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幽门螺杆菌CagA与ywhae互作区段的确定

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中国人兽共患病学报 2022年第11期38卷 975-981页

作者：张晓艳温春燕陈豪佘菲菲福建医科大学基础医学院消化道恶性肿瘤教育部重点实验室福建省肿瘤微生物学重点实验室福州350122

目的探讨幽门螺杆菌CagA蛋白与宿主细胞ywhae蛋白相互作用的区段。方法先在酵母细胞水平构建CagA区段蛋白[-N、-M、-(N+M)、-C]的表达载体,经“滤纸法”检测、一对一交配试验及“ONPG液相法”分析,筛选互作区段;进而在哺乳动物细胞水平... 详细信息

目的探讨幽门螺杆菌CagA蛋白与宿主细胞ywhae蛋白相互作用的区段。方法先在酵母细胞水平构建CagA区段蛋白[-N、-M、-(N+M)、-C]的表达载体,经“滤纸法”检测、一对一交配试验及“ONPG液相法”分析,筛选互作区段;进而在哺乳动物细胞水平,选用Cos7细胞经共转染、Co-IP方法确定互作区段,选用AGS细胞经上调/下调ywhae表达、共转染、双荧光素酶报告基因检测等分析细胞NF-κB活性检测CagA候选区段与ywhae互作的功能。结果成功构建CagA蛋白的N、M、(N+M)和C区段的酵母表达载体,CagA各区段蛋白“滤纸法”检测反式激活特性均为阴性,“一对一”交配后“液相法”筛选到CagA区段[-N、-(N+M)、-C]分别可与ywhae在酵母中相互作用;Cos7细胞实验确定CagA区段[-N、-C]可分别沉淀外源性ywhae,AGS细胞中CagA区段[-N、-C]对细胞NF-κB的激活,上调ywhae能增强、下调ywhae则抑制。结论幽门螺杆菌CagA蛋白N-末端与C-末端均分别与宿主细胞ywhae蛋白相互作用,并可激活细胞NF-κB。

关键词：幽门螺杆菌 CagA ywhae 相互作用 NF-κB

ywhae表达与结直肠癌临床病理因素及意义研究

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YWHAE表达与结直肠癌临床病理因素及意义研究

作者：尹天阳沈阳医学院

学位级别：硕士

目的ywhae（14-3-3ε）其中文全称为酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白,属于14-3-3蛋白家族序列蛋白,为30kDa酸性多肽。14-3-3蛋白有7种亚型,分别为β,ε,ε,γ,τ,δ和σ。ywhae（14-3-3ε）便是其中之一。在真核生物细胞中,... 详细信息

目的ywhae（14-3-3ε）其中文全称为酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白,属于14-3-3蛋白家族序列蛋白,为30kDa酸性多肽。14-3-3蛋白有7种亚型,分别为β,ε,ε,γ,τ,δ和σ。ywhae（14-3-3ε）便是其中之一。在真核生物细胞中,研究表明该家族系列蛋白属于表达高度保守的酸性蛋白,通过与其对应的靶蛋白结合,参与并调节人体细胞周期,传导信号,黏附及恶性转化等多种人体细胞生理学功能。目前根据各个肿瘤研究方向表明,ywhae与多种常见恶性肿瘤的发生发展存在密切联系,如肝癌,胃癌,肾癌等多种肿瘤组织中表达均高于正常组织,然而关于ywhae表达在结直肠肿瘤中的相关研究报道仍较少。本篇文章通过研究ywhae蛋白在结直肠肿瘤组织中的表达水平情况,以及与患者预后的相关性,探讨其相关临床意义,为未来结直肠恶性肿瘤的治疗提供可能的方向和思路。方法本实验通过采集沈阳医学院附属中心医院普外科2009年-2014年294例结直肠癌患者术后的病理标本,其中所采取标本的患者均未做过术前新辅助放化疗且已签署知情同意书。294例患者病理标本中癌组织与癌旁组织配对成功254例,将其制备成组织芯片,并对制备完成的组织芯片进行免疫组化染色（PV二步法）,用以检测ywhae在结直肠肿瘤组织及其癌旁组织的细胞中定位、分布及表达情况,随后对数据进行统计,分析其表达与结直肠癌患者的临床病例资料指标和预后的相关性。结果依据实验免疫组织化学染色（PV二步法）结果显示,ywhae阳性结果表达大多集中定位于标本细胞的细胞质,少量表达于其间质和细胞膜,ywhae阳性表达在结直肠肿瘤组织标本中的高表达率显著高于其在癌旁组织的表达率（Pywhae阳性表达与结直肠恶性肿瘤的病理组织学分级,浸润深度,周围淋巴结转移及TNM分期呈正相关（Pywhae阳性表达与结直肠恶性肿瘤患者的性别,年龄,肿瘤发生部位,肿瘤大体分型都无明显相关性（P>0.05）;Kaplan-Meier生存曲线结果提直肠恶性肿瘤中ywhae阳性高表达的患者术后生存时间显著短于低表达患者（Pywhae为结直肠恶性肿瘤患者术后的独立预后因素（Pywhae很有希望是一个结直肠恶性肿瘤治疗的潜在新靶点。

