RNA干扰技术抑制宫颈癌HeLa细胞IKCa1表达的研究

作     者：聂丹 

作者单位：泸州医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：毛熙光

授予年度：2010年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：子宫颈癌 HeLa细胞株 钙激活性中电导钾离子通道 RNA干扰 荧光定量PCR Western Blotting WST-1 流式细胞术 

摘      要：目的：探讨钙激活性中电导钾离子通道(IKCal)的RNA干扰表达载体对宫颈癌HeLa细胞株IKCal基因和蛋白表达的抑制效果以及对HeLa细胞生物学特性的影响。方法：根据短发夹RNA (shRNA)设计原则,设计两条针对IKCal基因的干扰序列和一条非特异性阴性对照序列,并将其定向克隆入真核表达载体pGenesil-1.1中。得到三种质粒pGenesil-IK1(携带干扰序列1)、pGenesil-IK2(携带干扰序列2)、pGenesil-HK(携带非特异性阴性对照序列),转化感受态细菌DH5a,培养后提取质粒;采用酶切、测序鉴定所提取质粒。利用脂质体法将构建的质粒转染入宫颈癌HeLa细胞中进行后续实验。实验共分4组：HeLa(空白对照)组、pGenesil-IK1组、pGenesil-IK2组、pGenesil-HK(阴性对照)组。转染后48h提取各组细胞总RNA,以荧光定量PCR方法检测转染前后HeLa细胞株IKCal mRNA的变化。转染后48h提取各组细胞的总蛋白,以Western Blotting法检测转染前后IKCal蛋白表达情况,计算蛋白表达抑制率。利用WST-1检测HeLa细胞增殖情况并绘制生长曲线。用流式细胞术分析细胞周期变化并计算细胞增殖指数PI。结果：经酶切和测序鉴定显示IKCal shRNA真核表达载体构建成功。荧光定量PCR显示：pGenesil-IK1组、pGenesil-IK2组IKCal mRNA的表达较pGenesil-HK组、HeLa组均降低,差异有统计学意义(P0.05)。pGenesil-IK1组的蛋白表达抑制率为36.25%。WST-1检测结果显示,质粒pGenesil-IK1能有效抑制HeLa细胞增殖,与pGenesil-HK组、HeLa组比较差异有统计学意义(P0.05)。流式细胞术检测细胞周期发现,质粒pGenesil-IK1转染HeLa细胞后,Go／G1期细胞比率55.0±1.8%,S期细胞比率29.2±0.9%,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。经计算细胞增殖指数PI后发现：转染了pGensil-IK1质粒的HeLa细胞增殖指数为44.97±1.75%,而空白对照组(HeLa)和质粒对照组(pGenesil-HK)增殖指数分别为502±0.1%,49.3±0.44%,均高于pGensil-IK1组,pGensil-IK1组与pGenesil-HK组和HeLa组差异具有显著性(P0.05)。结论：所构建的IKCal shRNA真核表达载体pGenesil-IK1能有效地抑制宫颈癌HeLa细胞株IKCal基因和蛋白的表达,并且可以抑制细胞增殖,使细胞周期停滞于Go／G1期。