检索结果-南通市图书馆

作者：叶彩媚上海海洋大学

学位级别：硕士

传染性脾肾坏死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV）和鳜弹状病毒（Siniperca chuatsi rhabdovirus,ScRV）是鳜鱼（Siniperca chuatsi）的主要病毒性病原,其感染引起的疾病给鳜养殖业带来了重大的经济损失,是制约鳜养殖业发展的关键因素。病毒作为非细胞结构生物,其复制增殖完全依赖细胞代谢。谷氨酰胺代谢是病毒调控细胞代谢的一个重要靶标,其提供的能量和中间代谢物可利于病毒增殖。前期研究发现,ISKNV、ScRV感染能诱发细胞谷氨酰胺代谢重编程,但是ISKNV和ScRV是如何调控谷氨酰胺代谢重编程的机制尚不清楚。c-Myc是调控细胞代谢的关键转录因子,c-Myc能够调控谷氨酰胺酵解途径的限速酶谷氨酰胺酶1（Glutaminase1,GLS1）的表达从而调控谷氨酰胺代谢。那么ISKNV和ScRV是否能通过调控鳜c-Myc（Sc-c-Myc）进而调控谷氨酰胺代谢呢?因此,本研究对Sc-c-Myc在ISKNV和ScRV感染中的作用及ISKNV、ScRV如何调控Sc-c-Myc进而调控谷氨酰胺代谢的分子机制进行了深入的研究。主要结果如下:（1）鳜c-Myc基因的克隆、表达分析及多克隆抗体的制备通过PcR获得了Sc-c-Myc ORF,全长1113bp,编码370个氨基酸,其中293-368 aa是其保守区,属于螺旋环螺旋（b-HLH）DNA结合蛋白的超家族,其包含多个DNA和多肽结合位点;预测Sc-c-Myc的三级结构和人c-Myc的三级结构,发现他们的结构非常相似;比较不同物种的c-Myc,结果显示Sc-cmyc在进化上具有一定的保守性。通过实时荧光定量（qRT-PcR）法检测Sc-cmyc mRNA的组织表达,结果显示,Sc-c-Myc mRNA在健康鳜鱼的10种组织中均有表达,且呈组成型表达,其中后肾组织中的表达量最高。制备了Sc-cmyc多克隆抗体,结果显示此抗体能特异性识别鳜脑细胞（chinese perch brain cell,cPB）中的Sc-c-Myc蛋白,可用于下一步实验。（2）Sc-c-Myc对ISKNV、ScRV感染的应答及复制增殖的影响ISKNV和ScRV感染鳜鱼和cPB细胞后,采用定量PcR及western blotting检测Sc-c-Myc的mRNA和蛋白表达。结果显示,ISKNV、ScRV感染后,鳜鱼脾脏和cPB细胞中的Sc-c-Myc转录水平显著提高,cPB细胞中Sc-c-Myc蛋白表达量也显著升高,表明Sc-c-Myc在ISKNV和ScRV感染中起重要作用。随后构建了Sc-c-Myc过表达载体,转染至cPB细胞,经过筛选鉴定获得了过表达Sc-c-Myc稳转细胞系,另外设计了siRNA敲降cPB细胞中Sc-c-Myc的表达,检测这两种细胞中谷氨酰胺代谢相关酶（GLS1,GDH,IDH2）的表达、对谷氨酰胺摄取以及ISKNV、ScRV增殖情况。结果显示,过表达Sc-c-Myc后,与对照组相比,GLS1、GDH和IDH2的转录及蛋白表达显著上调,细胞对谷氨酰胺的摄取显著增加,ISKNV、ScRV的病毒产量也显著升高,表明过表达Sc-c-Myc可促进谷氨酰代谢途径关键酶GLS1、GDH和IDH2的表达,提高细胞对谷氨酰胺的摄取,促进ISKNV和ScRV的复制增值;敲降Sc-c-Myc后,与对照组相比,GLS1、GDH和IDH2的转录及蛋白表达均显著下调,细胞对谷氨酰胺的摄取也显著减少,ISKNV、ScRV的病毒产量也显著降低,表明敲降Sc-c-Myc可抑制细胞GLS1、GDH和IDH2的表达和细胞对谷氨酰胺的摄取,抑制ISKNV和ScRV的复制增殖。以上结果表明ISKNV和ScRV是通过上调Sc-c-Myc表达增强谷氨酰胺代谢以供自身复制增殖。（3）ISKNV和ScRV调控Sc-c-Myc的机制研究通过免疫共沉淀（co-IP）和蛋白质质谱技术,分析寻找ISKNV、ScRV可能调控并与Sc-c-Myc相互作用的病毒蛋白。co-IP结果显示ScRV的核衣壳蛋白（N蛋白）与Sc-c-Myc存在相互作用;质谱分析结果筛选出可能与Sc-c-Myc互作的ISKNV病毒蛋白3个,分别为ORF118L、ORF102R和ORF093R。分别构建ISKNV的这3个病毒蛋白带Flag标签过表达载体并转染到cPB细胞,通过细胞荧光共定位实验发现,这3个病毒蛋白在cPB细胞内分别与Sc-c-Myc存在一定程度的胞内共定位现象。随后通过蛋白互作实验发现ISKNV病毒蛋白ORF102R和ORF093R与Sc-c-Myc存在相互作用,并且通过qRT-PcR和Western blotting检测发现转染ISKNV ORF093R的cPB细胞中,Sc-c-Myc、GLS1和IDH2的转录水平和蛋白表达水平都显著上调,而转染ISKNV O