关键词： ywhae 结直肠恶性肿瘤免疫组化生存预后

ywhae靶向AKT途径调控结肠癌细胞EMT的机制研究

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YWHAE靶向AKT途径调控结肠癌细胞EMT的机制研究

作者：刘思思海南医学院

学位级别：硕士

背景:IARC（International Agency for Research on Cancer,世界卫生组织国际癌症研究机构）发布的2020年全球最新癌症负担数据显示,结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）在中国和全球的发病率分别位居第2和第3;死亡率分别位居第5和第2,... 详细信息

背景:IARC（International Agency for Research on Cancer,世界卫生组织国际癌症研究机构）发布的2020年全球最新癌症负担数据显示,结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）在中国和全球的发病率分别位居第2和第3;死亡率分别位居第5和第2,侵袭、转移、复发是患者常见的死亡原因。先前的研究表明,酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白（Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein,ywhae）在多种肿瘤中高表达,包括CRC,通过结合磷酸丝氨酸介导的信号转导相关的蛋白质,参与调节多种细胞功能,如细胞周期、细胞凋亡、扩散迁移等。高表达的ywhae与更高的CRC转移风险和较低的患者生存率显著相关。目的:探讨ywhae表达与结肠癌上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的相关性及可能涉及的分子通路。方法:构建慢病毒包装的ywhae短发夹RNA（LV-ywhae-shRNA）并感染结肠癌SW620细胞。实验分为ywhae干扰组（KD组）、阴性转染对照组（NC组）、未转染组（CON组）。应用蛋白质印迹（Western blot）、RT-q PCR及免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）技术,检测结肠癌细胞在感染前后ywhae基因表达情况;细胞克隆形成试验比较感染前后结肠癌细胞克隆形成的能力变化;MTT法检测感染前后结肠癌SW620细胞增殖能力变化情况;应用Western blot、IHC检测EMT标志物及AKT-β-catenin、ERK1/2等相关通路蛋白,分析ywhae基因调控结肠癌细胞EMT可能涉及的信号通路。结果:LV-ywhae-shRNA成功感染结肠癌SW620细胞,感染率＞90%;q PCR及Western blot结果显示,相对于NC组,KD组SW620细胞ywhae抑制效率为75%,差异有显著性（P＜0.05）;相对于CON组,NC组表达无明显差异（P＞0.05）。MTT实验结果显示KD组、NC组、CON组96h增长倍数分别为1.51、3.04、3.11,KD组细胞的增长速率比NC组下降了50.3%,差异有显著统计学意义（P＜0.01）;相对于CON组,NC组无明显差异（P＞0.05）。细胞克隆形成试验显示,CON组、NC组和KD组的细胞克隆数分别是1039、1131、191,与NC组相比,KD组细胞克隆数下降了83.1%,差异具有统计学意义（P＜0.05）;CON组、NC组和KD组的细胞克隆面积分别是94.37、93.58、74.19,与NC组相比,KD组细胞克隆面积下降了20.7%,差异具有统计学意义（P＜0.05）;相对于CON组,细胞克隆数和克隆面积在NC组中无明显差异（P＞0.05）。Western blot结果显示,与NC组相比,KD组E-cadherin的蛋白表达上调了41.1%,差异具有统计学意义（P＜0.05）;与NC组相比,KD组Vimentin的蛋白表达下调了68.8%,差异具有统计学意义（P＜0.05）;相对于CON组,NC组无明显差异（P＞0.05）。IHC检测结果示:E-cadherin在KD组、NC组、CON组的阳性表达率分别为81.2%、30.6%、50.8%,与NC组细胞相比,KD组细胞E-cadherin的阳性细胞表达率上调了62.3%,差异具有统计学意义（P＜0.05）;Vimentin在KD组、NC组、CON组的阳性表达率分别为1.4%、71.2%、70.4%,与NC组相比,Vimentin在KD组的阳性细胞表达率降低了98.0%,差异具有统计学意义（P＜0.05）,相对于CON组,E-cadherin、Vimentin在NC组中的表达无明显差异（P＞0.05）。Western blot结果显示,与NC组相比,KD组AKT、p AKT的蛋白表达分别下调了75.0%、77.8%,差异都具有统计学意义（P＜0.05）,相对于CON组,AKT、p AKT在NC组中的表达无明显差异（P＞0.05）;ERK、p ERK的蛋白表达在KD组、NC组、CON组的表达无明显差异（P＞0.05）;IHC结果显示,AKT在KD组、NC组、CON组的阳性表达率分别为30.2%、94.2%、61.5%,与NC组相比,AKT在KD组的表达降低了67.9%,差异具有统计学意义（P＜0.05）;p AKT在KD组、NC组、CON组的阳性表达率分别为60.4%、95.5%、96.1%,与NC组相比,p AKT在KD组的阳性表达率降低了36.8%,差异具有统计学意义（P＜0.05）;β-c

