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褪黑素逆转氧化应激对牙周膜干细胞衰老、干性的影响及其机制研究

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褪黑素逆转氧化应激对牙周膜干细胞衰老、干性的影响及其机制研究

作者：冯笑梅山东大学

学位级别：硕士

背景与目的:人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)长期体外传代培养会发生复制性衰老,促进胞内积聚过量活性氧(reactive oxygen species,ROS)自由基损伤干细胞功能;外源性ROS也可诱发细胞氧化应激性早衰,两... 详细信息

背景与目的:人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)长期体外传代培养会发生复制性衰老,促进胞内积聚过量活性氧(reactive oxygen species,ROS)自由基损伤干细胞功能;外源性ROS也可诱发细胞氧化应激性早衰,两种类型衰老呈现相同特征,均严重影响组织工程效率。研究证明褪黑素(melatonin,MT)是一种强大的自由基清除剂,可发挥延缓骨髓间充质干细胞衰老的作用,但其能否在氧化应激条件下延缓hPDLSCs衰老、维持其干性特性尚无定论。本实验旨在观测过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)诱导的氧化应激对hPDLSCs凋亡、周期、衰老、干性等生物学行为的影响,探索MT对上述效应是否发挥逆转作用,并探究可能的分子机制。材料与方法:1、分离、培养、鉴定hPDLSCs:组织块法获取、培养原代hPDLSCs,对表面标志物进行流式鉴定;成骨、成脂向诱导后,检测细胞多向分化潜能。2、构建氧化应激细胞模型:梯度浓度H202处理hPDLSCs,CCK-8检验细胞活性,镜下观察形态变化;对细胞凋亡情况及胞内ROS水平进行流式检测;荧光显微镜下观测ROS(+)细胞比例。3、氧化应激对hPDLSCs衰老、干性的影响:qRT-PCR、Western blot检测细胞衰老、干性相关基因的表达变化;对细胞衰老表观变化进行衰老相关β半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase,SA-β-Gal)染色检测;成骨诱导后染色确定实验组细胞的成骨分化是否削弱;最终确定H202的后续工作浓度。4、MT对氧化应激条件下hPDLSCs生物学行为的保护作用:镜下观测结合CCK-8检测MT对hPDLSCs增殖活性的影响,流式细胞术检测细胞周期分布;评估胞内氧化应激水平;检测细胞衰老、干性相关指标的表达变化,判断成骨分化能力是否恢复。5、yap介导MT发挥上述调控作用:研究全程检测yap表达水平;并在上述研究的基础上加入yap蛋白抑制剂维替泊芬(Verteporfin,VP),拮抗yap表达后检测衰老、干性相关指标的变化。结果:1、组织块贴壁法获取、培养了原代hPDLSCs,其表面抗原表达形式与间充质干细胞一致,细胞具有多向分化潜能。2、H2O2处理hPDLSCs后,细胞增殖活性与H2O2浓度成反比,镜下可见高浓度时部分细胞凋亡,余留细胞体积变大、呈成纤维细胞样。流式分析显示细胞凋亡率与H2O2浓度成正比。3、流式细胞术显示hPDLSCs内ROS含量及荧光显微镜下ROS(+)细胞荧光强度、所占比例随H2O2浓度的升高而升高,证明氧化应激细胞模型已成功构建,胞内氧化应激水平与H2O2浓度成正比。4、细胞衰老相关基因P21的表达水平随氧化应激水平的增强而升高,而p-RB蛋白及细胞干性相关基因C-MYC、OCT-4、NANOG的表达呈现相反趋势,SA-β-Gal染色佐证细胞发生早衰。碱性磷酸酶、茜素红染色显示,氧化应激条件下hPDLSCs成骨分化水平急剧下降。5、MT对hPDLSCs增殖有积极影响,荧光显微镜观测、流式分析显示胞内氧化应激水平显著下降。6、MT缓解早衰细胞衰老特征,恢复其干性特性。流式分析得出MT能减少氧化应激诱导的细胞周期在G0/G1期的停滞。7、氧化应激使yap蛋白水平下降,而MT恢复被抑制的yap蛋白水平。8、低浓度的yap抑制剂VP对hPDLSCs增殖无明显影响,H2O2及VP对细胞yap蛋白表达的抑制具有叠加性。VP拮抗yap后,即使MT在同时作用,细胞仍然出现衰老水平上升、干性特性下降的现象。证明yap介导MT在氧化应激条件下延缓hPDLSCs衰老,维持其干性。结论:H2O2诱导的氧化应激使hPDLSCs早衰,降低其干性,并对细胞增殖、周期、成骨向分化发挥负向调控作用。但MT能有效缓解甚至逆转上述效应,yap蛋白在其中发挥重要作用。

