检索结果-南通市图书馆

miR-29c过表达对P19细胞增殖、凋亡和分化的影响

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

miR-29c过表达对P19细胞增殖、凋亡和分化的影响

作者：刘明南京医科大学

学位级别：硕士

心脏是脊椎动物胚胎发育过程中最早形成和发挥功能的器官,其发生发展涉及时间、空间上多种基因的顺序表达和相关通路(如wnt信号通路、Notch信号通路、BMP信号通路等)的精细调控。调控网络中任一环节的差错都有可能导致心脏发育的畸形,... 详细信息

心脏是脊椎动物胚胎发育过程中最早形成和发挥功能的器官,其发生发展涉及时间、空间上多种基因的顺序表达和相关通路(如wnt信号通路、Notch信号通路、BMP信号通路等)的精细调控。调控网络中任一环节的差错都有可能导致心脏发育的畸形,而最常见表现为先天性心脏病。因此,了解心脏发育过程中基因等因素的作用机制,可为先天性心脏病的防治和治疗提供新的方向。近些年随着生命科学技术的快速发展,人们对众多疾病发生发展的机制已有较多了解,研究水平不再局限于基因和蛋白水平,而对以往被认为不编码蛋白质的非编码RNA开始有了新的认识。其中,一类长度18-22nt、负责转录后负性调控其靶基因m RNA 3’UTR(untranslated region,非编码区)的非编码RNA---micro RNA(miRNA),由于介导靶m RNA的降解或抑制其转录后水平的表达,可致靶蛋白表达量降低,调控细胞增殖、凋亡、分化和时空发育等多种生理过程而引人关注,此领域有关miRNA的研究也拓展了人们对心脏发育和心脏疾病的新的认识。大量研究已证实,miRNAs可通过调控心脏相关基因表达影响心肌细胞的功能,并在多种心血管事件中发挥重要作用,其功能失调已被认为与心血管疾病密切相关。然而,胚胎心脏发育受相关基因紧密调控,miRNA作为其重要的转录后调控因子,在心脏发育中的作用机制研究目前仍处于起步阶段。miR-29c是本研究小组前期通过miRNA芯片技术,筛选流产室间隔缺损(ventricular septal defect,VSD)胎儿心肌组织miRNA差异表达谱时,发现的一个功能未知miRNA。miR-29c在室间隔缺损胎儿心肌组织中差异高表达,提示miR-29c的功能可能与心脏发育畸形有关,但miR-29c致胚胎心脏发育畸形的功能与机制研究目前并无文献报道。鉴于P19细胞和斑马鱼是心脏发育分子机制研究的经典模型,因此本研究借助上述模型,通过改变miR-29c表达水平,探讨了miR-29c过表达对P19细胞增殖、凋亡、分化的影响,评价了其在斑马鱼胚胎心脏发育中的功能,并初步分析了miR-29c下游作用的靶标,为先天性心脏病的病理生理学基础研究提供新线索。第一部分 miR-29c过表达对P19细胞增殖、凋亡的影响目的:研究miR-29c对P19细胞增殖、凋亡的影响;获得miR-29c过表达影响斑马鱼胚胎心脏发育的表型。方法:构建miR-29c过表达质粒,与GFP(green fluorescent protein,绿色荧光蛋白)对照载体分别转染P19细胞,嘌呤霉素筛选两周,荧光观察和q RT-PCR验证筛选出稳定表达miR-29c的细胞株。CCK-8检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期;并用Hoechst染色、流式细胞计数分析、实时荧光定量PCR等技术,检测BCL-2/BAX表达水平、Caspase-3/-8/-9的活性;Westem blot法检测凋亡过程中蛋白水平的变化,以评价miR-29c对P19细胞凋亡的影响;斑马鱼单细胞期显微注射miR-29c minics观察miR-29c对胚胎心脏形态学的影响。结果:miR-29c过表达抑制了P19细胞的增殖,抑制细胞进入S期,凋亡相关的BAX/BCL-2比值和caspase活性增高,细胞凋亡增加;miR-29c过表达可致斑马鱼胚胎发育出现心包水肿等心脏畸形表型。结论:miR-29c过表达能够影响P19细胞的增殖与凋亡功能,并致斑马鱼胚胎发育出现心包水肿等心脏畸形表型。第二部分 miR-29c过表达对P19细胞分化和wnt4信号通路的影响目的:研究miR-29c过表达对P19细胞分化、wnt4信号通路的影响。方法:诱导稳定表达miR-29c的P19细胞向心肌细胞分化,实时荧光定量PCR检测心肌细胞分化过程中心肌特异性标记物GATA4、c Tn T、MEF2C的变化以及wnt4信号通路相关因子在分化过程中的表达变化,Westem blot法检测分化过程中相关蛋白表达的变化。荧光素酶验证wnt4是否是miR-29c的下游靶标。结果:miR-29c过表达可促进P19细胞向心肌细胞的分化,心肌标记物的表达量逐渐升高;wnt4是miR-29c的下游靶标,miR-29c过表达可能通过抑制wnt4/β-catenin通路进而影响P19细胞的分化。结论:miR-29c过表达可能通过影响wnt4/β-catenin通路,影响P19细胞向心肌细胞的分化。

