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Structural Variation Analysis of Mutated Nannochloropsis oceanica Caused by zeocin Through Genome Re-Sequencing

Journal of Ocean University of China 2018年第5期17卷 1225-1230页

作者： LIN Genmei ZHANG Zhongyi GUO Li DING Haiyan YANG Guanpin Laboratory of Marine Genetics and Breeding Ocean University of China College of Marine Life Sciences Ocean University of China Institutes of Evolution and Marine Biodiversity Ocean University of China

zeocin can cause double strand breaks of DNA and thus may be employed as a mutagen. In this study, two strains of Nannochloropsis oceanica, the wild and the zeocin-tolerant strains, were re-sequenced to verify such function of zeocin, The results showed that zeocin can mutate the N. oceanica genome and cause the structural variation. zeocin either swept away or selected the alleles of genes functioning in ubiquitin-mediated proteolysis, alpha-linolenic acid metabolism, ascorbate and aldarate metabolism, ribosome biogenesis, and circadian rhythm, indicating that N. oceanica may have adjusted its metabolic performances for protein, carbohydrate, and lipid, and changed its ribosome biosynthesis and living rhythm to survive in zeocin containing medium. In addition, zeocin caused mutation may have influenced the expression of a set of tanscription factors. It was concluded that zeocin effectively caused the structural variation of the genome of N. oceanica, and forced the microalgae to select out the alleles of a set of genes around these variations in order to adapt to zeocin containing medium. Further studies on the genetic basis of the phenotypic adaptation of this haploid and asexual microalga and the application of zeocin to its genetic improvement are very important.

关键词： Nannochloropsis oceanica zeocin mutation genome re-sequencing structural variation

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zeocin和GFP双筛选标记重组痘苗病毒载体的构建

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国际流行病学传染病学杂志 2012年第3期39卷 148-152页

作者：房有荣李红玉陈科达周文硕阎辉浙江省医学科学院药物研究崩杭州310013 病毒病研究所

目的为研究重组痘苗病毒通用载体，构建融合zeocin和GFP双筛选标记质粒pcB-Zeo-GFP。方法质粒LeCo-G／Zeo含有Zeo-GFP融合基因片段，通过PCR反应、BamHI酶切后连接替换空白质粒pCB的筛选基因gpt，通过菌落PCR，酶切图谱分析及测序分析... 详细信息

目的为研究重组痘苗病毒通用载体，构建融合zeocin和GFP双筛选标记质粒pcB-Zeo-GFP。方法质粒LeCo-G／Zeo含有Zeo-GFP融合基因片段，通过PCR反应、BamHI酶切后连接替换空白质粒pCB的筛选基因gpt，通过菌落PCR，酶切图谱分析及测序分析鉴定重组质粒，构建成功后将其与野生型痘苗病毒进行位点特异性同源重组，经zeocin药物筛选2代后，用流式细胞仪观察重组痘苗病毒GFP表达。结果经菌落PCR，1号、5号和10号菌落中扩增出426bp的目的条带，与预期的大小完全一致，经酶切分析和DNA测序进一步验证了重组质粒pCB-zeo-GFP；该质粒与野生型痘苗病毒同源重组，得到了重组的痘苗病毒；zeocin筛选2代后，病毒上清感染细胞，流式细胞分析7．18％的细胞中有GFP的表达，而阴性对照仅有1．43％；zeocin药物筛选5代后，通过激光共聚焦可在80％以上的细胞中观察带GFP；提取的重组痘苗基因组DNA也扩增出预期大小目的条带。结论含zeocin和GFP双筛选标记的新型重组痘苗病毒不仅具有可观察性且具有药物抗性，非常容易进行筛选鉴定。

关键词：痘苗病毒载体构建 GFP zeocin

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Verification of Mutagen Function of zeocin in Nannochloropsis oceanica ThroughTranscriptome Analysis

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中国海洋大学学报（英文版） 2017年第3期 501-508页