关键词：褪黑素氧化应激细胞衰老细胞干性 yap蛋白

yap调控糖尿病心肌病心脏成纤维细胞的活化及其作用机制

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YAP调控糖尿病心肌病心脏成纤维细胞的活化及其作用机制

作者：彭文艺西南交通大学

学位级别：硕士

背景:糖尿病心肌病是指糖尿病患者在没有其他可引起心肌病变的疾病情况下发生心脏结构和功能的改变,最终可发展为严重的舒张性和/或收缩性心力衰竭。研究表明,糖尿病心肌病作为糖尿病常见的严重并发症之一,是导致糖尿病患者高致死率和... 详细信息

背景:糖尿病心肌病是指糖尿病患者在没有其他可引起心肌病变的疾病情况下发生心脏结构和功能的改变,最终可发展为严重的舒张性和/或收缩性心力衰竭。研究表明,糖尿病心肌病作为糖尿病常见的严重并发症之一,是导致糖尿病患者高致死率和高致残率的重要原因之一。心肌肥大、间质纤维化、心脏小血管基底膜增厚等为糖尿病心肌病的主要病理变化,其中心脏纤维化可引起心室重塑,对心力衰竭的发生发展和预后起到了重要作用,然而,目前尚无有效的抗纤维化治疗策略。研究表明,心脏成纤维细胞的增殖与转分化心脏肌成纤维细胞,是糖尿病心脏纤维化的主要原因之一。近年来,越来越多的研究表明,YES相关蛋白(YES-associated protein,yap)在心血管的发生、发育中发挥着重要的调节作用。除此之外,yap蛋白也可以在不同心血管疾病中发挥一定的调控作用。心脏特异性yap失活的小鼠发生心肌梗死后,由于缺乏纤维化应答而心肌损伤加重,相反过表达yap可刺激心肌梗死小鼠心肌细胞再生,缩小心肌梗死范围,改善预后。另外,yap亦参与调控动脉损伤或者动脉粥样硬化等平滑肌相关疾病的病理过程。动脉损伤后血管平滑肌细胞的yap表达水平上调,导致平滑肌细胞的表型由收缩型转向分泌型,促进平滑肌细胞的增殖、转移;抑制平滑肌细胞yap基因表达,可阻断动脉损伤后血管平滑肌细胞的增殖、迁移,改善血管内膜增生。上述研究表明,yap对于心脏的心肌细胞、血管平滑肌细胞均具有促增殖作用,参与调控心肌梗死、动脉粥样硬化等心血管疾病。然而,目前yap在糖尿病心肌病中研究较少,尚未见有关yap与糖尿病心肌病心肌纤维化方面的研究报道。目的:本文旨在研究yap在糖尿病心肌病心脏纤维化中的作用机制。方法:在动物水平,采用高糖高脂饲料联合小剂量STZ腹腔注射构建II型糖尿病小鼠模型。天狼星红及Masson染色检测心脏纤维化进程;免疫组织化学染色检测纤维化标志物I型胶原蛋白(Type I collagen,collagen I)、III型胶原蛋白(Type III collagen,collagen III)以及yap蛋白表达变化;Western blot检测包括平滑肌α肌动蛋白(Smooth muscleα-actin,α-SMA)、Collagen I、Collagen III、以及yap蛋白及其经典下游分子结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)等多种蛋白表达水平的变化。在细胞水平,分离培养1-3 d龄SD大鼠心脏成纤维细胞(Cardiac fibroblasts,CFs)细胞,用40 mmol/L D-Glucose诱导CFs细胞,构建DCM细胞模型,24h后检测细胞yap、α-SMA、collagen I、collagen III、CTGF蛋白相对表达水平。取原代CFs细胞,设置NG(5.5 mmol/L D-Glucose)组、HG(40 mmol/L D-Glucose)组、NG+VP(NG+Verteporfin)组、HG+VP组。VP为yap抑制剂,可抑制yap与TEAD结合,剂量为0.5μmol/L,处理CFs细胞24h。采用Vimentin免疫荧光法鉴定CFs;Ki-67免疫荧光染色检测各组细胞增殖情况;Western blot法检测各组yap、α-SMA、collagen I、collagen III、CTGF蛋白表达水平。结果:体内研究结果显示:(1)糖尿病组小鼠心脏组织中yap蛋白表达水平增加、心脏纤维化程度和胶原沉积加剧;(2)糖尿病组小鼠心脏组织中α-SMA表达增加,提示CFs向心脏肌成纤维细胞(Cardiac myofibroblasts,CMFs)的转分化参与糖尿病心肌病纤维化过程。体外研究结果显示:(1)高浓度葡萄糖可以刺激CFs向CMFs转分化;(2)高浓度葡萄糖可以刺激CFs中yap表达水平增加,抑制yap同TEAD作用可抑制高糖介导的CFs转分化;(3)在CFs中,CTGF是yap的下游分子靶点,抑制yap可下调CTGF表达来抑制HG诱导的CFs转分化进程。结论:本研究发现DCM高糖损伤后CFs增殖和转分化的调节新机制:yap是参与介导CFs转分化和调节DCM心脏纤维化反应的重要分子;抑制yap同TEAD,可下调CTGF表达,降低高糖环境促进CFs增殖和转分化为CMFs的作用。