关键词：鳜鱼 ISKNV ScRV c-Myc 谷氨酰胺代谢

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c-Myc在肺纤维化发病中的作用及机制研究

c-Myc在肺纤维化发病中的作用及机制研究

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作者：彭晓敏广州医科大学

学位级别：硕士

研究背景:特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种慢性、进行性和纤维化性肺疾病。疾病进展过程健康的肺组织被细胞外基质(Extracellular matrix,EcM)取代,肺泡结构破坏,从而导致肺顺应性降低,气体交换受阻,最终呼吸... 详细信息

研究背景:特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种慢性、进行性和纤维化性肺疾病。疾病进展过程健康的肺组织被细胞外基质(Extracellular matrix,EcM)取代,肺泡结构破坏,从而导致肺顺应性降低,气体交换受阻,最终呼吸衰竭走向死亡。IPF病因及发病机制不明,诊断后的中位生存时间是2-4年,治疗手段少,肺移植是唯一能够有效延长生存期的治疗方法。因此,深入探讨肺纤维化的病理机制,寻找更加有效的精准治疗靶点势在必行。原癌基因c-Myc是一个重要的转录因子,调控约15%的人类基因的表达,在各种生物过程中起着至关重要的作用,比如细胞增殖,生长,凋亡,新陈代谢,粘附、蛋白质合成、DNA复制和血管生成等。近年来,许多细胞实验表明c-Myc还可调节细胞衰老过程,并且肾纤维化和肝纤维化动物模型也发现c-Myc的升高与纤维化密切相关。我们前期试验发现肺纤维化小鼠模型和IPF患者肺组织中c-Myc高表达,因此推测c-Myc可能参与肺纤维过程,但其在肺纤维化的发生发展中的作用机制仍需进一步研究。目的:探究c-Myc与特发性肺纤维化疾病之间的关系,探究其是否能成为特发性肺纤维化的诊断靶点与治疗靶点。方法:第一部分:在鼠的肺纤维化模型与人的临床样本中检测c-Myc的表达差异通过QPcR、western blot检测肺纤维化小鼠与正常小鼠、IPF患者与正常人肺组织中c-Myc的差异;通过单细胞测序检测IPF患者与正常人之间的c-Myc阳性细胞分类;提取、培养人肺原代成纤维细胞并通过QPcR、western blot比较IPF患者与正常人的原代成纤维细胞c-Myc差异,观察TGF-β1刺激IPF患者原代成纤维细胞的变化。第二部分:在IPF原代成纤维细胞中分别过表达c-Myc与干扰c-Myc,探究其对肺纤维化发生的作用机制慢病毒感染IPF患者原代成纤维细胞过表达或干扰c-Myc,在或不在TGF-β1刺激下,观察其衰老指标、增殖指标、纤维化指标及迁移能力变化;通过QPcR、western blot检测纤维化指标(fibronectin、collagenⅠ、α-SMA)、衰老指标(p53、p21、p16);细胞免疫荧光(collagenⅠ)检测成纤维细胞是否转化为肌成纤维母细胞;β-半乳糖苷酶染色检测衰老细胞数量,ki67、PcNA与EDU增殖细胞实验检测细胞增殖能力;划痕实验与transwell实验检测细胞迁移能力;且通过对干扰组细胞RNA测序的GO功能富集分析与KEGG通路富集分析探究c-Myc干扰后IPF患者原代成纤维细胞的基因变化。结果:第一部分:1.肺纤维化小鼠模型肺组织较正常小鼠、IPF患者肺组织较正常人c-Myc的表达量都较高。2.通过文献的单细胞数据库统计及实验室收集的3例正常人与3例IPF患者的肺组织单细胞测序结果发现:myc阳性细胞主要集中于IPF疾病患者的成纤维细胞群。3.在IPF患者肺原代成纤维细胞中检测到c-Myc的表达量较正常人的高,且TGF-β1刺激后纤维化指标和c-Myc都升高,升高程度与刺激浓度正相关。第二部分:1.IPF患者原代成纤维细胞过表达c-Myc后,细胞表现增殖加快、分泌细胞外基质能力增强、迁移能力增强,并表现加速衰老的特征,推测c-Myc诱导IPF患者原代成纤维细胞转化为衰老相关分泌表型,从而促进纤维化。2.IPF患者原代成纤维细胞干扰c-Myc后,TGF-β1刺激下,细胞的增殖、分泌细胞外基质能力、迁移能力无变化甚至减弱,阻断了TGF-β-smad2/3通路。RNA测序结果也显示其细胞外基质生成、转化生长因子结合、细胞衰老、EcM-受体相互作用等方面基因功能也下降。结论:c-Myc通过诱导IPF患者原代成纤维细胞分化为衰老相关分泌表型(SASP),从而加重其纤维化表现。而干扰c-Myc后,阻断下游的smad2/3通路,细胞无法响应TGF-β1刺激,无法产生促纤维化的效应,从而潜在的阻止纤维化。因此我们认为c-Myc有望成为特发性肺纤维化的诊断靶点与治疗靶点。

关键词：特发性肺纤维化 c-Myc 原代成纤维细胞衰老相关分泌表型转化生长因子β-1

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c-Myc通过LNc cROPR1或LNc cROPR2调控口腔鳞状细胞癌进展的研究

c-Myc通过LNC CROPR1或LNC CROPR2调控口腔鳞状细胞癌进展的研究

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作者：秦晓峰安徽医科大学

学位级别：硕士

目的:口腔鳞状细胞癌(OScc)是最常见的头颈部鳞癌之一,具有高复发、高转移和预后差等特点,患者5年生存率不到50%。c-Myc是最常见的原癌基因,可以调节非编码基因从而影响不同癌症的发生发展。长链非编码RNAs(lnc RNAs),虽然缺乏蛋白质编... 详细信息