关键词： miR-29c P19细胞增殖凋亡分化 wnt4

复肾功方抗慢性肾衰竭大鼠肾间质纤维化的作用机制研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

复肾功方抗慢性肾衰竭大鼠肾间质纤维化的作用机制研究

作者：张洋重庆医科大学

学位级别：硕士

背景慢性肾衰竭(Chronic Renal Failure,CRF)是多种慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease,CKD)持续性进展的最终归宿,是全世界公共卫生问题之一,全世界肾病专家为解决此难题一直思考并做了大量科研和临床研究。目前全球约有240万肾衰竭患... 详细信息

背景慢性肾衰竭(Chronic Renal Failure,CRF)是多种慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease,CKD)持续性进展的最终归宿,是全世界公共卫生问题之一,全世界肾病专家为解决此难题一直思考并做了大量科研和临床研究。目前全球约有240万肾衰竭患者需要透析,慢性肾衰竭患者每年人数以7-8%的比例上升,终末期肾病只能靠透析和肾移植治疗,花费相当昂贵,导致许多终末期患者因不能承受经济负担而摒弃治疗。中医药在防治CRF过程中具有疗效确切、用药安全、费用低廉等优点,越来越受到人们重视,而复肾功方是著名中医学家、首届国医大师郭子光教授临床60余年总结出的治疗CRF的经验方,主要适用于慢性肾衰竭Ⅰ、Ⅱ期,其疗效肯定。故本课题以klotho蛋白及mRNA的表达和wnt/β-catenin信号途径作为切入点,研究复肾功方抗慢性肾衰竭大鼠肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)的作用机制,以期阐明其延缓慢性肾衰竭进展可能的作用机制。目的根据前期研究成果,为进一步探究复肾功方治疗慢性肾衰竭的作用机制,本实验拟从肾损伤的减轻、修复和抗肾间质纤维化等角度进一步研究该方对CRF大鼠klotho蛋白及mRNA的表达和对wnt/β-catenin信号途径的影响,为深入挖掘国医大师临床经验和研发出一个作用机制明确、安全有效、便利实惠的中成药提供可靠的实验依据。方法取雄性Sprague-Dawley大鼠55只,适应性喂养1周后,将其随机分成正常组,模型组,复肾功方低、中、高剂量组,各组均为11只。正常组给予常规饲养,其余4组大鼠则用腺嘌呤含量为0.5%的饲料建立慢性肾衰竭模型,连续喂养3周。造模结束后,随机从造模各组中抽取1只大鼠和1只正常组大鼠进行血液生化指标和病理组织学检测,以证明造模成功与否。造模成功后,所有各组大鼠改用常规饲料饲养。正常组、模型组大鼠则给予0.9%生理盐水(NS)20 mLkgd灌胃;复肾功方低、中、高剂量组大鼠则按体质量分别以含原生药材量4,8,16 gkg复肾功方水煎剂灌胃给药,1次/d,持续灌胃30 d。干预治疗后,用20%乌拉坦5 mLkg体重腹部麻醉、心脏采血3-5 mL,分离出上层血清,低温4℃保存备用。接着颈椎脱臼快速处死大鼠,打开腹腔,充分暴露双侧肾脏,止血钳固定出入肾动静脉,防止血液大量流入腹腔,取出肾脏并用PBS冲洗肾脏,再用滤纸吸去多余水分,去除肾脏筋膜,从窄面均分后的肾脏,分别采用4%多聚甲醛固定和液氮速冻保存,多聚甲醛固定后的肾脏主要用于石蜡包埋,液氮速冻后的肾脏挪至-80℃超低温冰箱冻存以备用。取各组大鼠血清样本检测血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)的含量;HE、Masson染色检测大鼠肾脏组织病理形态学变化;采用RT-PCR法检测肾脏组织Klotho、wnt4、β-catenin mRNA的表达;Western Blot法和免疫组化法检测肾脏组织Klotho、wnt4、β-catenin蛋白的表达。结果与正常组大鼠比较,模型组大鼠血清SCr和BUN含量均显著升高(Pwnt4、β-catenin蛋白及mRNA表达则显著升高(Pwnt4、β-catenin蛋白及mRNA表达明显降低(Pwnt4、β-catenin蛋白及mRNA的表达有关。