关键词： ywhae 结肠癌 RNA干扰细胞转移 EMT

ywhae在大肠癌中的表达及其生物信息学分析

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YWHAE在大肠癌中的表达及其生物信息学分析

作者：吴昕阳吉林大学

学位级别：硕士

背景及目的:大肠癌（CRC）是我国常见的恶性肿瘤之一,其发病率及死亡率在近年呈上升趋势,多数病人发病时已处于中晚期,转移及复发是患者死亡的主要原因。目前,手术治疗辅以放、化疗为主要的治疗手段,因此早期筛查与诊断大肠癌尤为重要... 详细信息

背景及目的:大肠癌（CRC）是我国常见的恶性肿瘤之一,其发病率及死亡率在近年呈上升趋势,多数病人发病时已处于中晚期,转移及复发是患者死亡的主要原因。目前,手术治疗辅以放、化疗为主要的治疗手段,因此早期筛查与诊断大肠癌尤为重要。随着分子诊断学的不断发展,分子标记物逐渐用来早期筛查及诊断恶性肿瘤,其具有高灵敏度及特异性的特点。大量研究证明酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白,ε肽（Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation activation protein,epsilon,ywhae）参与细胞的多种生理活动,在肿瘤的发生、发展、转移中发挥一定的作用。本文研究ywhae在大肠癌中的表达情况以及对其生物信息学进行分析。通过挖掘相关专业数据库,探索ywhae在大肠癌发生、发展、转移中的作用,旨为临床早期诊断大肠癌提供新型肿瘤标志物以及基因治疗靶点。方法:本实验方法涉及以下3个方面:（1）采用色谱与质谱联用技术来筛选差异表达的蛋白。（2）查阅大量相关文献,筛选出ywhae作为本次实验的目标蛋白。应用Western Blot（免疫印迹技术）验证ywhae在大肠癌患者癌组织及癌旁组织中的表达情况。（3）挖掘相关专业数据库,并利用软件整合数据库中ywhae的相关信息,研究其与大肠癌之间的关系。结果:1.质谱-色谱分析结果显示,大肠癌组织及其癌旁组织共有68种差异表达蛋白,其中有42种蛋白在肿瘤组织中上调表达,26种蛋白在肿瘤组织中下调表达,本研究的目标蛋白ywhae为上调表达蛋白之一。*** Blot实验结果证明ywhae在大肠癌组织中的表达高于癌旁组织,为上调蛋白。3.分析整合Oncomine数据库得知,ywhae在大肠癌组织中的表达高于癌旁组织;搜索Cbioportal数据库得知,编码ywhae基因在大肠癌中的突变频率仅为2.7%。同时对ywhae的共表达基因进行分析,根据相关性大小排列,前十位基因如下:GLOD4、COPS3、C1QBP、EIF4A1、RPA1、PRPSAP2、MRM3、TSR1、NUP88、SCO1。同时,分析得出共表达基因TP53与ywhae水平呈正相关。通过分析COSMIC数据库,我们可以分析ywhae的突变类型及其比例,其中无义突变所占比例最小,占0.91%,错义突变所占比例最高,达17.52%。其他突变类型所占比列较小,占比区间为0.00%-6.04%。通过ClueGO和GluePedia分析可以得到ywhae共表达基因相互间的作用及信号传导通路。最主要的信号通路为胼胝体形态发生通路,占比37.93%,其次为胆固醇外排的正调节通路,占比17.24%。通过分析STRING数据库可以得到ywhae与其14-3-3蛋白家族中的亚型（YWHAZ、YHWAH）、RAF1、BRAF 等蛋白密切相关。结论:***在大肠癌组织中上调表达,其在癌组织中表达的含量高于癌旁组织的含量。2.编码ywhae的基因在大肠癌中突变率低,适合作为分子标志物及基因表达的研究,且该基因与大肠癌的多条转导通路密切相关,可能成为大肠癌的新型肿瘤标志物以及治疗的分子靶标,该基因在大肠癌的发生、发展、转移中起到作用值得更深入的研究与探索。