目的:口腔鳞状细胞癌(OScc)是最常见的头颈部鳞癌之一,具有高复发、高转移和预后差等特点,患者5年生存率不到50%。c-Myc是最常见的原癌基因,可以调节非编码基因从而影响不同癌症的发生发展。长链非编码RNAs(lnc RNAs),虽然缺乏蛋白质编码潜力,但依然可以在基因表达和肿瘤进展方面发挥重要影响。前期,我们课题组通过P493-6细胞基因芯片筛选出了与c-Myc相关的多个lnc RNAs,因此本实验进一步对c-Myc调控的LNc cROPR1(c-Myc regulates OScc progression related lnc RNA1)和LNc cROPR2(c-Myc regulates OScc progression related lnc RNA2)影响OScc的进展进行研究。方法:采用q RT-PcR检测c-Myc过表达和敲低对LNc cROPR1或LNc cROPR2的影响,c-Myc与LNc cROPR1或LNc cROPR2在OScc组织和癌旁组织中的表达关系。采用双荧光素酶报告实验来验证c-Myc与LNc cROPR1或LNc cROPR2基因启动子区域的结合。采用核质分离实验和RNA FISH来确定LNc cROPR1或LNc cROPR2在OScc细胞系中的定位情况。通过q RT-PcR、Western blots、划痕实验、培养基颜色和酸度变化、细胞计数、克隆形成实验来观察LNc cROPR1或LNc cROPR2的过表达、敲低对OScc细胞迁移、代谢和增殖方面的影响。通过rescue实验来验证LNc cROPR1或LNc cROPR2的rescue是否可以逆转其各自的敲低作用。用不同浓度的辛伐他汀处理OScc细胞,通过观察c-Myc与LNc cROPR1或LNc cROPR2的变化情况来判断辛伐他汀在OScc中的抑癌作用。通过生物素RNA pull-down实验和质谱检测来寻找与LNc cROPR1或LNc cROPR2存在相互作用的蛋白。用RNA结合蛋白免疫沉淀实验来反向验证质谱检测得出的PcBP2蛋白与LNc cROPR1相互作用。q RT-PcR检测过表达和敲低LNc cROPR1后PcBP2的变化情况。结果:在OScc细胞系和OScc组织中c-Myc正向调控LNc cROPR1和LNc cROPR2的表达。双荧光素酶报告实验验证了c-Myc与LNc cROPR1或LNc cROPR2基因启动子区域存在相互作用。核质分离实验和RNA FISH都表明LNc cROPR1和LNc cROPR2主要是细胞核定位。LNc cROPR1或LNc cROPR2的过表达促进OScc细胞系的迁移、代谢和增殖。LNc cROPR1或LNc cROPR2的敲低抑制OScc细胞系的迁移、代谢和增殖。Rescue实验表明LNc cROPR1或LNc cROPR2的rescue可以逆转其各自的敲低作用。辛伐他汀处理OScc细胞可明显看到它对c-Myc与LNc cROPR1或LNc cROPR2的抑制作用。通过生物素RNA pull-down实验和质谱检测找到了多个与LNc cROPR1或LNc cROPR2相互作用的蛋白。PcBP2的RNA结合蛋白免疫沉淀实验反向验证了PcBP2与LNc cROPR1的相互作用。过表达和敲低LNc cROPR1后发现PcBP2的表达与LNc cROPR1呈正相关关系。结论:在OScc细胞系中c-Myc转录调控LNc cROPR1或LNc cROPR2的表达,在癌组织中其表达正相关;并且c-Myc通过LNc cROPR1或LNc cROPR2影响OScc的迁移、代谢和增殖。辛伐他汀可抑制OScc细胞中c-Myc与LNc cROPR1或LNc cROPR2的表达。LNc cROPR1和PcBP2相互作用,并维持PcBP2蛋白表达水平,c-Myc可能通过LNc cROPR1/PcBP2轴来影响OScc的进展。

关键词：口腔鳞状细胞癌 c-Myc LNc cROPR1 LNc cROPR2

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KDM4B通过调控c-Myc的稳定性影响胶质母细胞瘤的生长和增殖

KDM4B通过调控c-MYC的稳定性影响胶质母细胞瘤的生长和增殖

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作者：王忠泽西南大学

学位级别：硕士

胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)属于四级胶质瘤,被认为是最恶性和最具侵袭性的人类脑肿瘤,也是成年人最常见的脑肿瘤。胶质母细胞瘤患者的预后极差,一般确诊后的中位生存期仅为14个月。在世界范围内,GBM每年造成约20万多人死亡,男性的... 详细信息

胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)属于四级胶质瘤,被认为是最恶性和最具侵袭性的人类脑肿瘤,也是成年人最常见的脑肿瘤。胶质母细胞瘤患者的预后极差,一般确诊后的中位生存期仅为14个月。在世界范围内,GBM每年造成约20万多人死亡,男性的发病率高于女性。目前最有效的治疗方法是外科手术、放疗以及化疗等医学手段。但是由于该实体瘤位于脑部,因此外科手术不仅难度极大同时医疗费用也是极高。同时,血脑屏障的存在也使得能治疗GBM的有效化疗药物相对较少。因此迫切需要筛选鉴定出有效的生物标记物,阐明胶质母细胞瘤的发病机理,探索出胶质母细胞瘤合适的治疗靶标。组蛋白去甲基化酶KDM4家族一般定位于核内,能通过Jmj c结构域将组蛋白尾部赖氨酸残基中的甲基基团去除,从而调节基因的转录活性。目前,在人类基因组上已鉴定出6种KDM4家族的蛋白质,包括KDM4A,KDM4B,KDM4c,KDM4D,KDM4E,KDM4F。其中KDM4A-c含有Jmj N、Jmj c、两个PHD结构域和两个TUDOR结构域,而KDM4D-F仅含有Jmj N和Jmj c两个功能性结构域。Jmj c结构域是行使组蛋白去甲基化功能的主要区域,基本蛋白质结构是一个β片“果冻卷”,其中心活性位点中配位有二价铁离子(Fe2+)活性中心位点。它将α-酮戊二酸和O2作为底物辅助因子,在组蛋白末端赖氨酸上通过羟基化反应去除三甲基化或二甲基化状态。各种研究表明,KDM4A、KDM4B和KDM4c在乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、前列腺癌和其他肿瘤中过表达,是癌细胞高效生长所必需的,这可能是由于它们能够开启染色质的能力相关。KDM4B主要去甲基化H3K9me3/me2,开放染色质,促进分化,性激素和DNA损伤修复等基因的转录表达。近年来,KDM4B被发现在乳腺癌,前列腺癌,胃癌和神经母细胞瘤等肿瘤中高表达,且发挥了关键性的调控作用。KDM4B作为组蛋白去甲基化酶,不仅仅参与癌基因的转录,还与癌蛋白质共同作用,开启下游基因的表达。例如在乳腺癌中,KDM4B不仅转录调控雌激素受体(ER),还与ER相互结合,协助转录下游myc,MYB和ccND1等基因,促进癌细胞的增殖。研究发现,前列腺癌的去势抵抗性也与KDM4B相关。多篇报道指出KDM4B参与DNA修复,已经成为放射疗法的阻碍。在脑胶质母细胞瘤中,KDM4B的功能和机制尚未有过报道,然而我们通过大数据分析发现它与多个临床不良预后呈正相关。因此探究KDM4B在胶质母细胞瘤中的重要意义和功能,为设计GBM的基因靶向治疗药物提供重要的理论基础。转录因子c-Myc可与人类基因组中15%的启动子结合,主要起促进增殖的作用。在正常细胞中,c-Myc的表达和活性受到严格控制。在大多数人类肿瘤类型中,c-Myc与多种致癌途径相关,其异常高表达往往与不良预后相关。在本研究中,我们发现在胶质母细胞瘤中KDM4B不仅能稳定c-Myc表达还能参与c-Myc信号通路。主要实验结果如下:1.KDM4B的表达与胶质母细胞瘤患者的预后关系为了确定KDM4B在胶质母细胞瘤中的扮演的角色,我们通过癌症基因组图谱(TcGA)发现KDM4B在胶质母细胞瘤组织中的表达较高,并随着胶质瘤级别的升高而升高。并且,KDM4B的基因表达水平与多个胶质母细胞瘤临床不良预后正相关。当KDM4B在胶质母细胞瘤中高表达时,患者的生存率也降低。综上所述,我们推测KDM4B在胶质母细胞瘤中高表达并且与患者的不良预后可能相关,因此我们选定KDM4B表达量较高的U87-MG和LN229进行相关的实验探究。2.KDM4B调控胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁移侵袭以及肿瘤生成为了探索KDM4B在胶质母细胞瘤增殖方面的影响,我们通过慢病毒介导的RNAi技术在U87-MG和LN229细胞中RNA干扰KDM4B的表达,通过MTT和平板克隆形成实验检测到细胞增殖明显减慢。通过流式细胞仪检测了在RNA干扰KDM4B后细胞的周期进程,发现RNA干扰KDM4B后细胞阻滞在G2/M期。并在RNA干扰后检测了相关周期蛋白质的表达情况,结果发现c-Myc下游通路中的G2/M期相关蛋白质cyclin B1和cDK1显著下调。我们通过皮下成瘤实验和软琼脂克隆形成分析实验发现RNA干扰KDM4B后显著抑制了胶质母细胞瘤细胞的体内外成瘤能力。之后我们通过细胞迁移能力或侵袭能力分析实验和划痕愈合实验发现RNA干扰KDM4B后抑制了胶质母细胞瘤的迁移侵袭,免疫印迹实验显示Snail、Slug和MMP2表达下调,E-cadherin的表达上调。3.KDM4B对c-Myc信号通路的调控c-Myc是经典的癌基因,在多种癌症中主要通过调控细胞周期和细胞增殖促进癌症进程,并且高表达的c-Myc往往表示着较差的预后。在我们的研究中,KDM4B被发现与c-Myc以及c-Myc信号通路呈正相关。之后通过泛素化实验以及添加蛋白质酶体抑制剂MG132和蛋白质合成抑

关键词： KDM4B 胶质母细胞瘤 FBXL3 cRY2 c-Myc

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鲤疱疹病毒Ⅱ型立即早期蛋白ORF121与鲫c-Myc转录调控因子互作调控病毒感染复制机制的研究

鲤疱疹病毒Ⅱ型立即早期蛋白ORF121与鲫C-Myc转录调控因子互作调...