关键词：复肾功方慢性肾衰竭 Klotho wnt4 β-catenin

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

wnt信号通路在氟中毒肾脏中表达及其意义

中国公共卫生 2015年第5期31卷 590-593页

作者：张颖于燕妮范彬贵阳医学院病理学教研室贵州贵阳550004

目的观察wnt/β-catenin信号通路及其相关信号分子蛋白及mRNA表达水平在实验性氟中毒大鼠肾组织中的变化,探讨氟中毒发病机制。方法选择健康成年SD大鼠36只,雌雄各半,随机分为:对照组(饮水含氟量<1 mg/L),低、高氟组(饮水加氟量5、50 mg... 详细信息

目的观察wnt/β-catenin信号通路及其相关信号分子蛋白及mRNA表达水平在实验性氟中毒大鼠肾组织中的变化,探讨氟中毒发病机制。方法选择健康成年SD大鼠36只,雌雄各半,随机分为:对照组(饮水含氟量wnt4、β-连环蛋白(β-catenin)、E-粘钙蛋白(E-cadherin)蛋白及mRNA表达。结果低氟组大鼠氟斑牙检出率为75%(9/12),高氟组为91.7%(11/12),与对照组比较,染氟组大鼠尿氟、骨氟含量随染氟浓度增加而逐渐升高,差异有统计学意义(Pwnt4、β-catenin、E-cadherin蛋白表达分别为[(7.78±1.17)、(6.66±0.59)、(3.23±0.82)]和[(17.46±3.18)、(12.46±0.89)、(1.23±0.35)],mRNA表达分别为[(3.01±0.81)、(1.86±0.43)、(0.276±0.12)]和[(5.79±0.86)、(5.84±1.19)、(0.12±0.46)],与对照组比较,氟中毒组大鼠肾组织中wnt4、β-catenin蛋白和mRNA表达升高,而E-cadherin蛋白及mRNA表达降低。结论慢性氟中毒时,氟通过刺激wnt信号通路中wnt4、β-catenin过表达、E-cadherin低表达,导致肾小管上皮细胞间充质转分化(EMT)。

关键词： wnt4 β-连环蛋白(β-catenin) E-粘钙蛋白(E-cadherin) 氟中毒肾小管上皮细胞间充质转分化(EMT)

三七总皂苷对大鼠RIRI模型wnt/β-catenin通路蛋白表达的影响

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

三七总皂苷对大鼠RIRI模型wnt/β-catenin通路蛋白表达的影响

作者：林辉遵义医学院

学位级别：硕士

目的:通过建立大鼠肾脏缺血再灌注损伤(Renal Ischemia Reperfusion Injury,RIRI)模型,以三七总皂苷为干预药物,并与wnt通路激动剂及抑制剂对比,观察不同时间点血清肌酐及尿素氮、肾组织匀浆超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)... 详细信息