关键词： yap蛋白糖尿病心肌病心脏纤维化心脏成纤维细胞心脏肌成纤维细胞

间隙流在牙龈成纤维细胞活化和重排中的作用及机制研究

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间隙流在牙龈成纤维细胞活化和重排中的作用及机制研究

作者：刘子瑶大连医科大学

学位级别：硕士

研究背景:牙龈成纤维细胞（Gingival fibroblasts,GFs）作为一种修复和再生能力极强的牙龈结缔组织来源的细胞,已被研究证实具有多向分化潜能。在口腔组织损伤后,GFs活化并迁移到伤口部位,通过促进细胞外基质（Extracellular matrix,EC... 详细信息

研究背景:牙龈成纤维细胞（Gingival fibroblasts,GFs）作为一种修复和再生能力极强的牙龈结缔组织来源的细胞,已被研究证实具有多向分化潜能。在口腔组织损伤后,GFs活化并迁移到伤口部位,通过促进细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）蛋白的合成以闭合伤口。然而,ECM成分的过度积累将导致口腔内瘢痕或病理性纤维化的形成。目前关于影响GFs活化的因素和分子机制尚未完全阐明。近年来,有研究报道炎症、血管重塑导致的血管通透性增加或微淋巴管淋巴流量增加等相伴随的间隙流动（Interstitial flow,IF）是体内微环境物理因素—流体剪切力的重要组成部分,其为细胞的生长提供了一个特殊的信号传递环境和充足的营养供应。在组织纤维化病变的过程中,IF可刺激肺、肝脏和皮肤等组织中的成纤维细胞活化、过度增殖并驱动纤维化进展。另有研究报道,yap蛋白（Yes-associated protein,yap）在多种力学相关的信号转导中都具有重要作用,它作为Hippo信号通路的核心成分,是一种基质敏感的转录调节因子。力学因素中的基质硬度可通过F-actin-yap调控成纤维细胞的活化。然而,IF及yap在GFs活化中的作用及机制却鲜有报道。课题组前期已经建立并优化了在微流控芯片中操控IF对肿瘤细胞及成纤维细胞进行灌流培养的方法,为本研究提供了有力的实验条件和平台。研究目的:在课题组前期基础之上,本课题旨在探究IF对GFs活化和重排中的作用及其分子机制,并检验yap在IF引起GFs活化中的表达情况。材料与方法:采用组织爬片法从健康牙龈组织中提取GFs并利用细胞免疫荧光染色方法鉴定其表达的生物学标志物。本实验采用的微流控芯片由五个通道组成,分别命名为C1、C2、C3、C4、C5。将C2、C4通道作为液体的灌流通道,在C3通道进行细胞的三维培养,以此来模拟细胞体内生存的微环境。然后,对IF的流速进行测定,通过调控C2、C4通道培养液的液面差来间接控制流经C3通道的液体流速。接下来,将右旋糖苷（70 k Da）加入芯片的C2通道,每隔10 s进行拍照记录,测得不同IF下的流速。分别对培养1天及5天的芯片进行鬼笔环肽染色（Phalloidin）及成纤维特异性蛋白-1（Fibroblast specific protein-1,FSP-1）、成纤维细胞活化蛋白（Fibroblast activation protein,FAP）、α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle actin,α-SMA）的细胞免疫荧光染色,并通过倒置荧光显微镜观察芯片内GFs的排列及活化情况。随后通过细胞免疫荧光染色方法鉴定IF及静止状态下GFs中yap的表达情况,使用共聚焦显微镜采集结果。