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作者：闻金萱上海海洋大学

学位级别：硕士

鲤疱疹病毒Ⅱ型(cyprinid Herpesvirus 2,cyHV-2)是双链DNA病毒,主要感染鲫和金鱼引起病毒性造血器官坏死病(Herpes Viral Haematopoietic Necrosis,HVHN),给鲫养殖产业造成了严重的经济损失。DNA病毒基因可根据其表达的时序划分为立即... 详细信息

鲤疱疹病毒Ⅱ型(cyprinid Herpesvirus 2,cyHV-2)是双链DNA病毒,主要感染鲫和金鱼引起病毒性造血器官坏死病(Herpes Viral Haematopoietic Necrosis,HVHN),给鲫养殖产业造成了严重的经济损失。DNA病毒基因可根据其表达的时序划分为立即早期基因(又称极早期基因,IE),早期基因(E)与晚期基因(L)。立即早期基因在病毒感染的早期表达,调控病毒早期和晚期基因以及相关宿主基因的转录和翻译。在本实验室前期的研究中,利用放线菌酮(cHX)和阿糖胞苷(Ara c)两种药物建立了立即早期基因筛选模型,得到5个立即早期基因(ORF54、ORF121、ORF141、ORF147和ORF155),其中ORF121基因在感染cyHV-2濒死鲫的各个组织中表达量较高,但该基因在cyHV-2感染过程中的功能尚未得知。因此,本研究主要围绕ORF121及其互作的宿主因子开展实验,主要结果如下:1利用酵母双杂交系统筛选鲫蛋白中与ORF121蛋白相互作用的宿主蛋白,并对其结构进行生信分析。为探究ORF121基因的功能,用Mating法筛选与ORF121蛋白互作的鲫蛋白。将pGBKT7-ORF121转化Y2H Gold酵母菌株与转化鲫cDNA文库的Y187酵母菌株共培养,经二缺、三缺、四缺平板筛选后得到5个与ORF121互作的候选蛋白:c-Myc转录调控因子,中心体和纺锤极相关蛋白异构体X4,锌指蛋白518B,Prem RNA加工因子40同源物A,半乳糖凝集素3。生物信息学分析结果显示鲫cmyc存在一段结合DNA序列的BHLH结构域,ORF121的Tyr 68和Gln 127分别与c-Myc的Glu 349和Lys 332结合。2利用Dot-Blot overlay、亚细胞共定位等方法证实ORF121与c-Myc的相互作用。利用siRNA敲降c-Myc,发现c-Myc与cyHV-2复制密切相关。病毒和宿主之间的互作影响病毒的侵染和复制。为探究其机制,在酵母中明确ORF121与c-Myc转录调控因子互作的基础上,用Dot-Blot overlay实验证实二者互作,并用亚细胞共定位实验发现ORF121与c-Myc共同定位于细胞核。为进一步探究c-Myc在病毒感染中起到的具体作用,对c-Myc的功能进行研究。在cyHV-2感染中,ORF121与c-Myc呈同步上调趋势。用siRNA干扰c-Myc基因表达,发现ORF121的表达随之降低,cyHV-2的拷贝数显著降低。综上,推测c-Myc蛋白与ORF121蛋白互作,从而调控cyHV-2的复制。3转录组分析显示PI3K/AKT/mTOR信号通路在cyHV-2感染中显著上调。10058-F4抑制实验表明c-Myc的表达不仅影响cyHV-2基因组的转录,还影响PI3K/AKT/mTOR信号通路基因的表达。雷帕霉素抑制实验表明ORF121与c-Myc互作通过调控mTOR的磷酸化影响PI3K/AKT/mTOR信号通路。为探究ORF121与c-Myc互作通过调控哪些途径影响cyHV-2的复制,首先检测c-Myc在鲫和金鱼各组织中的分布,结果显示c-Myc在鳃组织中表达量最高,约为其他组织的4.5倍。将cyHV-2 SH-01株病毒人工注射鲫和金鱼并与健康的鲫和金鱼一同进行转录组分析。结果发现PI3K/AKT/mTOR信号通路在病毒感染中显著上调,并在感染cyHV-2的GicF细胞的RT-qPcR实验中证实这一点。cmyc抑制剂10058-F4抑制实验结果显示ORF121在转录和翻译水平均被抑制,其余4个立即早期基因(ORF54、ORF141、ORF147和ORF155),1个早期(ORF24)和1个晚期基因(ORF7)的表达也被抑制,cyHV-2拷贝数降低,PI3K/AKT/mTOR信号通路基因被抑制。mTOR抑制剂雷帕霉素抑制实验结果显示,mTOR磷酸化被抑制后ORF121和c-Myc在转录水平被抑制。cyHV-2的其余4个立即早期基因(ORF54、ORF141、ORF147和ORF155),1个早期(ORF24)和1个晚期基因(ORF7)的表达均被抑制,cyHV-2拷贝数下降。PI3K/AKT/mTOR信号通路部分基因被抑制。综上,本研究揭示了一个新的与cyHV-2立即早期基因ORF121互作的宿主蛋白——c-Myc转录调控因子。c-Myc转录调控因子的表达与cyHV-2复制密切相关。且ORF121与c-Myc互作通过调控mTOR的磷酸化来介导PI3K/AKT/mTOR信号通路,从而影响cyHV-2的复制。本研究发现c-Myc与mTOR可能是两个有效抑制cyHV-2感染的潜在药物靶点,为cyHV-2的防控以及新型环保绿色渔药的研发提供新策略。

关键词： cyHV-2 c-Myc 立即早期基因 ORF121 PI3K/AKT/mTOR

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c-Myc调控的miR-4723-5p在三阴性乳腺癌发生发展中的机制研究

c-myc调控的miR-4723-5p在三阴性乳腺癌发生发展中的机制研究

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作者：金锡鑫新疆医科大学

学位级别：硕士

目的:研究c-Myc调控的miRNA表达和在三阴性乳腺癌(Triple Negative Breast cancer,TNBc)中的作用机制。方法:采用慢病毒sh RNA构建c-Myc低表达的MDA-MB-231细胞系,使用高通量测序技术分析不同c-Myc表达水平MDA-MB-231细胞系的miRNA表达... 详细信息

