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Lingo-1对恶性胶质瘤细胞的抗肿瘤作用和机制研究

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Lingo-1对恶性胶质瘤细胞的抗肿瘤作用和机制研究

作者：林贤宾第二军医大学

学位级别：硕士

一、目的：编码LINGO-1的基因位于人类染色体15q24.3。LINGO-1是具有富亮氨酸重复结构和免疫球蛋白结构域的NOgO受体作用蛋白。REMBRANDT数据库提示,胶质瘤中LINGO-1的表达水平明显低于正常脑组织,相比于平均水平,LINGO-1下调的病例生... 详细信息

一、目的：编码LINGO-1的基因位于人类染色体15q24.3。LINGO-1是具有富亮氨酸重复结构和免疫球蛋白结构域的NOgO受体作用蛋白。REMBRANDT数据库提示,胶质瘤中LINGO-1的表达水平明显低于正常脑组织,相比于平均水平,LINGO-1下调的病例生存期要明显下降。通过对全球范围基因芯片结果的Meta分析,旨在寻找胶质瘤的潜在靶标,2013年RheaI A T等发表在Neuro-Oncology上的文章中指出,通过免疫组织化学染色,确定了五个在胶质瘤发生中表达水平显著改变的分子,包括：spondinl,Plexin-B2,SLIT3,fibulin-1,and LINGol。而基于免疫组织化学染色结果, LINGO1被认为是最具有神经系统特异性的靶标,尤其是随着胶质瘤级别增高,其重要性尤为突出。本文旨在研究LINGO-1对于胶质瘤,尤其是恶性胶质母细胞瘤是否存在肿瘤抑制作用,假如LINGO-1是肿瘤抑制因子,那么LINGO-1又是通过什么样的机制达到肿瘤抑制作用?综上所述,我们在本阶段实验中将对这一猜想进行研究与阐述。二、方法：首先我们根据分子克隆的原则,构建慢病毒载体,携带LINGO-1 FL(全长)或者LINGO-1 Ecto(胞外段)序列,然后,我们使用不同胶质瘤细胞系(U251/U87MG)作为实验载体,并以此慢病毒感染U251/U87MG,此方法可以将目的基因序列转导入目的细胞内,并使被感染的细胞稳定地过表达LINGO-1 FL或者LINGO-1 Ecto。 U251/U87MG感染慢病毒后,我们抽提了细胞总蛋白,并进行LINGO-1 FL或者LINGO-1 Ecto过表达的验证。我们检测了感染慢病毒细胞系的增殖、迁移、侵袭、克隆形成和成瘤的能力。另外,我们也使用LINGO-1的激动剂有效激动LINGO-1,并进行了一系列相应的功能实验,包括增殖、迁移、侵袭、克隆形成和成瘤实验。在抑癌机制研究中,我们通过细胞免疫荧光染色和蛋白免疫印迹方法验证与LINGO-1相关的TrkB/p—TrkB以及下游的Akt/p-Akt的表达情况。三、结果：结果发现,在稳定过表达LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto之后,U251/U87MG细胞功能受到了明显抑制,表现为,与对照组细胞相比,U251/U87MG细胞增殖受到了明显抑制,在划痕实验和Transwell实验中,实验组细胞明显比对照组细胞降低了迁移和侵袭能力,实验组中U251/U87MG来源的悬浮干细胞形成克隆的能力也明显减弱,在体裸鼠成瘤实验中,过表达LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto后,U87MG细胞致瘤能力也明显下降。另外,LINGO-1在被PHEN激活后,上述功能也出现了不同程度的抑制。免疫荧光染色和蛋白免疫印迹实验证实,LINGO-1能够抑制TrkB磷酸化,并且影响TrkB-Akt信号通路的表达水平。四、结论：LINGO-1高表达或者激活后能够使U251/U87MG细胞增殖、迁移、侵袭能力受到显著抑制,并且抑制U251/U87MG的干细胞潜能,这种肿瘤抑制作用在在体实验中也进一步得到验证。此种肿瘤抑制功能可能是通过抑制TrkB/p-TrkB-Akt/p-Akt信号通路实验的。本实验共分为七个部分：第一部分：LINGO-1 FL/LINGO-1 Ecto过表达载体构建。第二部分：LINGO-1 FL/LINGO-1 Ecto过表达细胞系构建。第三部分：LINGO-1 FL/LINGO-1 Ecto过表达细胞系增殖、迁移、侵袭实验。第四部分：LINGO-1 FL/LINGO-1 Ecto过表达细胞系成球、克隆形成、裸鼠成瘤实验。第五部分：PHEN激动LINGO-1后增殖、迁移、侵袭实验。第六部分：PHEN激动LINGO-1后细胞系成球、克隆形成、裸鼠成瘤实验。第七部分：PHEN激动LINGO-1后胶质瘤细胞系相关信号水平改变。第一部分、LINGO-1 FL/LINGO-1 Ecto过表达载体构建1、目的：构建携带不同LINGO-1片段过表达载体,提供后续的实验工具。2、方法：我们使用人LINGO-1 FL cDNA (BC011057),经Ncol线性化后,在DNA聚合酶催化下,借助PCR技术,进行目的序列的扩增,利用凝胶电泳以分离不同片段,使用回收试剂盒回收分离出的目的片段,最后产物用EcoRI和NotI双酶切后克隆到PCDH 1-MSCV-EF 1 a-GFP-T2A-Puro (EcoRI/NotI)载体上。检测目的序列有无突变。最后,我们将上述载体质粒转染HEK293FT细胞,利用慢病毒包装系统,包装后含病毒的培养液于无菌台分装,并冻存于-80℃低温冰箱。3、结果：按照分子克隆的原则,经单酶切线性化,PCR扩增,产物胶回收,双酶切,连接载体,测序,慢病毒包装,我们获得了携带LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto准确序列

