到7个在解调控12h特异表达的基因.其中4个含有完整的编码框,分别编码木质葡聚糖内转糖基化酶、脂肪酸去饱和酶、一种poly(A)结合蛋白和一种酰基转移酶.另外3个是5＇端部分缺失的cdna基因片段,分别编码三磷酸甘油醛脱氢酶、一种糖蛋白和一种与单链RNA/DNA结合的蛋白.对其中部分基因的Northern分析结果显示,它们的表达量在蔗糖调控下的胡萝卜体细胞胚根发育的不同时期均有显著变化,说明它们都是与胚根发育相关的基因.

关键词： cdna文库胚根发育胡萝卜体细胞胚差异筛选抑制性减数杂交基因克隆基因分离基因表达

利用同源重组构建人肺鳞状细胞癌旁组织的酵母双杂交cdna文库

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中国组织工程研究与临床康复 2008年第28期12卷 5490-5493页

作者：彭媛媛邓璐霞石艳娥赵媛陈军利王薇冯云吴琦王伯瑶黄宁四川大学华西基础医学与法医学院病理生理学感染免疫教研室四川省成都市610041

背景:酵母双杂交技术是目前应用最成功的研究蛋白质相互作用的技术平台。目的:运用SMART(switching mechanism at5′end of RNA transc-ript)技术构建人肺鳞状细胞癌旁组织的酵母双杂交cdna文库。设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-... 详细信息

背景:酵母双杂交技术是目前应用最成功的研究蛋白质相互作用的技术平台。目的:运用SMART(switching mechanism at5′end of RNA transc-ript)技术构建人肺鳞状细胞癌旁组织的酵母双杂交cdna文库。设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-07/2007-01在四川大学华西基础医学与法医学院病理生理学感染免疫实验室完成。材料:人肺鳞状细胞癌旁组织由四川大学华西医学中心附属第一医院胸外科提供。方法:运用SMART技术,以纯化的Poly(A)+RNA为模板,用Powerscript逆转录酶进行转录,并在mRNA的5’末端添加一段5’-oligo作为延伸后的模板,从而富集全长cdna。纯化的双链cdna与线性化pGADT7-Rec质粒载体共同转化酵母菌株感受态AH109,经胞内同源重组形成环状文库质粒。应用营养缺陷的方法在SD/-Leu平板上筛选并收集所有克隆从而获得酵母双杂交的人肺鳞状细胞癌旁组织cdna文库。主要观察指标:采用琼脂糖凝胶电泳观察人肺鳞状细胞癌旁组织的cdna文库构建结果,并进行文库容量及多态性鉴定。结果:①总RNA和mRNA纯度较好,比较完整。②双链cdna文库大小介于0.5～3kb之间。③共获得1.2×106转化子,重组子不同插入片断大小在0.3～2kb之间,文库具有较好的多样性。结论:在酵母菌株AH109成功构建了用于酵母双杂交的人肺鳞状细胞癌旁组织cdna文库。

关键词： SMART技术 cdna文库同源重组酵母双杂交

常氏肝癌细胞cdna文库的构建及ADAMs相关基因的免疫筛选与序列分析

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遗传 2004年第6期26卷 793-796页

作者：林俊堂李玉昌张会勇徐存拴新乡医学院细胞生物学教研室新乡453003 河南师范大学生命科学学院新乡453002

抽提常氏肝癌细胞的总RNA ,以oligo(dT)为引物 ,通过两次转换模板 ,采用LD PCR合成全长cdna ,在cdna两端引入SfiⅠ的酶切位点。以λTriplEX2为载体经过包装后构建了常氏肝癌细胞cdna表达文库。以ADAMs通用抗体 ,用免疫筛选技术从常氏肝... 详细信息

抽提常氏肝癌细胞的总RNA ,以oligo(dT)为引物 ,通过两次转换模板 ,采用LD PCR合成全长cdna ,在cdna两端引入SfiⅠ的酶切位点。以λTriplEX2为载体经过包装后构建了常氏肝癌细胞cdna表达文库。以ADAMs通用抗体 ,用免疫筛选技术从常氏肝癌cdna文库中筛选出 2 2个阳性克隆 ,经测序分析和BLAST检索 ,证实其中一个为新基因 ,部分区域具有蛋白酶的功能 ,对该基因进行了GenBank登录 ,获注册号为AY0 780 70。

关键词：常氏肝癌细胞 cdna文库 ADAMs抗体免疫筛选基因克隆同源检索

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骨肉瘤cdna文库的构建和筛选

南方医科大学学报 2007年第12期27卷 1912-1914,1917页

作者：邓少林权毅潘显明屈波成都军区总医院骨科四川成都610083

目的研究骨形态发生蛋白-2(BMP-2)在骨肉瘤发生、发展中的作用,构建SAOS-2细胞cdna文库,寻找与BMP-2相关作用蛋白。方法从骨肉瘤细胞系SAOS-2中提取总RNA,进而分离poly(A)+RNA,用poly(A)+RNA进行反转录并以SMARTIIITM和CDSIIIoligo(dT)为引物进行PCR扩增,得到两端具有同源臂的PCR片段,以此同源臂为基础在酵母中实现同源重组。通过文库片段,线形化的pGADT7-Rec和诱饵质粒pGBKT7/HA-BMP-2共转化酵母AH109菌株在文库构建的同时进行与BMP-2相互作用蛋白的筛选;或先将文库片段,线形化的pGADT7-Rec转化AH109,再利用AH109和Y187两种酵母菌株的接合生殖进行筛选。最后用Far-Western blotting法进一步从体外论证BMP-2相互作用蛋白。结果构建了具有基因多样性和库容量足够大的骨肉瘤cdna文库,双链cdna片段的长度大小范围为250～5000bp。共转化的效率为4.3×105,重组效率为1.9×106,筛选的克隆数为4.3×105。接合法筛选时的接合效率为32%,筛选的克隆数为1.0×106。筛选到四个与BMP-2相互作用的阳性克隆。结论此文库的多样性和库容量均符合筛选需求。可用于骨肉瘤相关基因的进一步筛选。

关键词：骨肉瘤 SAOS-2细胞 cdna文库酵母双杂交

菌根真菌诱导的铁皮石斛根差减cdna文库构建

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中国药学杂志 2012年第22期47卷 1790-1796页

作者：李标唐坤张岗郭顺星中国医学科学院-北京协和医学院药用植物研究所北京100193

目的构建菌根真菌共生诱导的铁皮石斛根的差减cdna文库,从中筛选出差异表达基因。方法采用SMARTer PCRcdna合成方法直接以总RNA为模板合成并富集稀少cdna,再利用抑制消减杂交(SSH)方法构建受菌根真菌共生诱导铁皮石斛根的差减cdna文库... 详细信息

目的构建菌根真菌共生诱导的铁皮石斛根的差减cdna文库,从中筛选出差异表达基因。方法采用SMARTer PCRcdna合成方法直接以总RNA为模板合成并富集稀少cdna,再利用抑制消减杂交(SSH)方法构建受菌根真菌共生诱导铁皮石斛根的差减cdna文库。结果成功构建了受菌根真菌诱导铁皮石斛根的差减cdna文库,共获得1 975个阳性克隆。经检测,90%以上克隆能扩增出有效产物,其插入片段大小在150～1 000 bp之间。随机挑取了20个克隆菌液测序并进行了比对分析,大部分为植物应对环境胁迫防御性基因。结论该技术体系所构建的差减cdna文库质量较好,操作方便,尤其适用于珍稀濒危的植物材料。

关键词：铁皮石斛菌根真菌抑制消减杂交 cdna文库共生