目的:通过建立大鼠肾脏缺血再灌注损伤(Renal Ischemia Reperfusion Injury,RIRI)模型,以三七总皂苷为干预药物,并与wnt通路激动剂及抑制剂对比,观察不同时间点血清肌酐及尿素氮、肾组织匀浆超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、肾脏病理及肾组织中wnt/β-catenin通路相关蛋白的表达,从而探索三七总皂苷可能的肾脏保护机制。方法:SD大鼠90只,随机分为5组,每组18只,分为:对照组、缺血再灌注损伤组(模型组)、三七总皂苷组(三七组)、wnt激动剂组(激动剂组)、wnt抑制剂组(抑制剂组)。实验干预:(1)对照组:造模前3天,每天1次尾静脉注射与三七组等量生理盐水,麻醉后右肾切除,左肾暴露30min后关腹。(2)模型组:麻醉前处理同对照组,采用切除右侧肾脏,左侧肾动脉夹闭30min恢复血流的方法造模。(3)三七组:造模前3天,每天1次尾静脉注射三七总皂苷(150mg·kg),余处理同模型组。(4)激动剂组:造模前3天,每天q12h尾静脉注射wnt激动剂重组DKK2蛋白(DKK2-C2,20ug·kg-1),余处理同模型组。(5)抑制剂组:造模前3天,每天q12h尾静脉注射wnt抑制剂重组人血管内皮抑制素(Endostar,1.5mg·kg-1),余处理同模型组。取恢复血流灌注后24h、48h、72h时间点,每组分别取6只大鼠的血清检测肌酐(Serum creatinine,Scr)、尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN),肾组织匀浆检测SOD及MDA含量,HE染色光镜下观察肾组织的病理变化并计算肾小管损伤评分,免疫组化检测wnt4及β-连环蛋白(β-catenin)在肾组织内的表达情况,采用Western Blot检测肾组织中wnt4及β-catenin的表达量。结果:(1)Scr、BUN:除对照组外,模型组和三七组及激动剂组在24h、抑制剂组在48h达到最高值;三七组、激动剂组各时间点较模型组降低(P4h达到最高值,三七组、激动剂组各时间点评分较模型组降低(P48h达到最高值,各时间点较模型组明显升高(P4h达到最高值,而SOD则在24h达到最低值。与模型组比较,三七组、激动剂组24h、48h的MDA显著降低(P4h、48h的SOD则明显升高(P4)wnt4检测结果:免疫组化显示除对照组wnt4无明显表达外,其余各组表达部位相同,即wnt4阳性表达于肾小管上皮细胞胞质中,肾小球无明显表达,其表达趋势与蛋白印迹结果一致,即除对照组外,各组wnt4表达量在24h达到最高值;三七组、激动剂组各时间点表达量较模型组升高(P4h开始升高,模型组、三七组、抑制剂组在72h达到高峰;与模型组比较,三七组、激动剂组各时间点表达量升高(P48h达到高峰,各时间点表达量较模型组下降(Pwnt/β-catenin通路蛋白上调相关,其与wnt激动剂一样能促进缺血再灌注肾脏的恢复。(2)wnt/β-catenin信号通路参与了缺血再灌注损伤肾脏的修复过程,wnt抑制剂加重了肾脏损伤。

关键词：三七总皂苷肾缺血再灌注损伤模型 wnt4 β-连环蛋白

wnt/β-catenin信号途径在高糖诱导肾小管上皮细胞转分化中的作用

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

中国组织化学与细胞化学杂志 2009年第4期18卷 396-400页

作者：闫喆姚芳段惠军谭会斌张春霞邢玲玲河北医科大学第二医院肾内科河北医科大学病理教研室石家庄050000

目的探讨wnt/β-catenin信号途径在高糖诱导肾小管上皮细胞转分化中的作用。方法体外培养人近端肾小管上皮细胞(HKC),分为正常糖组、甘露醇对照组及高糖组。采用免疫细胞化学观察β-连环蛋白(β-catenin)表达情况;Westernblot检测wnt4、... 详细信息

目的探讨wnt/β-catenin信号途径在高糖诱导肾小管上皮细胞转分化中的作用。方法体外培养人近端肾小管上皮细胞(HKC),分为正常糖组、甘露醇对照组及高糖组。采用免疫细胞化学观察β-连环蛋白(β-catenin)表达情况;Westernblot检测wnt4、β-catenin、E-钙粘蛋白(E-cadherin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达水平;逆转录-聚合酶链反应检测wnt4和β-cateninmRNA表达水平。结果高糖组较正常糖及渗透浓度对照组wnt4蛋白及mRNA、α-SMA蛋白表达增高,E-cadherin表达降低,β-catenin总蛋白及mRNA水平无明显变化,细胞浆及核内蛋白表达增强。高糖刺激肾小管上皮细胞wnt4及核β-catenin蛋白表达呈时间依赖性,于高糖刺激后12h增强,24h达到高峰。结论wnt/β-catenin信号通路可能参与了高糖介导的肾小管上皮细胞转分化过程。