最后,提取微流控芯片内GFs的RNA进行测序并开展深入的生物学信息分析和数据挖掘,同时对富集分析的差异基因进行m RNA水平上的初步验证。结果:1.牙龈组织中提取GFs并进行传代培养,培养到三或四代后进行细胞免疫荧光染色鉴定。结果显示,广谱角蛋白（pan-Cytokeratin,pan-CK）表达为阴性,证明了我们所提取的细胞为非上皮源性;波形蛋白（Vimentin,VIM）、FSP-1表达阳性,证明其为间质来源的细胞;FAP、α-SMA表达均为阴性,证明我们成功提取到了GFs。2.右旋糖苷在（120μL-120μL、120μL-100μL、120μL-80μL、120μL-40μL）产生的静水压力差下从C2扩散至C4通道的时间分别为0 min、20 min、5 min及2 min。C3通道的芯片宽度为1000μm,每隔10 s进行拍照,通过计算可知IF流速分别为0μm/s、0.83μm/s、3.7μm/s、8.33μm/s。IF在正常组织中的流速约为0.1-1μm/s。因此,我们分别用0μm/s、0.83μm/s来模拟静止状态及生理状态下的流速;用3.7μm/s、8.33μm/s来模拟病理状态下的流速。随后我们对芯片内培养的细胞进行免疫荧光染色,结果显示:当GFs在芯片内培养1天时,IF及静止状态下,GFs中FSP-1表达阳性,FAP、α-SMA表达均为阴性,且细胞排列方向相对散乱。当GFs在芯片内培养5天时,与静止状态及生理状态下相比,病理状态下GFs中FSP-1表达阳性,FAP、α-SMA部分表达阳性,且IF诱导细胞排列方向趋于一致。3.我们对培养5天的GFs进行yap免疫荧光染色,共聚焦结果显示,与静止状态相比,IF存在时,yap在细胞核中高度表达。随后我们在芯片培养时加入Factin抑制剂Latrunculin A,并进行yap的免疫荧光染色,结果显示IF及静止状态下,均未见yap在GFs细胞核中高度表达。4.利用RNA-Seq和生物信息学分

关键词：牙龈成纤维细胞纤维化细胞活化 yap蛋白

心肌肥大相关蛋白yap在大鼠糖尿病心肌病中的表达

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蚌埠医学院学报 2018年第10期43卷 1355-1358页

作者：叶红伟张蔚屏胡俊锋于影方婷婷杨丽娟高琴蚌埠医学院生理学教研室安徽蚌埠233030 蚌埠医学院第一附属医院呼吸与危重症监护科安徽蚌埠233004

目的:观察Hippo信号通路效应蛋白yap在糖尿病大鼠心肌肥大中的改变,分析可能的作用机制。方法:健康雄性SD大鼠随机分为2组,每组6只。正常对照组:大鼠正常饮水饮食喂养12周;糖尿病心肌病组:大鼠腹腔注射STZ(55 mg/kg)复制糖尿病模型,以... 详细信息

目的:观察Hippo信号通路效应蛋白yap在糖尿病大鼠心肌肥大中的改变,分析可能的作用机制。方法:健康雄性SD大鼠随机分为2组,每组6只。正常对照组:大鼠正常饮水饮食喂养12周;糖尿病心肌病组:大鼠腹腔注射STZ(55 mg/kg)复制糖尿病模型,以血糖≥16.7 mmo1/L,持续1周确定造模成功,继续饲养12周。测定大鼠空腹血糖水平和体质量;心室内插管检测左心室动力学变化,称量心脏质量计算心体比;荧光定量PCR检测心肌肥大相关基因心房钠尿肽和脑利钠肽mRNA表达,Western blot法检测yap和p-yap蛋白表达改变。结果:与正常对照组相比,糖尿病组大鼠心体比增加,左心室舒张末压增高,左心室发展压、左心室内压最大上升和下降速率及左心室做功均降低;心肌肥大相关基因心房钠尿肽和脑利钠肽mRNA表达增加;yap蛋白表达增加,p-yap/yap比值降低(P蛋白yap的表达,降低其磷酸化水平有关。