关键词：大肠癌质谱-色谱联用技术 ywhae Western Blot 生物信息学

ywhae沉默结肠癌细胞差异表达基因的筛选及鉴定

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YWHAE沉默结肠癌细胞差异表达基因的筛选及鉴定

作者：苏晗颖海南医科大学

学位级别：硕士

目的:筛选ywhae基因沉默后结肠癌细胞差异表达基因,分析可能涉及结肠癌细胞增殖的基因及分子通路。方法:通过癌症基因组图谱(the Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库下载结肠癌相关数据,分析ywhae m RNA的表达与结肠癌临床病理特征和预后... 详细信息

目的:筛选ywhae基因沉默后结肠癌细胞差异表达基因,分析可能涉及结肠癌细胞增殖的基因及分子通路。方法:通过癌症基因组图谱(the Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库下载结肠癌相关数据,分析ywhae m RNA的表达与结肠癌临床病理特征和预后的关系。购买结肠癌及其配对的癌旁正常肠黏膜样本组织芯片1张,通过免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)Max Vision法检测ywhae蛋白的表达情况,分析其表达与结肠癌临床病理特征及预后的关系。采用慢病毒包装的sh RNA干扰技术沉默人结肠癌SW620细胞株中的ywhae基因,RT-q PCR、Western blot验证沉默效率。MTT、细胞克隆形成实验检测ywhae基因沉默前后结肠癌细胞增殖、细胞克隆形成能力的变化,流式细胞术分析ywhae沉默前后结肠癌细胞细胞周期及细胞凋亡变化情况。基因芯片杂交技术筛选ywhae基因沉默后结肠癌细胞差异表达基因,对所有差异表达的基因进行GO和KEGG的富集分析,随机选取5个基因进行western blot验证。TCGA数据分析差异表达基因在结肠癌中的表达情况。综合分析ywhae基因沉默后可能涉及结肠癌细胞增殖的基因及分子通路。结果:TCGA数据分析显示,ywhae m RNA在结肠癌样本中表达高于癌旁正常样本(Pywhae蛋白在结肠癌样本中表达高于配对癌旁正常样本(Pywhae沉默组(KD组)SW620细胞ywhae m RNA表达降低97.90%(Pywhae蛋白表达降低87.87%(Pywhae表达无明显差异。相比NC组,MTT检测结果显示KD组细胞增殖速度明显降低,24 h抑制效率为23.88%(Pywhae在结肠癌组织中表达增高,与结肠癌TNM分期、淋巴结转移及患者生存率相关,可能是结肠癌预后不良的标志;沉默ywhae基因表达能抑制结肠癌细胞增殖;沉默ywhae基因可能影响结肠癌相关基因的表达;ywhae基因沉默,能捕获结肠癌细胞周期在G1期,促进结肠癌细胞凋亡,可能与其上调BIRC3、FOS基因表达,下调CDK6基因表达有关。

