YWHAE靶向AKT途径调控结肠癌细胞EMT的机制研究

作     者：刘思思 

作者单位：海南医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：翁阳

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：YWHAE 结肠癌 RNA干扰 细胞转移 EMT 

摘      要：背景:IARC（International Agency for Research on Cancer,世界卫生组织国际癌症研究机构）发布的2020年全球最新癌症负担数据显示,结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）在中国和全球的发病率分别位居第2和第3;死亡率分别位居第5和第2,侵袭、转移、复发是患者常见的死亡原因。先前的研究表明,酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白（Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein,YWHAE）在多种肿瘤中高表达,包括CRC,通过结合磷酸丝氨酸介导的信号转导相关的蛋白质,参与调节多种细胞功能,如细胞周期、细胞凋亡、扩散迁移等。高表达的YWHAE与更高的CRC转移风险和较低的患者生存率显著相关。目的:探讨YWHAE表达与结肠癌上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的相关性及可能涉及的分子通路。方法:构建慢病毒包装的YWHAE短发夹RNA（LV-YWHAE-shRNA）并感染结肠癌SW620细胞。实验分为YWHAE干扰组（KD组）、阴性转染对照组（NC组）、未转染组（CON组）。应用蛋白质印迹（Western blot）、RT-q PCR及免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）技术,检测结肠癌细胞在感染前后YWHAE基因表达情况;细胞克隆形成试验比较感染前后结肠癌细胞克隆形成的能力变化;MTT法检测感染前后结肠癌SW620细胞增殖能力变化情况;应用Western blot、IHC检测EMT标志物及AKT-β-catenin、ERK1/2等相关通路蛋白,分析YWHAE基因调控结肠癌细胞EMT可能涉及的信号通路。结果:LV-YWHAE-shRNA成功感染结肠癌SW620细胞,感染率90%;q PCR及Western blot结果显示,相对于NC组,KD组SW620细胞YWHAE抑制效率为75%,差异有显著性（P0.05）;相对于CON组,NC组表达无明显差异（P0.05）。MTT实验结果显示KD组、NC组、CON组96h增长倍数分别为1.51、3.04、3.11,KD组细胞的增长速率比NC组下降了50.3%,差异有显著统计学意义（P0.01）;相对于CON组,NC组无明显差异（P0.05）。细胞克隆形成试验显示,CON组、NC组和KD组的细胞克隆数分别是1039、1131、191,与NC组相比,KD组细胞克隆数下降了83.1%,差异具有统计学意义（P0.05）;CON组、NC组和KD组的细胞克隆面积分别是94.37、93.58、74.19,与NC组相比,KD组细胞克隆面积下降了20.7%,差异具有统计学意义（P0.05）;相对于CON组,细胞克隆数和克隆面积在NC组中无明显差异（P0.05）。Western blot结果显示,与NC组相比,KD组E-cadherin的蛋白表达上调了41.1%,差异具有统计学意义（P0.05）;与NC组相比,KD组Vimentin的蛋白表达下调了68.8%,差异具有统计学意义（P0.05）;相对于CON组,NC组无明显差异（P0.05）。IHC检测结果示:E-cadherin在KD组、NC组、CON组的阳性表达率分别为81.2%、30.6%、50.8%,与NC组细胞相比,KD组细胞E-cadherin的阳性细胞表达率上调了62.3%,差异具有统计学意义（P0.05）;Vimentin在KD组、NC组、CON组的阳性表达率分别为1.4%、71.2%、70.4%,与NC组相比,Vimentin在KD组的阳性细胞表达率降低了98.0%,差异具有统计学意义（P0.05）,相对于CON组,E-cadherin、Vimentin在NC组中的表达无明显差异（P0.05）。Western blot结果显示,与NC组相比,KD组AKT、p AKT的蛋白表达分别下调了75.0%、77.8%,差异都具有统计学意义（P0.05）,相对于CON组,AKT、p AKT在NC组中的表达无明显差异（P0.05）;ERK、p ERK的蛋白表达在KD组、NC组、CON组的表达无明显差异（P0.05）;IHC结果显示,AKT在KD组、NC组、CON组的阳性表达率分别为30.2%、94.2%、61.5%,与NC组相比,AKT在KD组的表达降低了67.9%,差异具有统计学意义（P0.05）;p AKT在KD组、NC组、CON组的阳性表达率分别为60.4%、95.5%、96.1%,与NC组相比,p AKT在KD组的阳性表达率降低了36.8%,差异具有统计学意义（P0.05）;β-c