关键词：糖尿病心肌肥大 Hippo信号通路 yap蛋白

Hippo-yap通路参与NaAsO 2对PC12细胞周期及细胞凋亡的影响

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中国药理学通报 2023年第12期39卷 2325-2330页

作者：吴松顾丹张小龙康文润刘宇李成王宏健王东艳潘际刚贵州医科大学基础医学院生理学教研室贵州贵阳550025 贵州医科大学基础医学院机能实验室贵州贵阳550025

目的探讨NaAsO 2对PC12细胞yap蛋白核质分布的影响及Hippo-yap通路在NaAsO 2影响细胞周期及细胞凋亡中的作用。方法以PC12细胞作为研究对象,利用核质分离及免疫荧光观察NaAsO 2对yap蛋白核质分布的影响。再将细胞分为control组、NaAsO ... 详细信息

目的探讨NaAsO 2对PC12细胞yap蛋白核质分布的影响及Hippo-yap通路在NaAsO 2影响细胞周期及细胞凋亡中的作用。方法以PC12细胞作为研究对象,利用核质分离及免疫荧光观察NaAsO 2对yap蛋白核质分布的影响。再将细胞分为control组、NaAsO 2组和NaAsO 2+XMU-MP-1(MST1/2抑制剂)组、XMU-MP-1组,利用流式细胞术、Western blot验证Hippo-yap通路在NaAsO 2影响细胞周期及细胞凋亡中的作用。结果相较于control组,核质分离与免疫荧光结果都表明NaAsO 2组细胞质中yap蛋白明显增加(Pyap蛋白明显下调(Pyap以及凋亡相关蛋白P53和BAX表达明显上调(P蛋白表达明显下调(Pyap通路可能参与NaAsO 2对PC12细胞周期及细胞凋亡的影响。

关键词： Hippo-yap通路 NaAsO 2 PC12细胞 yap蛋白细胞周期细胞凋亡

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纤维型肌动蛋白对间充质干细胞衰老的调节作用及其机制

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吉林大学学报（医学版） 2018年第3期44卷 483-486,693,694页

作者：俞冬升蔡大敏陈婕妤吕方怡花扣珍银国利王俊娟浙江省人民医院杭州医学院附属人民医院骨科浙江杭州310014 杭州医学院解剖学与组织胚胎学教研室浙江杭州310014

目的:探讨纤维型肌动蛋白(F-actin)调节人骨髓来源间充质干细胞(hBMSCs)衰老的作用,初步阐明hBMSCs衰老的分子生物学机制。方法:将分离得到的hBMSCs进行体外培养并分为对照组(P2代hBMSCs)、F-actin抑制剂组(2.5μmol·L^(-1) F-actin抑... 详细信息

目的:探讨纤维型肌动蛋白(F-actin)调节人骨髓来源间充质干细胞(hBMSCs)衰老的作用,初步阐明hBMSCs衰老的分子生物学机制。方法:将分离得到的hBMSCs进行体外培养并分为对照组(P2代hBMSCs)、F-actin抑制剂组(2.5μmol·L^(-1) F-actin抑制剂Latrunculin B处理P2代hBMSCs 1h)和P11代hBMSCs组(P2代hBMSCs连续传代得到P11代hBMSCs)。成骨、成脂和成软骨诱导液诱导各组hBMSCs,采用茜素红染色、SO染色和油红O染色确定诱导效果。免疫荧光染色观察各组hBMSCs中Ki67阳性细胞数、F-actin的形态和聚合情况、yap在细胞内的亚细胞定位。SA-β-Gal染色检测各组hBMSCs中SA-β-Gal染色阳性细胞数。结果:茜素红染色、SO染色和油红O染色,hBMSCs具有成骨、成脂和成软骨分化的能力。免疫荧光染色和SA-β-Gal染色,对照组hBMSCs中的微丝纤维束较多较粗,F-actin长度较长,yap主要集中在细胞核(yap在细胞核内为活化态);与对照组比较,P11代hBMSCs组中Ki67阳性细胞数较少,SA-β-Gal阳性细胞较多,F-actin更短更细,yap主要集中在胞浆,且yap出核的细胞SA-β-Gal染色呈阳性;F-actin抑制剂组hBMSCs中yap出核失活,SA-β-Gal染色阳性的hBMSCs衰老细胞更多。结论:抑制yap入核可以促进hBMSCs衰老,F-actin可以通过调节yap活性影响hBMSCs衰老。