关键词： ywhae 结肠癌细胞基因芯片差异基因

ywhae和CDC6表达与结直肠癌临床病理特征关系的分析

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YWHAE和CDC6表达与结直肠癌临床病理特征关系的分析

作者：陈鼎香海南医学院

学位级别：硕士

目的:探讨结直肠癌组织中ywhae及CDC6的表达,分析两者的表达与患者的临床病理特征及预后的关系,并进一步分析两者的相关性。方法:通过癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)下载结直肠癌患者ywhae mRNA和CDC6 mRNA的表达谱及临... 详细信息

目的:探讨结直肠癌组织中ywhae及CDC6的表达,分析两者的表达与患者的临床病理特征及预后的关系,并进一步分析两者的相关性。方法:通过癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)下载结直肠癌患者ywhae mRNA和CDC6 mRNA的表达谱及临床数据集,分析两者的表达与结直肠癌患者临床病理特征、预后的关系,并分析两者的相关性;通过cBio Portal网站分别获取CDC6、ywhae的共表达基因,进一步对共表达基因进行富集分析。收集本院结直肠癌患者的石蜡组织标本并制作成组织芯片,采用RNAscope技术检测ywhae mRNA和CDC6 mRNA的表达情况,分析其表达与临床病理特征的关系,并分析两者的相关性;采用免疫组织化学方法检测ywhae、CDC6在结直肠癌组织的表达情况,使用卡方检验分析两者在结直肠癌组织的表达与临床病理特征的关系,Kaplan-Meier法进行单因素分析并绘制生存曲线,生存率比较采用Log-rank检验,单因素及多因素分析用COX风险比例回归模型。结果:1.生物信息学分析结果显示:ywhae mRNA在结直肠癌组织表达水平的中位数(423.7)与正常组织表达水平的中位数(330.05)比较差异具有统计学意义(Pywhae mRNA与CDC6 mRNA在结直肠癌的表达呈正相关(Pywhae、CDC6共表达基因富集分析结果显示,两者均参与细胞周期等生物学过程。***检测结果显示:ywhae mRNA和CDC6 mRNA在结直肠癌组织的表达显著高于正常组织(Pywhae蛋白在正常组织中高表达率为24.83%,在癌组织高表达率为73.17%,两组间比较差异具有统计学意义(Pywhae蛋白和CDC6蛋白高表达组的平均生存期明显低于低表达组,差异有统计学意义(P<0.05),与患者预后不良有关。结论:*** mRNA及CDC6 mRNA在结直肠癌组织中高表达,与细胞周期等生物学过程有关,两者可能是结直肠癌发生早期阶段的一个分子事件。***蛋白和CDC6蛋白在结直肠癌组织中均高表达,与淋巴结转移、病理分期及不良预后有关,两者有望成为结直肠癌患者预后不良的生物学标记物及治疗的潜在靶点。***及CDC6在结直肠癌组织的表达呈正相关,两者可能共同参与结直肠癌的发生、进展过程,为进一步研究两者相关的分子机制提供一定的理论基础。

关键词：结直肠癌 ywhae CDC6 临床病理特征

ERK/MAPK通路在CagA-ywhae互作引起细胞效应中的作用

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ERK/MAPK通路在CagA-YWHAE互作引起细胞效应中的作用

作者：易庆凤福建医科大学

学位级别：硕士

目的:本课题将探讨CagA是否通过与ywhae的相互作用激活MAPK通路及对细胞效应的影响,进一步完善CagA在胃癌中作用机制研究,为***相关胃癌的防治提供新思路。方法:1 CagA重组腺病毒感染细胞效率的确定Ad-CagA、Ad-GFP分别以不同浓度感染AG... 详细信息