关键词： wnt4 β连环蛋白 E-钙粘蛋白 α-平滑肌肌动蛋白上皮细胞转分化

慢肾康宁在UUO大鼠肾间质纤维化wnt/β-catenin信号通路中的影响

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

慢肾康宁在UUO大鼠肾间质纤维化Wnt/β-catenin信号通路中的影响

作者：颜显欣暨南大学

学位级别：硕士

目的：观察慢肾康宁在UUO大鼠肾间质纤维化wnt/β-catenin信号通路中的作用及其机制。方法：60只Wistar雄性大鼠适应性喂养1周后，根据体重随机分为正常组、假手术组、模型组、缬沙坦对照组、慢肾康宁高、低剂量组，每组10只。戊巴比妥... 详细信息

目的：观察慢肾康宁在UUO大鼠肾间质纤维化wnt/β-catenin信号通路中的作用及其机制。方法：60只Wistar雄性大鼠适应性喂养1周后，根据体重随机分为正常组、假手术组、模型组、缬沙坦对照组、慢肾康宁高、低剂量组，每组10只。戊巴比妥钠麻醉以后，模型组和各治疗组在无菌条件下使左肾和输尿管充分暴露，用4-0号丝线结扎左输尿管的二端，并在二个线结之间剪断以防逆行尿路感染，然后关闭腹腔，而假手术组在分离输尿管后不结扎，直接关闭腹腔，其余步骤相同。术后腹腔注射青霉素（10万单位/只）用于预防感染，连续三天。术前1天开始灌胃，缬沙坦组予8mg/(kg-1.d-1)剂量灌胃，中药组分别予30g/(kg-1.d-1)、15g/(kg-1.d-1)的剂量灌胃，各组连续灌胃12天，其余各组均以等量的生理盐水灌胃。术后第12天处死各组大鼠，留取肾脏组织。用HE和Masson染色观察肾组织的病理改变，免疫组化检测E-cadeherin、β-catenin的蛋白表达，Real-timePCR检测wnt4、β-catenin、ColⅢ mRNA表达。结果：缬沙坦和慢肾康宁均能减轻UUO大鼠肾间质纤维化，HE和Masson染色显示，正常组和假手术组无异常。与模型组比较，慢肾康宁组和缬沙坦组的左侧肾脏的病理损伤得到明显的改善，肾小管萎缩、塌陷、或扩张的情况好转，炎细胞浸润较少，管腔内细胞管型或蛋白管型少见，肾间质纤维化面积缩小。Real-time PCR显示，与模型组比较，各治疗组的wnt4、β-catenin、ColⅢmRNA表达水平均显著下降（Pwnt/β-catenin信号通路被激活;慢肾康宁能抑制UUO大鼠肾间质纤维化模型中wnt/β-catenin信号通路，下调wnt4、β-catenin的表达，并且上调E-cadherin的表达;慢肾康宁能减轻肾间质纤维化，下调ColⅢ的表达，这一过程可能是通过抑制wnt/β-catenin信号通路实现的。

关键词：慢肾康宁肾间质纤维化 wnt4 β-catenin Ⅲ型胶原蛋白

肾病Ⅰ号方对单侧输尿管结扎大鼠肾纤维化的影响

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

肾病Ⅰ号方对单侧输尿管结扎大鼠肾纤维化的影响

作者：林文博浙江中医药大学

学位级别：硕士

目的观察肾病Ⅰ号方对单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction,UUO)大鼠肾间质纤维化的影响,从而探讨肾病Ⅰ号方延缓肾纤维化作用的可能机制,为肾病Ⅰ号方抗肾脏纤维化作用进一步提供实验依据。方法将108只清洁级雄性健康SD大... 详细信息