关键词： PHEN 细胞增殖细胞迁移细胞侵袭成球实验软琼脂克隆形成裸鼠成瘤实验磷酸化 TrkB/p-TrkB Akt/p-Akt 分子克隆慢病毒包装 U251 U87MG 慢病毒感染 WST-1 增殖实验划痕实验 Tranwell

植物活性成分对细胞存活率的影响及其测定方法的比较研究

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食品科学 2012年第19期33卷 119-123页

作者：孙健梅晶赵晓红刘涛阮研硕北京联合大学应用文理学院生物活性物质与功能食品北京市重点实验室北京100191

选用植物活性物质单体白藜芦醇和绿原酸作用于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,采用MTS法、WST-1法、CCK-8法、XTT法和MTT法测定细胞存活率,并将MTS法、WST-1法、CCK-8法、XTT法这4种方法与传统的MTT法进行比较分析,从中选出最佳的检测方法;通过I... 详细信息

选用植物活性物质单体白藜芦醇和绿原酸作用于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,采用MTS法、WST-1法、CCK-8法、XTT法和MTT法测定细胞存活率,并将MTS法、WST-1法、CCK-8法、XTT法这4种方法与传统的MTT法进行比较分析,从中选出最佳的检测方法;通过IC50值比较白藜芦醇和绿原酸毒性大小。结果显示:CCK-8法所得结果稳定,且与MTT法所测得的IC50值最接近,为最佳选择;WST-1法的实验可重复性较差,结果偏小;XTT法是4种方法中最不稳定的,作用时间、检测波长最难确定,且实验重复性差。CCK-8法、MTS法、WST-1法、XTT法和MTT法测定所得白藜芦醇的IC50值分别是116.86、124.68、64.90、162.86、86.30μmol/L;绿原酸的IC50值分别为2808.60、1119.96、1029.72、1325.43、2852.63μmol/L,同种方法下绿原酸的IC50值均高于白藜芦醇的IC50值。结论是测定植物活性成分对细胞存活率影响的方法以CCK-8为最好。白藜芦醇对CHO细胞的毒性比绿原酸大。

关键词： MTS WST-1 CCK-8 XTT 细胞存活率白黎芦醇绿原酸

血管组织工程生物支架材料细胞生物相容性实验研究

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中国生物医学工程学报 2007年第3期26卷 458-461页

作者：肖荣冬翁国星福建省立医院福建省心血管病研究所心血管外科福州350001

目的采用新方法研究天然生物支架材料胶原/透明质酸膜,明胶海绵的细胞相容性。方法应用WST-1法测定平滑肌细胞与材料的粘附率,增殖力,3H-TDR掺入法测定DNA合成率,BrdU细胞标记免疫组化鉴定,分析组织工程生物支架材料的细胞相容性。结果W... 详细信息

目的采用新方法研究天然生物支架材料胶原/透明质酸膜,明胶海绵的细胞相容性。方法应用WST-1法测定平滑肌细胞与材料的粘附率,增殖力,3H-TDR掺入法测定DNA合成率,BrdU细胞标记免疫组化鉴定,分析组织工程生物支架材料的细胞相容性。结果WST-1法测定,3H-TDR掺入法测定DNA合成率,BrdU细胞标记结果表明:胶原/透明质酸膜与平滑肌细胞的粘附率最高,细胞的增殖和代谢状况较好,明胶海绵较低。结论应用WST-1法测定,3H-TDR掺入法测定DNA合成率,BrdU细胞标记方法研究细胞相容性方法简便可行;天然复合生物材料胶原/透明质酸膜具有较理想的细胞相容性。

关键词：细胞相容性 WST-1 ^3H-TDR

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血管组织工程支架材料的细胞相容性

中国组织工程研究 2012年第43期16卷 8049-8054页

作者：肖荣冬翁国星福建医科大学省立临床学院心外科福建省福州市350001 福建省立医院心血管外科福建省福州市350001

背景:胶原与透明质酸均有利于组织培养中细胞的黏附、增殖和分化。目的:观察血管内皮细胞、平滑肌细胞与胶原/透明质酸膜、明胶海绵的细胞相容性,并筛选最佳种植方法。方法:将第3-5代兔血管平滑肌细胞种植在胶原/透明质酸膜(或明胶海绵... 详细信息