目的:本课题将探讨CagA是否通过与ywhae的相互作用激活MAPK通路及对细胞效应的影响,进一步完善CagA在胃癌中作用机制研究,为***相关胃癌的防治提供新思路。方法:1 CagA重组腺病毒感染细胞效率的确定Ad-CagA、Ad-GFP分别以不同浓度感染AGS细胞,确定最适MOI值。将Ad-GFP、Ad-CagA分别感染ywhae低表达(AGS-siywhae,本室保存的ywhae低表达细胞株)和ywhae过表达的AGS细胞(AGS-myc-ywhae,使用本室构建的pcDNA3.1-myc-ywhae质粒转染AGS细胞),Western blot检测CagA蛋白的表达效果。2 CagA-ywhae互作对MAPK通路激活的确定MAPK信号通路主要包括:ERK、p38、JNK通路2.1 Western blot检测CagA-ywhae互作对MAPK通路激活的影响将Ad-GFP、Ad-CagA分别感染ywhae低表达和过表达的AGS细胞,Western-blot检测细胞pERK、ERK、pp38、p38、pJNK、JNK表达水平。2.2 U0126(ERK上游抑制剂)验证CagA-ywhae互作可激活ERK/MAPK通路将Ad-GFP、Ad-CagA分别感染ywhae低表达和过表达细胞,再使用U0126处理细胞,Western blot检测细胞pERK、ERK表达水平。3 CagA-ywhae互作激活ERK/MAPK通路对细胞效应的影响3.1 CagA-ywhae互作抑制细胞凋亡依赖于ERK/MAPK通路***菌株NCTC11637及NCTC11637△cagA分别感染ywhae低表达细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡。U0126预处理ywhae过表达细胞,NCTC11637及NCTC11637△cagA分别感染上述细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡。3.2 CagA-ywhae互作诱导细胞表达IL-8依赖于ERK/MAPK通路课题组已初步验证CagA-ywhae互作诱导细胞IL-8的表达;U0126预处理ywhae过表达细胞,NCTC11637及NCTC11637△cagA分别感染上述细胞,ELISA检测细胞IL-8的表达。结果:1确定CagA腺病毒感染细胞的效率成功获得扩增至第四代的Ad-CagA重组腺病毒,MOI=50时感染效率最佳;Western blot检测结果显示,在ywhae低表达细胞和ywhae过表达细胞CagA蛋白均可表达。2 CagA-ywhae互作激活ERK/MAPK通路Ad-CagA感染的AGS-siNC细胞ERK磷酸化水平显著高于Ad-GFP感染的细胞(P﹤0.05);Ad-CagA感染的AGS-siywhae细胞ERK磷酸化水平与AdGFP感染的细胞比无显著差异;Ad-CagA感染的AGS-siywhae细胞ERK磷酸化水平比感染的AGS-siNC细胞显著下降(P﹤0.05)。Ad-CagA与Ad-GFP感染ywhae过表达细胞得到相似结果。提示,CagA-ywhae互作激活ERK/MAPK通路。Ad-CagA感染的AGS-siNC细胞,U0126处理组ERK磷酸化水平比DMSO处理组下降显著(P﹤0.05);Ad-CagA感染的AGS-siywhae细胞,U0126处理组ERK磷酸化水平与DMSO处理组比无显著性。Ad-CagA与Ad-GFP感染ywhae过表达细胞得到相似结果。证明,CagA-ywhae互作可激活ERK/MAPK通路。Ad-CagA感染的AGS-siNC细胞和AGS-siywhae细胞,p38磷酸化水平都显著高于Ad-GFP感染的细胞(P﹤0.05);但Ad-CagA感染的AGS-siywhae细胞p38磷酸化水平与感染的AGS-siNC细胞比没有显著改变。Ad-CagA与AdGFP感染ywhae过表达细胞得到相似结果。表明,CagA可以激活p38/MAPK通路,但并非由ywhae介导。Ad-CagA感染的AGS-siNC细胞和AGS-siywhae细胞,JNK磷酸化水平都显著高于Ad-GFP感染的细胞(P﹤0.05);但Ad-CagA感染的AGS-siywhae细胞JNK磷酸化水平与感染的AGS-siNC细胞比没有显著改变。Ad-CagA与AdGFP感染ywhae过表达细胞得到相似结果。表明,CagA可以激活JNK/MAPK通路,但并非由ywhae介导。3 CagA-ywhae互作激活ERK/MAPK通路对细胞效应的影响3.1 CagA-ywhae互作抑制细胞凋亡依赖于ERK/MAPK通路NCTC11637感染的AGS-siNC细胞细胞凋亡率显著低于NCTC11637△cagA感染的细胞(P﹤0.05);NCTC11637感染的AGS-siywhae细胞细胞凋亡率与NC