作者： LIN Genmei WANG Yamei GUO Li DING Haiyan HU Yongmei LIANG Sijie ZHANG Zhongyi YANG Guanpin Laboratory of Marine Genetics and Breeding，Ocean University of China College of Marine Life Sciences，Ocean University of China Institutes of Evolution and Marine Biodiversity，Ocean University of China

zeocin can cause double strand breaks of DNA and thus is frequently used as a selective antibiotic of eukaryotic Sh ble transformants. In non-transformation system, zeocin may function as a mutagen if not totally lethal. To verify such function of zeocin, we mutated Nannochloropsis oceanica by increasing the concentration of zeocin in medium gradually, and isolated a N. oceanica strain（single cell culture） which survived zeocin up to 10.0μg mL-1. The zeocin-tolerant strain entered the exponential growth phase later and grew slower than the wild strain. Transcriptome profiling showed that the zeocin-tolerant N. oceanica strain survived zeocin mainly by adapting（heritable）, rather than acclimating（plastic） to zeocin. Hence mutating N. oceanica with zeocin was approved effective. Meanwhile, the physiological characteristics of this zeocin-tolerant strain were demonstrated. As we proposed, N. oceanica tolerated zeocin by strengthening its protein degradation and antioxidation. The genes controlling cell division and cellular response to stimuli may also have played important roles in the reduction of growth and the tolerance to zeocin. Our findings evidenced that zeocin can serve as an appropriate mutagen of microalgae. Creating variations through mutation with zeocin may help to study the genetic basis of the traits of this monoploidy and asexual microalga, as well as improve its production.

关键词： Nannochloropsis oceanica mutation zeocin tolerance transcriptome

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稳定表达TSC1/TSC2蛋白质复合物的293T细胞系的建立

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中国细胞生物学学报 2012年第12期34卷 1215-1219页

作者：闫丽君吴更上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240

我们使用Clonetech的同源重组酶连接人TSC1、TSC2全长蛋白编码cDNA ORF到pBudCE4.1真核细胞双元表达载体上,用脂质体Lipofectamine 2000介导重组质粒pBudCE4.1/TSC2/TSC1导入293T细胞,用含125μg/mL zeocin的培养基筛选稳定表达TSC1/TSC2蛋白的细胞株,并用Western blot方法鉴定稳转细胞株的稳定性。该实验成功建立了稳定表达TSC1/TSC2蛋白的293T细胞系,从而为今后研究TSC1/TSC2蛋白的结构与功能提供实验基础。

关键词： TSC1 TSC2 稳转细胞系真核细胞双元表达载体 zeocin

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毕赤酵母细胞壁多糖合成相关基因GAS1和MNN2对毕赤酵母表面展示效...

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作者：朱俊华南理工大学

学位级别：硕士

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碱性木聚糖酶高产酵母菌株的选育

碱性木聚糖酶高产酵母菌株的选育

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作者：王裔雄湖北大学

学位级别：硕士

木聚糖酶是降解半纤维素木聚糖的一组酶的总称,在食品、饲料、制浆、造纸等工业中有着广泛的应用前景。为了能够提高木聚糖酶的产量,增强其生物反应催化能力,更好的利用木聚糖酶的优良生物特性,筛选适合工业生产应用的木聚糖酶高产菌株... 详细信息

木聚糖酶是降解半纤维素木聚糖的一组酶的总称,在食品、饲料、制浆、造纸等工业中有着广泛的应用前景。为了能够提高木聚糖酶的产量,增强其生物反应催化能力,更好的利用木聚糖酶的优良生物特性,筛选适合工业生产应用的木聚糖酶高产菌株以实现产业化大规模应用势在必行。本实验在前期工作已获得整合有表达载体pHBM905A-xynHB的重组子GS115-905-XYNHB1的基础上,构建含有目的基因xynHB的重组毕赤酵母表达载体pPICZa A-xynHB,将这一重组表达质粒经酶切线性化以后,电转化至的毕赤酵母GS115-905-XYNHB1中,涂布在含有不同浓度zeocin抗生素的YPD平板上,筛选获得转化子pHBM905A-XYNHB-pPICZaA-XYNHB1-6。对筛选得到的6个pHBM905A-XYNHB-pPICZa A-XYNHB重组子进行摇瓶诱导发酵,测得6个重组子的酶活分别为1236U/ml、1198U/ml、1065U/ml、1024U/ml、996U/ml、1089U/ml,相比较原始菌株GS115-905-XYNHB1的发酵酶活547U/ml,酶活产生了显著提高。对酶活最高的1号菌进行50L发酵罐放大中试,木聚糖酶酶活达到10000U/ml以上。为了确定1—6号菌株中目的基因xynHB的拷贝数,我们通过Real-time PCR测定了六个重组菌株的目的基因和参照基因的CT值,根据结果计算出拷贝数。相对于单拷贝GS115-905-XYNHB1,计算结果显示6个重组菌株的拷贝数依次分别为3,3,2,2,2,2。综上所述,本实验利用毕赤酵母表达载体的不同选择标记,在整合有木聚糖酶基因xynHB的一代转化子GS115-905-XYNHB1的基础上,转入第二种重组载体pPICZa A-xynHB,得到二代转化子pHBM905A-XYNHB-pPICZa-XYNHB,根据不同浓度的zeocin抗性筛选,就可以获得产木聚糖酶高表达菌株。此种筛选方式也可以用来筛选其他产酶菌株或者是蛋白表达菌株。

关键词：木聚糖酶毕赤酵母同源重组多拷贝 His 4筛选标记 zeocin

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禽病原性大肠杆菌E058株iucD、ftsk基因突变株的构建及其致病性评价

禽病原性大肠杆菌E058株iucD、ftsk基因突变株的构建及其致病性评...