目的观察肾病Ⅰ号方对单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction,UUO)大鼠肾间质纤维化的影响,从而探讨肾病Ⅰ号方延缓肾纤维化作用的可能机制,为肾病Ⅰ号方抗肾脏纤维化作用进一步提供实验依据。方法将108只清洁级雄性健康SD大鼠随机分为假手术组、模型组、盐酸贝那普利组及肾病Ⅰ号方高、中、低剂量组,每组18只。模型组和所有治疗组均采用单侧输尿管结扎的方法制备UUO大鼠模型,假手术组仅游离左侧输尿管不行结扎手术。所有大鼠于造模后第二天开始灌胃,盐酸贝那普利组及肾病Ⅰ号方高、中、低剂量组分别采用盐酸贝那普利片(0.8mg/kg)、肾病Ⅰ号方高、中、低剂量浓缩液(3、1.5、0.75g/m L)进行灌胃,假手术组和模型组则灌服2ml生理盐水,每日早晚灌胃各1次。每组大鼠分别于灌胃第7、14、21天后随机选取6只处死。处死前放入代谢笼中收集24h尿液,记录尿量,离心沉淀后取上清液检测24h尿蛋白含量(24h urinary protein,24h UP)。心脏取血检测血清尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血肌酐(serum creatinine,SCr)。取梗阻侧肾组织行马松三色染色法(Masson染色),评价肾小管间质纤维化损伤水平。采用免疫组织化学染色方法观察wnt4、β-catenin、TGF-β、CTGF在肾脏中的表达情况,采用实时荧光定量聚合酶链式反应法(polymerase chain reaction,PCR)检测wnt4 mRNA、TGF-β mRNA的表达情况。所得数据应用SPSS23.0统计软件分析处理,通过方差分析,实验数据用均数±标准差((?)±s)表示。结果1.成功建立UUO模型。2.血、尿生化指标结果:与假手术组对比,模型组大鼠SCr和BUN明显上升,差异显著(P0.05)。24h UP各组间差别不大,不具有统计学意义(P>0.05)。***染色结果:假手术组肾组织仅有微量蓝染胶原组织;而造模组肾组织可见大量蓝染胶原组织,且梗阻时间越长,蓝染组织越多,提示肾纤维化进行性加重。与假手术组比较,盐酸贝那普利组和肾病Ⅰ号方组肾脏蓝染胶原组织增加;而与模型组比较,盐酸贝那普利组和肾病Ⅰ号方组肾组织蓝色胶原纤维减少,说明肾纤维化程度减少。4.免疫组化结果:与假手术组比较,各造模组肾组织wnt4、β-catenin、TGF-β、CTGF表达量明显升高(Pwnt4、β-catenin、TGF-β、CTGF表达量均有降低(P0.05)。5.实时荧光定量PCR检测结果:与假手术组比较,各造模组肾组织wnt4 mRNA、TGF-β mRNA表达量明显升高(Pwnt4 mRNA、TGF-β mRNA表达量均有降低(P0.05)。结论1.肾病Ⅰ号方能降低UUO模型大鼠血清SCr、BUN水平,具有良好的肾脏保护作用。2.肾病Ⅰ号方可以改善肾组织的病理表现,延缓肾纤维化的进程,降低UUO大鼠肾组织的损伤作用。3.肾病Ⅰ号方可能通过抑制肾组织wnt4、β-catenin、TGF-β、CTGF的表达,减少细胞外基质的积聚,从而延缓肾纤维化的进展。

关键词：肾病Ⅰ号方肾纤维化单侧输尿管结扎 wnt4 β-链蛋白转化生长因子-β1 结缔组织生长因子

海蜇wnt信号途径关键节点基因的克隆与表达

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

海蜇Wnt信号途径关键节点基因的克隆与表达

作者：周春娅上海海洋大学

学位级别：硕士

本文采用转录组454GS FLX测序和RACE技术，筛选和克隆海蜇（Rhopilema esculentum）wnt信号途径关键节点基因的cDNA和基因组，利用荧光实时定量PCR和整体原位杂交技术分析这些基因在海蜇无性繁殖阶段的表达和分布规律，探讨它们在海蜇... 详细信息