关键词： CagA ywhae 相互作用 ERK 凋亡 IL-8

关于ywhae在miR-21的分泌及结直肠癌发生发展中作用的研究

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关于YWHAE在miR-21的分泌及结直肠癌发生发展中作用的研究

作者：徐彬南京大学

学位级别：硕士

外泌体miRNA可以介导细胞间通讯,通过被受体细胞摄取,在受体细胞中调节靶基因并发挥生物学功能。肿瘤细胞的外泌体可以调控的癌症的发生发展。大量研究表明,外泌体及其亲代细胞中的miRNA表达谱中miRNA的种类和丰度都不一样,这表明miRNA... 详细信息

外泌体miRNA可以介导细胞间通讯,通过被受体细胞摄取,在受体细胞中调节靶基因并发挥生物学功能。肿瘤细胞的外泌体可以调控的癌症的发生发展。大量研究表明,外泌体及其亲代细胞中的miRNA表达谱中miRNA的种类和丰度都不一样,这表明miRNA选择性地被分选到外泌体中。尽管有几项研究已经揭示了某些特定的miRNA分选的机制,但需要更多的研究来全面地探究外泌体中miRNA的分选机制。基于CRISPR/Cas9技术的人类基因组高通量筛选目前已被广泛应用于各个领域。基于这种技术,研究人员能够更全面地探索基因的功能并了解更多的生物发生过程。目前,全基因组功能基因筛查是最为全面的基因检测及验证手段之一,且已经应用于高通量筛选编码基因、启动子及增强子、长链非编码RNA序列、以及多功能干细胞活力的基因、癌症基因、以及一些肿瘤治疗过程的耐药基因。本文中,我们采取全基因组筛选工具—Genome-wide screening探索研究肿瘤外泌体miRNA的分选机制。我们发现miR-21在肿瘤外泌体中高表达,故我们以miR-21为切入点,探究肿瘤外泌体中miR-21分选的机制。用CRISPR-Cas9全基因组敲除文库感染细胞并培养单个的单克隆细胞株,选择外泌体miR-21表达降低的细胞株进行进一步研究。我们的筛选原则是:每株细胞中有且只有一条g RNA进入并整合到基因组上且外泌体中miRNA的表达水平有变化。文库筛选结果显示:符合标准的细胞一共60株,其中外泌体水平miR-21升高的细胞8株,miR-21表达含量降低的12株,miRNA-21表达含量没有差异性的一共40株。我们将这些细胞株提取基因组并进行二代测序,根据测序结果比对g RNA基因文库的序列,选择影响外泌体中miR-21表达含量下降的基因。在这些基因中我们选择其中6个细胞株,并通过生物学实验验证我们前面的筛选结果。在6个细胞株中,我们选择ywhae基因,探究它对于外泌体中miR-21的分泌的影响。ywhae影响外泌体中miR-21的分泌,我们猜测它可是通过影响外泌体的生成而影响外泌体中miR-21的分泌。为探究ywhae对于外泌体生成的影响,我们构建了稳转细胞株He La 和He La,并通过NTA发现ywhae不影响外泌体分泌的粒径大小,但影响相同数量细胞生成外泌体的数量。Western blot和免疫荧光结果发现ywhae影响外泌体标志性蛋白的表达。我们猜测ywhae可能通过影响外泌体跨膜蛋白的方式影响外泌体的分泌。为探究ywhae在体外的功能,我们检测了ywhae在各种细胞系表达情况,最终选择ywhae更高表达的结直肠癌细胞系—SW620,然后构建了稳转细胞株SW620,SW620,SW620,分别检测了基因ywhae对于SW620细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响。最终结果显示:、在结直肠癌细胞系和结直肠癌病人样本中,ywhae蛋白高表达,并且在SW620细胞中,ywhae扮演着一个原癌基因的功能和作用,促进了结直肠癌的发生发展。

关键词：外泌体miRNA miR-21 ywhae CRISPR/Cas9高通量筛选技术

CagA与ywhae互作激活NF-κB的途径及细胞侵袭转移效应

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CagA与YWHAE互作激活NF-κB的途径及细胞侵袭转移效应