背景:胶原与透明质酸均有利于组织培养中细胞的黏附、增殖和分化。目的:观察血管内皮细胞、平滑肌细胞与胶原/透明质酸膜、明胶海绵的细胞相容性,并筛选最佳种植方法。方法:将第3-5代兔血管平滑肌细胞种植在胶原/透明质酸膜(或明胶海绵)材料上,连续培养2周后将兔内皮细胞接种在平滑肌细胞-胶原/透明质酸膜(或明胶海绵)复合体上,并设置单纯平滑肌细胞与内皮细胞共同接种组。结果与结论:①光镜和扫描电镜观察:细胞在两种材料上均随着培养时间,接种次数增加而生长加快,其中在胶原/透明质酸膜上的细胞生长更好,细胞连接更致密。②WST-1法检测:胶原/透明质酸膜组平滑肌细胞的黏附率及增殖率均高于明胶海绵组(P<0.05),且细胞在材料上的生长随着接种次数的增加有不同程度提高。③3H-TDR掺入法检测DNA合成率:在胶原/透明质酸膜上的细胞DNA合成最高,明胶海绵上的较差。表明胶原/透明质酸膜具有较理想的细胞相容性,采用适当间隔、反复接种的方法可提高细胞的黏附和增殖。

关键词：胶原透明质酸膜平滑肌细胞细胞相容性 WST-1 H-TDR组织工程补片生物材料

RNA干扰技术抑制宫颈癌HeLa细胞IKCa1表达的研究

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RNA干扰技术抑制宫颈癌HeLa细胞IKCa1表达的研究

作者：聂丹泸州医学院

学位级别：硕士

目的：探讨钙激活性中电导钾离子通道(IKCal)的RNA干扰表达载体对宫颈癌HeLa细胞株IKCal基因和蛋白表达的抑制效果以及对HeLa细胞生物学特性的影响。方法：根据短发夹RNA (shRNA)设计原则,设计两条针对IKCal基因的干扰序列和一条非特异... 详细信息

目的：探讨钙激活性中电导钾离子通道(IKCal)的RNA干扰表达载体对宫颈癌HeLa细胞株IKCal基因和蛋白表达的抑制效果以及对HeLa细胞生物学特性的影响。方法：根据短发夹RNA (shRNA)设计原则,设计两条针对IKCal基因的干扰序列和一条非特异性阴性对照序列,并将其定向克隆入真核表达载体pGenesil-1.1中。得到三种质粒pGenesil-IK1(携带干扰序列1)、pGenesil-IK2(携带干扰序列2)、pGenesil-HK(携带非特异性阴性对照序列),转化感受态细菌DH5a,培养后提取质粒;采用酶切、测序鉴定所提取质粒。利用脂质体法将构建的质粒转染入宫颈癌HeLa细胞中进行后续实验。实验共分4组：HeLa(空白对照)组、pGenesil-IK1组、pGenesil-IK2组、pGenesil-HK(阴性对照)组。转染后48h提取各组细胞总RNA,以荧光定量PCR方法检测转染前后HeLa细胞株IKCal mRNA的变化。转染后48h提取各组细胞的总蛋白,以Western Blotting法检测转染前后IKCal蛋白表达情况,计算蛋白表达抑制率。利用WST-1检测HeLa细胞增殖情况并绘制生长曲线。用流式细胞术分析细胞周期变化并计算细胞增殖指数PI。结果：经酶切和测序鉴定显示IKCal shRNA真核表达载体构建成功。荧光定量PCR显示：pGenesil-IK1组、pGenesil-IK2组IKCal mRNA的表达较pGenesil-HK组、HeLa组均降低,差异有统计学意义(P1组下降更显著,能更好的抑制IKCal mRNA表达。Western Blotting结果显示：pGenesil-IK1组IKCal蛋白表达水平比pGenesil-HK组、HeLa组低(P0.05)。pGenesil-IK1组的蛋白表达抑制率为36.25%。WST-1检测结果显示,质粒pGenesil-IK1能有效抑制HeLa细胞增殖,与pGenesil-HK组、HeLa组比较差异有统计学意义(P0.05)。流式细胞术检测细胞周期发现,质粒pGenesil-IK1转染HeLa细胞后,Go／G1期细胞比率55.0±1.8%,S期细胞比率29.2±0.9%,与对照组比较差异有统计学意义(P1质粒的HeLa细胞增殖指数为44.97±1.75%,而空白对照组(HeLa)和质粒对照组(pGenesil-HK)增殖指数分别为502±0.1%,49.3±0.44%,均高于pGensil-IK1组,pGensil-IK1组与pGenesil-HK组和HeLa组差异具有显著性(P1能有效地抑制宫颈癌HeLa细胞株IKCal基因和蛋白的表达,并且可以抑制细胞增殖,使细胞周期停滞于Go／G1期。

关键词：子宫颈癌 HeLa细胞株钙激活性中电导钾离子通道 RNA干扰荧光定量PCR Western Blotting WST-1 流式细胞术