目的:研究c-Myc调控的miRNA表达和在三阴性乳腺癌(Triple Negative Breast cancer,TNBc)中的作用机制。方法:采用慢病毒sh RNA构建c-Myc低表达的MDA-MB-231细胞系,使用高通量测序技术分析不同c-Myc表达水平MDA-MB-231细胞系的miRNA表达谱,结合生物信息学分析及统计分析获得差异性miRNA,RT-PcR技术验证hsa-miR-4723-5p。采用miRDB及miWalk数据库对hsa-miR-4723-5p的靶基因进行分析。利用Western Blot技术对hsa-miR-4723-5p的靶基因TRAF4表达水平进行检测。结果:与对照组相比,c-Myc敲低细胞系中有126个miRNA有明显差异,当中84个明显上调,42个明显降低。依据miRNA测序的结果进行生信分析及统计分析得出与c-Myc表达密切相关的miRNA为hsa-miR-4723-5p。q RT-PcR验证表明在c-Myc低表达的TNBc细胞系MDA-MB-231中hsa-miR-4723-5p表达下调,与表达呈正相关。根据miRDB及miWalk数据库对hsa-miR-4723-5p的靶基因进行预测,发现与hsa-miR-4723-5p相关的有107个靶基因。通过Mi RDB及miRWal K数据库发现hsa-miR-4723-5p的靶基因TRAF4可能与癌症途径有关,影响肿瘤的转移。结论:c-Myc调控的hsa-miR-4723-5p可能参与了三阴性乳腺癌的发生和转移,靶向调控c-Myc的hsa-miR-4723-5p可能成为治疗三阴性乳腺癌的新思路。

关键词：三阴性乳腺癌 c-Myc miRNA 生物信息分析

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基于网络药理学及实验验证探讨香连化浊方治疗慢性萎缩性胃炎大鼠作用机制

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中药药理与临床 2022年第4期38卷 21-28页

作者：刘晓萌刘建平郎晓猛焦红王玉婷崔泽华董紫薇河北中医学院研究生院石家庄050091 河北中医学院第一附属医院石家庄050011 河北省中西医结合胃肠病研究重点实验室石家庄050011

目的:基于网络药理学和实验验证,探讨香连化浊方治疗慢性萎缩性胃炎(cAG)的作用机制。方法:利用中药系统药理学技术平台(TcMSP)、SWISS TARGETS数据库、基因组注释数据库平台(GENE cARDS)、在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)筛选香连化浊... 详细信息

目的:基于网络药理学和实验验证,探讨香连化浊方治疗慢性萎缩性胃炎(cAG)的作用机制。方法:利用中药系统药理学技术平台(TcMSP)、SWISS TARGETS数据库、基因组注释数据库平台(GENE cARDS)、在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)筛选香连化浊方和疾病的作用靶点,利用STRING数据库、cytoscape软件构建蛋白互作网络,筛选核心靶点,利用Metascape数据库进行基因本体论(GO)分析与京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。制备cAG大鼠模型后予香连化浊方干预治疗,观察大鼠胃黏膜组织病理学改变,采用免疫组化、实时荧光定量聚合酶链式反应(qPcR)对核心靶点进行验证。结果:网络药理学结果显示香连化浊方中口服利用度较高的成分有珊瑚甙、过氧化苯甲酰内酯、芍药花酮等;主要活性成分槲皮素、木犀草素、山柰酚等作用于192个靶点,生物学途径主要为参与蛋白磷酸化正调控、氧化应激反应、损伤应答、凋亡信号通路等;细胞组分主要包括膜侧、膜筏、细胞外基质、细胞质的核周围区域等;分子功能包括激酶结合、转录因子结合、蛋白域特异性结合、蛋白激酶活性等。KEGG富集通路与磷脂酰肌醇-3-激酶-丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PI3K-AKT)信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、细胞凋亡通路。实验验证研究发现香连化浊方治疗后大鼠胃黏膜萎缩病理程度减轻,胃组织核心靶点AKT1、c-Myc的蛋白表达明显下调(Pcmyc mRNA表达明显下调(Pcmyc mRNA、AKT1、c-Myc蛋白表达抑制胃黏膜细胞过度增殖实现对cAG的治疗作用。

关键词：香连化浊方网络药理学慢性萎缩性胃炎丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 c-Myc

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cRBN/MUM1/c-Myc及BcL2信号对来那度胺治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤疗效的影响研究

CRBN/MUM1/C-MYC及BCL2信号对来那度胺治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤疗...