作者：吕玉华福建医科大学

学位级别：硕士

目的:细胞毒素相关蛋白A(cytotoxin-associated antigen A,CagA)是由幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,***)分泌的重要毒力蛋白,在胃癌的致病中起重要作用。大量研究表明,CagA可以和宿主细胞内的多种蛋白相互作用,激活多条信号通路,对细... 详细信息

目的:细胞毒素相关蛋白A(cytotoxin-associated antigen A,CagA)是由幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,***)分泌的重要毒力蛋白,在胃癌的致病中起重要作用。大量研究表明,CagA可以和宿主细胞内的多种蛋白相互作用,激活多条信号通路,对细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭转移等生物学行为产生影响。本课题组在前期的研究工作中证实CagA可以和胃黏膜细胞蛋白ywhae相互作用,激活NF-κB,但是具体的激活途径尚未阐明。因此,本研究在此基础上,拟进一步研究CagA与ywhae互作激活NF-κB的具体途径,并深入探讨其引起的细胞侵袭转移效应,旨在进一步阐明CagA的致病机制。方法:1构建腺病毒Ad-CagA首先构建重组质粒pMD19-T-CagA,继而构建重组穿梭质粒pShuttleIRES-hrGFP-CagA,进一步利用同源重组的原理,构建重组腺病毒质粒pAdCagA。转染293A细胞,进行病毒包装,获得腺病毒Ad-CagA。Ad-CagA和Ad-GFP分别以不同浓度感染AGS细胞,荧光显微镜观察荧光的表达情况,确定最适感染的MOI值,用Western blot检测CagA蛋白的表达效果。2确定CagA与ywhae相互作用对细胞NF-κB的激活途径将Ad-GFP和Ad-CagA分别感染AGS-siNC细胞,用不同浓度的TNF-α刺激,Western blot检测NF-κB经典途径中p65和p50蛋白在胞质、胞核表达量的变化,确定TNF-α刺激的最佳浓度。定量检测NF-κB经典途径的活化,将Ad-GFP和Ad-CagA分别感染AGSsiNC和AGS-siYWHA细胞,TNF-α以最佳浓度处理后,Western blot检测p65和p50蛋白在胞质、胞核表达量的变化以及p65的磷酸化水平;免疫荧光染色检测p65核转位。3确定CagA与ywhae相互作用引起的细胞侵袭转移效应感染腺病毒后的细胞接种至Transwell小室(检测侵袭时提前2h在小室中铺胶),结晶紫染色,镜下观察穿过PET膜的细胞数,以检测细胞的迁移和侵袭数量;用Western blot检测上皮间质转化相关基因β-catenin、Vimentin、Snail、Slug的表达。4统计学分析采用SPSS 22.0进行配对样本T检验进行数据分析。结果:1成功构建Ad-CagA重组腺病毒腺病毒最佳感染效率为Ad-CagA 50(MOI值),Ad-GFP 50(MOI值),Western blot可检测到CagA蛋白的表达。2 CagA与ywhae相互作用激活NF-κB的经典途径0 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml的TNF-α刺激细胞后,Ad-CagA感染组与AdGFP感染组相比,诱导p65核/质比分别升高1.274±0.197、2.585±1.013、1.493±0.322倍,诱导p50核/质比分别升高1.793±0.403、1.950±0.115、1.093±0.524倍,1 ng/ml组的差异均具有统计学意义(Pywhae细胞中,当ywhae表达受到抑制,Ad-CagA感染组与AdGFP感染组相比可诱导p65核/质比、p50核/质比升高,促进p65的磷酸化,增多p65核转位的数量(Pywhae相互作用促进NF-κB经典途径的活化。3 CagA与ywhae相互作用对细胞侵袭转移的影响Transwell结果显示,在AGS-siNC细胞中,Ad-CagA感染组细胞迁移、侵袭数量(286.3±67.03,528.3±130.4)较Ad-GFP感染组(168.3±52.34,242.3±48.81)显著增多(Pywhae细胞中,当ywhae表达受到抑制,Ad-CagA感染组细胞迁移、侵袭数量(171.87±59.68,355.07±103.54)较Ad-GFP感染组(126.8±65.04,187.13±39.5)增多(Pywhae相互作用促进细胞的迁移、侵袭。Western blot结果显示,在AGS-siNC细胞

关键词：幽门螺杆菌 CagA ywhae 相互作用 NF-κB 侵袭转移