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作者：陈艺丽扬州大学

学位级别：硕士

禽大肠杆菌病(Avian Colibacillosis)是指部分或全部由禽病原性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli, APEC)引起的局部或全身性感染的疾病,包括大肠杆菌性败血症、大肠杆菌肉芽肿(Hjarre氏病)、气囊病(慢性呼吸道病,CRD)、禽蜂... 详细信息

禽大肠杆菌病(Avian Colibacillosis)是指部分或全部由禽病原性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli, APEC)引起的局部或全身性感染的疾病,包括大肠杆菌性败血症、大肠杆菌肉芽肿(Hjarre氏病)、气囊病(慢性呼吸道病,CRD)、禽蜂窝织炎、肿头综合症、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、全眼球炎及脐炎/卵黄囊感染。禽大肠杆菌病是2至12周龄鸡和火鸡的一种常见传染病,给养禽业造成了严重的经济损失。大肠杆菌血清型复杂多样,在APEC中最常见的血清型是O1、O2和O78。本研究旨在研究气杆菌素家族的iucD基因以及功能未知基因ftsk与致病性之间的关系,了解iucD与ftsk突变株的生物学特性,为深入研究该病的致病机理和特异防制措施奠定基础。1.禽病原性大肠杆菌E058株iucD基因突变株的构建及其治病性的研究运用等位基因交换的方法构建iucD的基因缺失突变株。PCR扩增iucD基因并将其插入到pBSK载体的多克隆位点中,再运用分子克隆的方法将zeocin抗性基因插入到目的基因iucD中,构建出带zeocin抗性基因标志的载体pSK-iucD-Zeo,通过PCR扩增片段iucD-Zeo,并电转化入禽病原性大肠杆菌分离株E058中,根据同源重组原理,筛选出E058突变株E058iucD。Southern blot的结果显示zeocin抗性基因在E058基因组或质粒中的插入是单拷贝的;RT-PCR结果表明突变株的iucD基因不能转录,而其上下游基因的转录未受到影响;E058iucD株较E058株在生长速度上几乎没有差别;在血清杀菌性实验中,突变株对SPF鸡血清比野生株敏感;体内外竞争实验结果表明,E058iucD株对E058株竞争力很弱;E058和E058iucD株的半数致死量(LD50)为分别为105.5 CFU和106.5 CFU;在35日龄SPF鸡的致死性试验中,E058株所致死亡率为50%,而E058iucD突变株所致死亡率为16.5%(p<0.05);12日龄的SPF鸡胚的致死性实验结果表明,E058组死亡率为60%,而E058iucD组死亡率为35%(p<0.05)。上述结果揭示,iucD基因编码的IucD与APEC E058株的致病性有关。2.禽病原性大肠杆菌E058株ftsk基因突变株的构建及其致病性研究运用基因重组的方法将卡那霉素抗性基因(kan)连接到PCR扩增的ftsk两端区域的2个基因片段之间,再插入到pBSK载体的多克隆位点中,构建出带kan基因标志的载体pSK-F2-Kan-F1,通过PCR扩增F2-Kan-F1片段,电转化APEC分离株E058,根据同源重组原理,筛选出APEC E058 ftsk基因缺失突变株E058ftsk。Southern blot结果显示kan抗性基因片段在E058全基因组或质粒中的插入并不是单拷贝的,而是插入了两个拷贝;RT-PCR结果表明突变株的ftsk基因已经不能反转录,而其上下游基因并未受到影响;生长曲线测定结果显示,E058ftsk的生长速度低于亲本株E058;动物实验结果表明E058ftsk在攻毒后6、12和24 h时血液、肝脏、脾脏和肺中的细菌数显著少于APEC E058株。APEC E058株感染组在接种48 h后,除扑杀鸡外,接种鸡全部死亡;而E058ftsk组相应的死亡率为20%左右。因此,可以认定ftsk为APEC E058株的毒力基因之一。

关键词：禽致病性大肠杆菌 iucD基因 ftsk基因突变株 zeocin kanmycin 致病性

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