褪黑素逆转氧化应激对牙周膜干细胞衰老、干性的影响及其机制研究

作     者：冯笑梅 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：文勇

授予年度：2022年

学科分类：1003[医学-口腔医学] 100302[医学-口腔临床医学] 10[医学] 

主      题：褪黑素 氧化应激 细胞衰老 细胞干性 YAP蛋白 

摘      要：背景与目的:人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)长期体外传代培养会发生复制性衰老,促进胞内积聚过量活性氧(reactive oxygen species,ROS)自由基损伤干细胞功能;外源性ROS也可诱发细胞氧化应激性早衰,两种类型衰老呈现相同特征,均严重影响组织工程效率。研究证明褪黑素(melatonin,MT)是一种强大的自由基清除剂,可发挥延缓骨髓间充质干细胞衰老的作用,但其能否在氧化应激条件下延缓hPDLSCs衰老、维持其干性特性尚无定论。本实验旨在观测过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)诱导的氧化应激对hPDLSCs凋亡、周期、衰老、干性等生物学行为的影响,探索MT对上述效应是否发挥逆转作用,并探究可能的分子机制。材料与方法:1、分离、培养、鉴定hPDLSCs:组织块法获取、培养原代hPDLSCs,对表面标志物进行流式鉴定;成骨、成脂向诱导后,检测细胞多向分化潜能。2、构建氧化应激细胞模型:梯度浓度H202处理hPDLSCs,CCK-8检验细胞活性,镜下观察形态变化;对细胞凋亡情况及胞内ROS水平进行流式检测;荧光显微镜下观测ROS(+)细胞比例。3、氧化应激对hPDLSCs衰老、干性的影响:qRT-PCR、Western blot检测细胞衰老、干性相关基因的表达变化;对细胞衰老表观变化进行衰老相关β半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase,SA-β-Gal)染色检测;成骨诱导后染色确定实验组细胞的成骨分化是否削弱;最终确定H202的后续工作浓度。4、MT对氧化应激条件下hPDLSCs生物学行为的保护作用:镜下观测结合CCK-8检测MT对hPDLSCs增殖活性的影响,流式细胞术检测细胞周期分布;评估胞内氧化应激水平;检测细胞衰老、干性相关指标的表达变化,判断成骨分化能力是否恢复。5、YAP介导MT发挥上述调控作用:研究全程检测YAP表达水平;并在上述研究的基础上加入YAP蛋白抑制剂维替泊芬(Verteporfin,VP),拮抗YAP表达后检测衰老、干性相关指标的变化。结果:1、组织块贴壁法获取、培养了原代hPDLSCs,其表面抗原表达形式与间充质干细胞一致,细胞具有多向分化潜能。2、H2O2处理hPDLSCs后,细胞增殖活性与H2O2浓度成反比,镜下可见高浓度时部分细胞凋亡,余留细胞体积变大、呈成纤维细胞样。流式分析显示细胞凋亡率与H2O2浓度成正比。3、流式细胞术显示hPDLSCs内ROS含量及荧光显微镜下ROS(+)细胞荧光强度、所占比例随H2O2浓度的升高而升高,证明氧化应激细胞模型已成功构建,胞内氧化应激水平与H2O2浓度成正比。4、细胞衰老相关基因P21的表达水平随氧化应激水平的增强而升高,而p-RB蛋白及细胞干性相关基因C-MYC、OCT-4、NANOG的表达呈现相反趋势,SA-β-Gal染色佐证细胞发生早衰。碱性磷酸酶、茜素红染色显示,氧化应激条件下hPDLSCs成骨分化水平急剧下降。5、MT对hPDLSCs增殖有积极影响,荧光显微镜观测、流式分析显示胞内氧化应激水平显著下降。6、MT缓解早衰细胞衰老特征,恢复其干性特性。流式分析得出MT能减少氧化应激诱导的细胞周期在G0/G1期的停滞。7、氧化应激使YAP蛋白水平下降,而MT恢复被抑制的YAP蛋白水平。8、低浓度的YAP抑制剂VP对hPDLSCs增殖无明显影响,H2O2及VP对细胞YAP蛋白表达的抑制具有叠加性。VP拮抗YAP后,即使MT在同时作用,细胞仍然出现衰老水平上升、干性特性下降的现象。证明YAP介导MT在氧化应激条件下延缓hPDLSCs衰老,维持其干性。结论:H2O2诱导的氧化应激使hPDLSCs早衰,降低其干性,并对细胞增殖、周期、成骨向分化发挥负向调控作用。但MT能有效缓解甚至逆转上述效应,YAP蛋白在其中发挥重要作用。