本文采用转录组454GS FLX测序和RACE技术，筛选和克隆海蜇（Rhopilema esculentum）wnt信号途径关键节点基因的cDNA和基因组，利用荧光实时定量PCR和整体原位杂交技术分析这些基因在海蜇无性繁殖阶段的表达和分布规律，探讨它们在海蜇无性繁殖过程中的调控作用。 1.首次解析了海蜇wnt4基因的cDNA和基因组结构：Re-wnt4基因的cDNA全长1212bp，其中编码区长1032bp，编码了343个氨基酸的多肽。SMART分析表明，Re-wnt4具有wnt家族共同的结构特征，包括一个由28个氨基酸组成的信号肽和一个由24半胱氨酸残基组成的wnt4结构域。Blast分析表明，Re-wnt4基因与海胆、囊舌虫和人的wnt4具有高度相似性。基于邻接法构建wnt4的系统进化树揭示，在由人、斑马鱼wnt家族所有成员构建的12wnt亚家族系统树中，Re-wnt4基因与人和斑马鱼的wnt4聚类成一支。Re-wnt4基因组含有3个外显子和2个内含子，与已获得的其它动物的wnt4基因组相比较发现，Re-wnt4的基因组最小，结构差异明显。实时荧光定量PCR显示，Re-wnt4基因在海蜇的螅状体、横裂体、碟状体和稚水母四个发育阶段均有表达，但存在着明显的发育表达差异，其中横裂体阶段的表达量最高，分别是螅状体、碟状体和稚水母表达量的5.75、3.06和2.76倍。 2.首次解析了海蜇wnt5基因的cDNA和基因组结构：Re-wnt5基因的cDNA全长1647bp，其中编码区长1059bp，编码了353个氨基酸的多肽。SMART分析表明，Re-wnt5具有wnt家族共同的结构特征，包括一个由20个氨基酸组成的信号肽，2个N-糖基化位点和24个保守的参与二硫键形成的半胱氨酸。Blast分析表明，Re-wnt5基因与来自刺胞动物、无脊椎动物和脊索动物的wnt5、脊椎动物的wnt5a和wnt5b具有高度相似性。基于邻接法构建wnt5的系统进化树揭示，来自刺胞动物门不同物种的wnt5首先聚类为一支，在脊索动物文昌鱼wnt5之后，wnt5a和wnt5b产生分歧，形成了两个进化分支。wnt5基因的起源可能是伴随多细胞动物祖先形成过程产生的，wnt5a和wnt5b两个进化分支发生在脊索动物文昌鱼之后。Re-wnt5基因组含有4个外显子和3个内含子，结构与刺胞动物的wnt5、脊椎动物wnt5a和wnt5b的基因组相似;但总长度仅类似于刺胞动物的wnt5，明显小于脊椎动物wnt5a和wnt5b。实时荧光定量PCR显示，Re-wnt5基因在海蜇的螅状体、横裂体、碟状体和稚水母四个发育阶段均有表达，但存在着明显的发育表达差异，其中横裂体阶段的表达量最高，分别是螅状体、碟状体和稚水母表达量的12.38、9.99和13.01倍，而表达量最低的发育阶段是碟状体阶段。 3.首次解析了海蜇Frizzled1基因的cDNA和基因组结构：ReFzd-1基因的全长cDNA为2387bp，其中编码区为1761bp，编码586个氨基酸的多肽。SMART分析表明，ReFzd-1基因具备Frizzled家族共同的结构特征，包括：一个由23个氨基酸组成的信号肽，一个含有10个保守的半胱氨酸残基的半胱氨酸富集域（CRD）以及由七个跨膜蛋白组成的跨膜区。Blast分析表明，ReFzd-1基因与来自刺胞动物的贝螅H. echinata、水螅H. vulgaris、半球美螅水母C. hemisphaerica和海葵N. vectensis具有高度相似性，与人H. sapiens,鼠M. musculus,爪蟾X. laevis和斑马鱼D. rerio的Frizzled1、Frizzled2和Frizzled7具有较高的同源性。利用N-J法将人、鼠爪蟾、斑马鱼和果蝇所有Frizzled家族基因构建系统树显示，所有Frizzled家族成员聚类成11个亚家族，进一步可划分成4个类群，海蜇ReFzd-1基因与刺胞动物门的Frizzled聚类在一起，然后与Frizzled1、Frizzled2和Frizzled7三个亚家族聚成一个类群。采用荧光定量RT-PCR结果显示，ReFzd-1基因在海蜇无性繁殖的四个发育阶段螅状体、横裂体、碟状体和稚水母均有表达，其中横裂体阶段表达量最高，水母体阶段表达量最低。ReFzd-1基因在海蜇内胚层的表达高于其在外胚层的表达量，前者是后者的5倍。整体原位杂交结果显示，在海蜇横裂体阶段，ReFzd-1主要表达在横裂体的基盘和触手，发生横裂的部位也高度表达。上述研究结果表明，海蜇wnt信号调控途径的三个关键节点基因wnt4、wnt5和Frizzled1参与了海蜇的无性繁殖的各个过程，并在横裂生殖过程中发挥了重要的调控作用。

