ISKNV和SCRV通过c-Myc调控鳜脑细胞谷氨酰胺代谢重编程的研究
作者单位：上海海洋大学
学位级别：硕士
导师姓名：付小哲
授予年度：2022年
主 题：鳜鱼 ISKNV SCRV c-Myc 谷氨酰胺代谢
摘 要：传染性脾肾坏死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV）和鳜弹状病毒（Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV）是鳜鱼（Siniperca chuatsi）的主要病毒性病原,其感染引起的疾病给鳜养殖业带来了重大的经济损失,是制约鳜养殖业发展的关键因素。病毒作为非细胞结构生物,其复制增殖完全依赖细胞代谢。谷氨酰胺代谢是病毒调控细胞代谢的一个重要靶标,其提供的能量和中间代谢物可利于病毒增殖。前期研究发现,ISKNV、SCRV感染能诱发细胞谷氨酰胺代谢重编程,但是ISKNV和SCRV是如何调控谷氨酰胺代谢重编程的机制尚不清楚。c-Myc是调控细胞代谢的关键转录因子,c-Myc能够调控谷氨酰胺酵解途径的限速酶谷氨酰胺酶1（Glutaminase1,GLS1）的表达从而调控谷氨酰胺代谢。那么ISKNV和SCRV是否能通过调控鳜c-Myc（Sc-c-Myc）进而调控谷氨酰胺代谢呢?因此,本研究对Sc-c-Myc在ISKNV和SCRV感染中的作用及ISKNV、SCRV如何调控Sc-c-Myc进而调控谷氨酰胺代谢的分子机制进行了深入的研究。主要结果如下:（1）鳜c-Myc基因的克隆、表达分析及多克隆抗体的制备通过PCR获得了Sc-c-Myc ORF,全长1113bp,编码370个氨基酸,其中293-368 aa是其保守区,属于螺旋环螺旋（b-HLH）DNA结合蛋白的超家族,其包含多个DNA和多肽结合位点;预测Sc-c-Myc的三级结构和人c-Myc的三级结构,发现他们的结构非常相似;比较不同物种的c-Myc,结果显示Sc-cMyc在进化上具有一定的保守性。通过实时荧光定量（qRT-PCR）法检测Sc-cMyc mRNA的组织表达,结果显示,Sc-c-Myc mRNA在健康鳜鱼的10种组织中均有表达,且呈组成型表达,其中后肾组织中的表达量最高。制备了Sc-cMyc多克隆抗体,结果显示此抗体能特异性识别鳜脑细胞（Chinese perch brain cell,CPB）中的Sc-c-Myc蛋白,可用于下一步实验。（2）Sc-c-Myc对ISKNV、SCRV感染的应答及复制增殖的影响ISKNV和SCRV感染鳜鱼和CPB细胞后,采用定量PCR及western blotting检测Sc-c-Myc的mRNA和蛋白表达。结果显示,ISKNV、SCRV感染后,鳜鱼脾脏和CPB细胞中的Sc-c-Myc转录水平显著提高,CPB细胞中Sc-c-Myc蛋白表达量也显著升高,表明Sc-c-Myc在ISKNV和SCRV感染中起重要作用。随后构建了Sc-c-Myc过表达载体,转染至CPB细胞,经过筛选鉴定获得了过表达Sc-c-Myc稳转细胞系,另外设计了siRNA敲降CPB细胞中Sc-c-Myc的表达,检测这两种细胞中谷氨酰胺代谢相关酶（GLS1,GDH,IDH2）的表达、对谷氨酰胺摄取以及ISKNV、SCRV增殖情况。结果显示,过表达Sc-c-Myc后,与对照组相比,GLS1、GDH和IDH2的转录及蛋白表达显著上调,细胞对谷氨酰胺的摄取显著增加,ISKNV、SCRV的病毒产量也显著升高,表明过表达Sc-c-Myc可促进谷氨酰代谢途径关键酶GLS1、GDH和IDH2的表达,提高细胞对谷氨酰胺的摄取,促进ISKNV和SCRV的复制增值;敲降Sc-c-Myc后,与对照组相比,GLS1、GDH和IDH2的转录及蛋白表达均显著下调,细胞对谷氨酰胺的摄取也显著减少,ISKNV、SCRV的病毒产量也显著降低,表明敲降Sc-c-Myc可抑制细胞GLS1、GDH和IDH2的表达和细胞对谷氨酰胺的摄取,抑制ISKNV和SCRV的复制增殖。以上结果表明ISKNV和SCRV是通过上调Sc-c-Myc表达增强谷氨酰胺代谢以供自身复制增殖。（3）ISKNV和SCRV调控Sc-c-Myc的机制研究通过免疫共沉淀（Co-IP）和蛋白质质谱技术,分析寻找ISKNV、SCRV可能调控并与Sc-c-Myc相互作用的病毒蛋白。Co-IP结果显示SCRV的核衣壳蛋白（N蛋白）与Sc-c-Myc存在相互作用;质谱分析结果筛选出可能与Sc-c-Myc互作的ISKNV病毒蛋白3个,分别为ORF118L、ORF102R和ORF093R。分别构建ISKNV的这3个病毒蛋白带Flag标签过表达载体并转染到CPB细胞,通过细胞荧光共定位实验发现,这3个病毒蛋白在CPB细胞内分别与Sc-c-Myc存在一定程度的胞内共定位现象。随后通过蛋白互作实验发现ISKNV病毒蛋白ORF102R和ORF093R与Sc-c-Myc存在相互作用,并且通过qRT-PCR和Western blotting检测发现转染ISKNV ORF093R的CPB细胞中,Sc-c-Myc、GLS1和IDH2的转录水平和蛋白表达水平都显著上调,而转染ISKNV ORF102R的CPB细胞中GLS1的转录水平和蛋白表达水平显著上调。转染SRCV-N蛋白过表达载体的CPB细胞中,Sc-c-Myc和GLS1的转录水平和蛋白表达水平显著上调。以上结果表明ISKNV和SCRV可通过其病毒蛋白与Sc-cMyc互作来促进Sc-c-Myc的表达进而调控宿主细胞谷氨酰胺代谢重构以供自身复制增殖。综上,本研究阐明了ISKNV和SCRV通过编码改变Sc-c-Myc表达的病毒蛋白,促进Sc-c-Myc和GLS1的表达,从而促进宿主细胞谷氨酰胺代谢和自身增殖,为防控ISKNV和SCRV提供了新思路。
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