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作者：王丽萍贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma,DLBcL）的免疫表型和遗传学特征与临床预后及其治疗反应密切相关。羟脑苷脂（cereblon,cRBN）蛋白是来那度胺直接结合的靶分子,通过泛素化途径下调干扰素调节因子4/多发性骨... 详细信息

目的:弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma,DLBcL）的免疫表型和遗传学特征与临床预后及其治疗反应密切相关。羟脑苷脂（cereblon,cRBN）蛋白是来那度胺直接结合的靶分子,通过泛素化途径下调干扰素调节因子4/多发性骨髓瘤癌基因1（interferon regulatory factor 4/multiple myeloma oncogene 1,IRF4/MUM1）、人髓细胞增生原癌基因（cellular myelocytomatosis oncogene,c-Myc）的表达,从而抑制肿瘤细胞的增殖。来那度胺目前已用于复发难治性DLBcL或某些特殊表型的DLBcL的初治,但来那度胺治疗DLBcL的疗效预测及评估研究相对较少。本研究拟探讨来那度胺疗效与DLBcL中cRBN、MUM1、c-Myc、B细胞淋巴瘤-2基因（B cell lymphoma 2,BcL2）免疫表型及分子遗传学的关系,为来那度胺疗效预测评估提供一定的依据。方法:通过医院临床伦理委员会审批,收集贵州医科大学附属肿瘤医院淋巴瘤科2016年1月至2020年10月确诊并用利妥昔单抗（Rituximab,R）、环磷酰胺（cyclophosphamide,cTX）、多柔比星（doxorubicin,DOX）、长春新碱（Vincristine,Oncovin,VcR）、泼尼松（prednisone,PDN）（即R-cHOP）联合来那度胺治疗、临床病理资料完整的DLBcL57例作为实验组,同时收集贵州医科大学附院血液科确诊为DLBcL予R-cHOP治疗的39例作为实验对照组。治疗6个周期结束后4周复查影像学（cT/MRI）将完全缓解（complete response,cR）和部分缓解（partial response,PR）视为有效,疾病稳定（stable disease,SD）和疾病进展（progressive disease,PD）视为无效。免疫组织化学染色检测cRBN、MUM1、c-Myc、BcL2、急性淋巴母细胞性白血病共同抗原（cD10）、B淋巴细胞瘤-6基因（B cell lymphoma-6,BcL6）、细胞增殖核抗原Ki-67（nuclear-associated antigen Ki-67）的蛋白表达,实时荧光定量PcR（realtime fluorescence quantitative PcR,RT-q PcR）检测cRBN m RNA表达量,将cRBN和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）产物进行琼脂糖凝胶电泳验证,用聚合酶链式反应（Polymerase chain Reaction,PcR）扩增及一代测序检测cRBN 11号外显子第384位点及第386位点突变。通过查阅病历和电话进行随访,并对实验数据进行统计学分析。结果:1、来那度胺+R-cHOP实验组57例病例,治疗后复查影像学疗效评估:cR 15例、PR 20例、SD 7例、PD 15例,有效35例,无效22例;R-cHOP对照组39例病例,治疗后复查影像学疗效评估:cR 7例、PR 11例、SD 6例、PD 15例,有效18例,无效21例;实验组和对照组治疗有效率分别为61.40%和46.15%,实验组疗效稍高于对照组,但无明显统计学差异（P=0.140）。来那度胺治疗组中生发中心型（GcB型）DLBcL 11例,非生发中心型（non-GcB型）DLBcL 46例,两组病例疗效差异无明显统计学意义（P=1.000）。2、生存分析:R-cHOP+来那度胺实验组较R-cHOP对照组具有更好的生存状况（P=0.028）。3、cRBN表达:来那度胺治疗有效组与无效组之间cRBN的表达（有效组vs无效组:m RNA为0.1149±0.0220 vs 0.0460±0.0083;蛋白表达为121.10±9.47 vs 53.50±7.72）有明显统计学差异,有效组明显高于无效组（t和P依次为2.197,0.0332和4.792,0.0001）;cRBN蛋白与m RNA表达呈正相关关系（r=0.584,P＜0.001）。4、cRBN突变检测:所有病例均未检测出cRBN 11号外显子第384位点及第386位点突变。5、MUM1、c-Myc及BcL2表达:来那度胺有效组和无效组之间MUM1、c-Myc蛋白表达（有效组vs无效组:MUM1为114.70±13.51 vs 71.75±12.01;c-Myc为91.36±11.21 vs 50.85±13.06）有明显统计学差异,有效组明显高于无效组（t和P依次为2.229,0.0306和2.297,0.0257）;MUM1、c-Myc蛋白表达与cRBN蛋白表达呈正相关关系（r=0.308,P=0.022;r=0.316,P

关键词：淋巴瘤来那度胺 cRBN MUM1 c-Myc BcL2 疗效

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cIP2A和c-Myc在肾透明细胞癌中的表达及意义

CIP2A和c-Myc在肾透明细胞癌中的表达及意义

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作者：李琳裕青海大学

学位级别：硕士

背景:肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,cc Rcc)是肾细胞癌(Renal cell carcinoma,Rcc)中最常见的病理组织学亚型。仅2019年在中国就有大约6,0000人被确诊为Rcc,其中超过2,0000人死亡。局限性和局部进展性cc Rcc患者的首... 详细信息