关键词：海蜇 wnt4 wnt5 Frizzled cDNA 基因组结构实时荧光定量PCR 整体原位杂交技术

miR-29c表达沉默对P19细胞增殖、凋亡和分化影响的研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

miR-29c表达沉默对P19细胞增殖、凋亡和分化影响的研究

作者：陈斌南京医科大学

学位级别：硕士

背景:心脏是脊椎动物胚胎发育过程中最早形成和发挥功能的器官,其发育经历着从细胞系决定、线性心管形成和环化到心腔分隔及瓣膜形成等一系列复杂的形态发生事件,最终形成成熟的左右心房心室的四腔结构。与之相应的,心脏发生发展的分子... 详细信息

背景:心脏是脊椎动物胚胎发育过程中最早形成和发挥功能的器官,其发育经历着从细胞系决定、线性心管形成和环化到心腔分隔及瓣膜形成等一系列复杂的形态发生事件,最终形成成熟的左右心房心室的四腔结构。与之相应的,心脏发生发展的分子机制涉及众多基因的顺序表达和多种信号通路(如BMP、Notch、wnt等信号通路)在时间和空间上的精细调控,构成一个错综复杂的调控网络。近年来,心脏发育的分子机制研究已经取得了较大的进展,但对于整个调控网络仍然知之甚少,许多具体机制仍然不很明确。微小RNA(miRNA)调控功能的发现,为进一步开展心脏发育调控机制的研究带来了新的思路。miRNA是一类长度18-22nt的非编码RNA,主要在转录后水平对靶基因进行负向调节,介导靶mRNA的降解或者抑制其转录后翻译,导致靶蛋白表达降低,参与了细胞增殖、凋亡、代谢、免疫、信号转导等诸多生物学过程。越来越多的研究成果证实miRNAs在心脏发育与疾病发生过程中同样起着重要的调控作用,但其影响心脏发育的具体机制尚未阐明,这也使得miRNA调节心脏发育的机制研究成为国际心血管研究的热点。本研究小组前期研究发现怀有先天性心脏病胎儿的孕妇血清miR-29c表达显著上调,提示miR-29c可能与心脏发育畸形密切相关。然而,查阅文献发现miR-29c关于心脏发育调节的研究尚处于空白,其在心脏发育中的调节机制和功能仍然未知。本研究承接前期研究工作,利用P19细胞模型,进一步探索miR-29c在心脏发育中的作用和机制。目的:探索miR-29c表达沉默对P19细胞增殖、凋亡和分化等细胞功能的影响及其发挥调节作用的机制。方法:(1)构建miR-29c沉默海绵体并转染P19细胞,嘌呤霉素筛选miR-29c持续稳定表达沉默的细胞株,荧光观察和qRT-PCR验证miR-29c沉默效率。(2)CCK-8试剂盒检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期;(3)饥饿诱导P19细胞凋亡,流式细胞计数结合Hoechst染色检测凋亡情况,qRT-PCR和Westem blot验证凋亡相关基因BCL-2/BAX的表达变化;(4)二甲基亚砜诱导P19细胞分化,qRT-PCR和Westem blot检测心肌特异性标记物GATA4、cTnT、MEF2C表达情况,明确miR-29c沉默对P19细胞分化的影响。(5)生物信息学分析结合荧光素酶报告实验明确miR-29c靶基因,qRT-PCR检测P19细胞分化过程中靶基因及其作用元件的表达变化。结果:miR-29c沉默组细胞与对照组相比,增殖速率更快,细胞周期S期比例高;miR-29c沉默组细胞凋亡率低于对照组,BCL-2表达高于对照组而BAX表达无明显差异;P19细胞分化第6天和第10天miR-29c沉默组GATA4、cTnT、MEF2C的表达水平显著低于对照组;wnt4证实为miR-29c靶基因,P19细胞分化过程中miR-29c沉默组wnt4和β-catenin的表达高于对应时间点的对照组,对照组wnt4/β-catenin表达量随分化时间逐渐递增而在miR-29c沉默组持续高表达。结论:miR-29c表达沉默促进P19细胞增殖,抑制P19细胞凋亡和分化,wnt4是miR-29c靶基因,miR-29c表达沉默可能通过激活wnt4/β-catenin信号通路发挥调节作用。

关键词： miR-29c P19EC细胞增殖凋亡分化 wnt4