关键词：间充质干细胞纤维型肌动蛋白 yap蛋白衰老

吗啡促乳腺癌细胞转移的yap相关信号机制研究

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西安交通大学学报（医学版） 2014年第5期35卷 618-621页

作者：杨远东张灵敏袁慧袁伟西安交通大学医学院第一附属医院麻醉科陕西西安710061

目的探讨yap相关的分子信号通路在吗啡促乳腺癌细胞转移中的作用及机制。方法应用RNA干扰技术降低人乳腺癌BT474细胞中yap蛋白的表达,体外Transwell细胞转移实验验证yap蛋白被抑制后,吗啡对乳腺癌细胞转移的刺激作用。采用Western blot... 详细信息

目的探讨yap相关的分子信号通路在吗啡促乳腺癌细胞转移中的作用及机制。方法应用RNA干扰技术降低人乳腺癌BT474细胞中yap蛋白的表达,体外Transwell细胞转移实验验证yap蛋白被抑制后,吗啡对乳腺癌细胞转移的刺激作用。采用Western blot技术检测吗啡处理后,乳腺癌细胞中yap蛋白及磷酸化yap蛋白的表达;细胞免疫荧光分析吗啡对yap蛋白细胞内定位的影响。结果 siRNA能有效抑制乳腺癌BT474细胞中yap蛋白的表达,吗啡干预后的乳腺癌BT474细胞转移数显著高于对照组(79.4±5.48 vs.32.2±6.42,P=0.000 5),而当yap蛋白被抑制后,吗啡未能增加BT474细胞的转移(29.2±4.08 vs.21.2±2.58,P=0.135 9);Western blot检测发现,在BT474细胞的培养基中加入吗啡干预后后,磷酸化的yap含量随着时间的增加而显著降低,但总yap蛋白的表达无显著变化,同时,细胞免疫荧光证实吗啡能促进BT474细胞中yap蛋白在细胞核内聚集。结论吗啡能通过激活细胞中的yap蛋白从而促进乳腺癌的转移。

关键词：吗啡乳腺癌转移 yap蛋白

Hippo信号通路相关蛋白对肝癌肝移植术后肿瘤复发的影响

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中华消化外科杂志 2014年第5期13卷 345-351页

作者：王寿华李华张志刚吴小材汪国营陈规划中山大学附属第三医院肝移植中心中山大学器官移植研究所广东省器官移植研究中心广州510630

目的检测Hippo信号通路相关蛋白在肝癌组织中的表达，探讨其对肝癌肝移植术后肿瘤复发的影响。方法回顾性分析2004年7月至2009年9月广州中山大学附属第三医院收治的105例肝癌患者的临床资料。收集施行同种异体肝移植、经组织病理学检查... 详细信息