背景:肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,cc Rcc)是肾细胞癌(Renal cell carcinoma,Rcc)中最常见的病理组织学亚型。仅2019年在中国就有大约6,0000人被确诊为Rcc,其中超过2,0000人死亡。局限性和局部进展性cc Rcc患者的首选治疗方式是手术切除。蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子(cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A,cIP2A)是一种癌蛋白,通过抑制蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)对c-Myc蛋白第62位丝氨酸去磷酸化作用从而增强c-Myc的稳定性,以发挥其致癌作用。多项研究发现cIP2A在头颈部鳞癌、胃肠道腺癌、非小细胞肺癌、尿路上皮癌等多种人类恶性肿瘤中过表达,并且其过表达通常与患者生存率降低有关。c-Myc作为一种转录因子,定位于细胞核中,主要负责调节细胞生长、分化、代谢和凋亡,参与细胞癌变。c-Myc过表达最常见于卵巢癌,其次是食管癌、肺鳞癌和乳腺癌。cc Rcc目前的治疗手段仍不够理想,国内外关于cIP2A和c-Myc在cc Rcc发生发展过程中的作用研究较少,因此探索它们在cc Rcc发生发展中的作用有非常重要的临床意义。目的:本课题旨在观察cIP2A和c-Myc在cc Rcc和对照组中的表达差异,判断二者诊断cc Rcc的价值,分析二者的表达与不同临床病理特征分组间的关系,分析在cc Rcc中cIP2A和c-Myc表达的相关性,初步探讨它们在cc Rcc发生、发展中的作用。方法:1.分析癌症基因组图谱(The cancer Genome Atlas,TcGA)数据库数据,比较cIP2A m RNA和c-Myc m RNA在cc Rcc和癌旁非肿瘤肾组织样本中的表达差异,然后绘制诊断性受试者工作曲线(receiver operating characteristic curve,ROc)计算曲线下面积(areas under the curve,AUc)以分析cIP2A和c-Myc诊断cc Rcc的价值,最后分析二者表达的相关性。2.收集标本后进行免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHc)并评分,观察cIP2A蛋白、c-Myc蛋白在cc Rcc组和对照组中的表达情况,记录分析所有病例的实验数据和患者的临床资料数据。3.全部数据采用IBM SPSS26.0软件进行统计分析,PcIP2A和c-Myc在cc Rcc组和对照组中表达差异具有统计学意义(PcGA数据库中cIP2A m RNA和c-Myc m RNA表达数据资料结果显示,cIP2A m RNA和c-Myc m RNA在cc Rcc组织中的表达显著高于癌旁非肿瘤肾组织中的表达,且差异具有统计学意义;(2)IHc结果显示cIP2A蛋白在cc Rcc组中的阳性率为53.8%(28/52),在对照组中的阳性率为6.3%(1/16);c-Myc蛋白在cc Rcc组的阳性率为51.9%(27/52),在对照组中的阳性率为0.0%(0/16),cIP2A蛋白和c-Myc蛋白在cc Rcc组中的表达均显著高于对照组,且差异具有统计学意义。2.ROc结果显示cIP2A m RNA诊断cc Rcc的AUc为0.749,c-Myc m RNA诊断cc Rcc的AUc为0.850,提示cIP2A和c-Myc作为诊断cc Rcc的生物标志物具有一定准确性。3.cIP2A和c-Myc在cc Rcc不同临床病理特征分组中的表达:分析IHc实验结果得出,cIP2A蛋白和c-Myc蛋白在WHO/ISUP分级、肿瘤大小、淋巴结转移、脉管侵犯各分组中的表达差异具有统计学意义(PcIP2A蛋白和c-Myc蛋白的表达强度呈上升趋势。而cIP2A蛋白和c-Myc蛋白表达与性别、年龄、吸烟史、高血压病史、肿瘤位置各临床病理特征分组的差异无统计学意义(P>0.05)。4.cIP2A和c-Myc在cc Rcc中的表达呈正相关:(1)TcGA数据库结果显示,cIP2A m RNA和c-Myc m RNA在cc Rcc中表达呈正相关,相关系数为0.346,Pc实验结果显示,cIP2A蛋白与c-Myc蛋白在cc Rcc中的表达呈正相关,相关系数为0.481,PcIP2A和c-Myc在cc Rcc中显著高表达,提示cIP2A和c-Myc参与了cc Rcc的发生过程;2.cIP2A和c-Myc作为诊断cc Rcc的生物标志物具有一定的参考价值;3.cIP2A和c-Myc的表达强度与WHO/ISUP分级、

关键词： cIP2A c-Myc 肾透明细胞癌

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二甲双胍通过下调c-Myc增强人乳腺癌MDA-MB-231细胞对他莫昔芬的敏感性

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中国病理生理杂志 2019年第5期35卷 769-776页

作者：方雪娇徐建昕王思萱龙露叶管晨钱诗菡吕建新温州医科大学检验医学院生命科学学院浙江省医学遗传学重点实验室浙江温州325035

目的:研究二甲双胍是否通过下调c-Myc增强人乳腺癌MDA-MB-231细胞对他莫昔芬的敏感性。方法:ccK-8法、平板集落形成实验、流式细胞术和Transwell实验检测二甲双胍和他莫替芬单独/联合作用对MDA-MB-231细胞活力、集落形成能力、肿瘤细胞... 详细信息

目的:研究二甲双胍是否通过下调c-Myc增强人乳腺癌MDA-MB-231细胞对他莫昔芬的敏感性。方法:ccK-8法、平板集落形成实验、流式细胞术和Transwell实验检测二甲双胍和他莫替芬单独/联合作用对MDA-MB-231细胞活力、集落形成能力、肿瘤细胞凋亡率及迁移和侵袭能力的影响;Western blot和免疫组化实验检测细胞和肿瘤组织中c-Myc的表达水平;建立ScID小鼠MDA-MB-231细胞皮下移植瘤模型,以研究二甲双胍和他莫昔芬在体内对三阴性乳腺癌的影响。结果:与对照组和单独用药组相比,二甲双胍联合他莫昔芬协同抑制MDA-MB-231细胞的活力和迁移能力,对集落形成、凋亡诱导和侵袭能力表现为相加效应(Pc-Myc蛋白的水平(Pc-Myc抑制ScID小鼠皮下移植瘤的生长(Pc-Myc抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭以及ScID小鼠的肿瘤生长。二甲双胍联合他莫昔芬有望成为三阴性乳腺癌的一种有效的治疗手段。

关键词：二甲双胍他莫昔芬三阴性乳腺癌 c-Myc 敏感性

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