目的检测Hippo信号通路相关蛋白在肝癌组织中的表达，探讨其对肝癌肝移植术后肿瘤复发的影响。方法回顾性分析2004年7月至2009年9月广州中山大学附属第三医院收治的105例肝癌患者的临床资料。收集施行同种异体肝移植、经组织病理学检查证实为肝细胞癌患者的手术切除标本、肿瘤数目、肿瘤直径、肿瘤侵犯血管情况、术前AFP水平、术后病理检查结果等临床病理资料。通过门诊、信件和电话等方式对患者进行术后随访，肝移植术后1个月内每周随访1次，半年内每个月随访1次，1年后每3个月随访1次。随访时间截至2012年12月，以首次观察到患者肿瘤复发为终点，无瘤生存时间以手术日期至发现患者肿瘤复发为终点。免疫组织化学染色检测肝癌组织中yap和磷酸化yap蛋白、Hippo信号通路核心蛋白（Latsl／2、磷酸化Latsl／2、Mstl、磷酸化Mstl／2）的表达。计数资料采用Ⅳ。检验，连续资料采用Studentt检验，对影响肝癌肝移植术后患者无瘤生存时间的因素进行单因素及多因素分析采用COX比例风险模型，Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log—rank检验分析患者无瘤生存情况。结果yap和磷酸化yap蛋白在肝癌组织中的阳性表达主要定位于细胞核及细胞质，Latsl／2、磷酸化Latsl／2、Mstl、磷酸化Mstl／2蛋白主要定位于细胞质。yap和磷酸化yap蛋白阳性表达率为51．43％（54／105）和55．24％（58／105），Latsl／2、磷酸化Latsl／2、Mstl、磷酸化Mstl／2蛋白阳性表达率分别为45．71％（48／105）、9．52％（10／105）、64．76％（68／105）和20．00％（21／105）。yap蛋白阳性表达与肿瘤直径、静脉大血管侵犯及肝癌AJCC分期有关（χ^2=4．173，9．611，7．233，P〈0．05）；Latsl／2蛋白阳性表达与肿瘤直径及肝癌AJCC分期有关（χ^2=14．413，7．969，P〈0．05）；Mstl蛋白阳性表达与肿瘤直径有关（χ^2=4．129，P〈0．05）。单因素分析结果表明：yap蛋白表达、Latsl／2蛋白表达、磷酸化Mstl／2蛋白表达、年龄、肿瘤直径、组织分化程度、术前AFP水平、静脉大血管侵犯、肝癌AJCC分期是影响患者肝移植术后肿瘤复发的危险因素（HR=2．603，0．502，1．802，0．955，3．559，2．395，2．414，2．915，2．086，95％可信区间：1．452～4．666，0．287～0．880，1．040～3．123，0．931—0．981，1．921—6．595，1．475—3．889，1．313～4．337，1．604～5．229，1．370～3．176，P〈0．05）。多因素分析结果表明：yap蛋白阳性表达、肿瘤直径〉5em、组织低分化、肝癌AJCCⅢ期是影响患者肝移植术后肿瘤复发的独立危险因素（HR=2．011，2．176，2．390，1．574，95％可信区间：1．115～3．628，1．125—4．206，1．448～3．945，1．041～2．381，P〈0．05）。患者中位随访时间为13．0个月（1．0～96．0个月），失访8例，54例患者肿瘤复发，复发时间为1．0～41．0个月，平均复发时间为6．7个月。yap蛋白阳性表达者与yap蛋白阴性表达者比较肝移植术后无瘤生存时间明显缩短（Log—rank值=12．890，P〈0．05）。结论yap和磷酸化yap蛋白在肝癌组织中的阳性表达主要定位于细胞核及细胞质，Lats1／2、磷酸化Lats1／2、Mst1、磷酸化Mst1／2蛋白阳性表达主要定位于细胞质。Hippo信号通路中，只有yap蛋白阳性表达是肝癌患者肝移植术后肿瘤复发的独立危险因素。

关键词：肝肿瘤肝移植 yap蛋白肿瘤复发

长链非编码RNA LINC00152对人脑胶质瘤裸鼠移植瘤生长的影响及机制探讨

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中国比较医学杂志 2019年第11期29卷 28-33,49页

作者：金亮金爱赵立智沧州市人民医院神经外科河北沧州061000 沧州市人民医院输血科河北沧州061000

目的观察长链非编码RNA(long noncoding RNA,LncRNA) LINC00152过表达对人脑胶质瘤U251荷瘤鼠肿瘤生长的影响并对其机制进行探讨。方法慢病毒转染法上调U251细胞LINC00152表达水平,设立LINC00152过表达组(LV-LINC00152组)和空载对照组... 详细信息

目的观察长链非编码RNA(long noncoding RNA,LncRNA) LINC00152过表达对人脑胶质瘤U251荷瘤鼠肿瘤生长的影响并对其机制进行探讨。方法慢病毒转染法上调U251细胞LINC00152表达水平,设立LINC00152过表达组(LV-LINC00152组)和空载对照组(LV组)细胞,以正常U251细胞作为空白对照组(control组);qRT-PCR检测LINC00152表达水平;构建U251荷瘤鼠模型,p-yap抑制剂XMU-MP-1进行处理,测量肿瘤体积,实验终点称量瘤重;免疫组织化学染色观察肿瘤组织Ki67表达;蛋白印记实验检测yap、p-yap、LATS1、pLATS1蛋白表达。结果与LV组相比,LV-LINC00152组LINC00152表达明显上调(Pyap和p-LATS1蛋白表达明显上调(Pyap和p-LATS1蛋白表达(Pyap磷酸化,促进脑胶质瘤生长,而p-yap抑制剂XMU-MP-1能抑制长链非编码RNA LINC00152的上述生物学效应。

关键词：长链非编码RNA(LncRNA) LINC00152 脑胶质瘤生长 yap蛋白裸鼠