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wrky1转录因子对柑橘褪绿矮缩病毒致病相关蛋白诱导的本生烟细胞死亡的调控研究

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WRKY1转录因子对柑橘褪绿矮缩病毒致病相关蛋白诱导的本生烟细胞...

作者：秦阳阳西南大学

学位级别：硕士

双生病毒是一大类的植物病毒,其基因组为单链环状DNA,20世纪出现的双生病毒新种引起的严重流行病,对棉花、谷物、豆类和番茄等作物的生产造成了严重的影响。随着高通量测序技术的发展,研究人员从柑橘、桑树、苹果等木本植物也陆续检测... 详细信息

双生病毒是一大类的植物病毒,其基因组为单链环状DNA,20世纪出现的双生病毒新种引起的严重流行病,对棉花、谷物、豆类和番茄等作物的生产造成了严重的影响。随着高通量测序技术的发展,研究人员从柑橘、桑树、苹果等木本植物也陆续检测到了新的双生病毒种类。柑橘褪绿矮缩病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDa V)是从柑橘上分离的一种单组份的DNA病毒,为双生病毒科的新属Citlodavirus,给我国柑橘产业造成了巨大的潜在风险。双生病毒编码的一些蛋白对病毒与宿主植物的相互作用至关重要,然而目前对CCDa V的研究主要集中在分离鉴定和基因组测序,而致病机理尚不明确。本文在筛选、鉴定CCDa V致病相关蛋白的基础上,针对转录因子wrky1对致病相关蛋白在本生烟上引起的超敏反应(HR)型细胞死亡的调控反应进行了初步研究。主要结果如下:*** V致病相关蛋白的筛选与鉴定为了筛选鉴定CCDa V的致病相关蛋白,本研究将CCDa V编码6个蛋白的全长序列构建到含有GFP的(Potato virus X(PVX)载体中,症状观察表明在浸润第5天时,仅有接种RepA-GFP和Rep-GFP的本生烟出现叶片坏死症状。进一步通过3,3’二氨基苯胺(DAB)实验和电解质渗漏实验,结果表明RepA和Rep可以诱导HO积累,并提高离子渗透率,由此证实CCDa V编码的蛋白可引起本生烟产生HR型细胞坏死。另外本研究通过使用PVX载体表达RepA和Rep,排除了GFP可能对RepA和Rep诱导本生烟叶片坏死的影响。通过酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)证明,PVX含量的差异与RepA在本生烟上引起HR型细胞坏死症状无关。进一步将CCDa V 6个ORFs构建到双元重组载体p Nm GFPer中,发现表达RepA和Rep的在本生烟上均出现局部坏死症状。综上所述,CCDa V的6个ORFs中的Rep和RepA为致病相关蛋白,且可诱导本生烟出现HR型细胞坏死反应。***诱导超敏反应(HR)型细胞死亡关键区域的鉴定为了探索RepA中诱导的本生烟HR型细胞坏死的关键结构域,本研究利用生物信息学分析RepA的序列和结构域,构建了8个RepA的缺失突变体(RepA),并利用农杆菌介导在本生烟中瞬时表达。结果表明,RepA的滚环复制基序(aa16-20,aa57-63和aa103-108)是诱导本生烟HR反应所必需的。另外,亚细胞定位实验结果表明,RepA和含有滚环复制基序的缺失突变体(RepA、RepA)均定位于本生烟表皮细胞核中,而不含有滚环复制基序的缺失突变体(RepA)主要定位于细胞质中。将定位结果和症状联合起来进行分析,推测RepA的核定位可能与其诱导的本生烟HR反应有关。此外PSORT在线软件预测未发现与核定位信号序列一致的碱性氨基酸,提示存在非典型核定位信号。***诱导的植物抗性反应为了进一步确定RepA诱导的HR和本生烟免疫应答之间的关联,本研究通过RT-q PCR检测发现,瞬时表达RepA的本生烟中对水杨酸(Salicylic acid,SA),茉莉酸(Jasmonic acid,JA)通路关键基因(Nb PR1,Nb PR2,Nb PR3,Nb PR4和Nb PR5,Nb NPR1)的表达水平进行测定显著升高,但是乙烯(Ethylene,ET)通路中Nb ERF1的表达量无显著变化。为了探究RepA诱导的HR反应是否能激发植物对其它种类病毒的抗性,本研究将番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)侵染性克隆分别与含有表达35s-GFP或RepA-GFP的农杆菌共浸润到本生烟中,结果显示RepA可以减轻TYLCV引起的本生烟叶片卷曲症状。为了验证病毒编码蛋白是否可以抑制HR反应,本研究将CCDa V编码的其他蛋白(V1、V2、V3、V4和Rep)与RepA蛋白在本生烟上共同表达,结果显示其他CCDa V蛋白都不能抑制RepA诱导的HR型细胞死亡反应。***1对RepA诱导的HR型细胞死亡的调控作用为了评估wrky1,NPR1,AOX,COI,CTR,NDR1,RAR1,NTF6和MEK2是否参与了RepA诱导的HR型细胞死亡反应,利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)载体在本生烟中沉默了信号级联组件,在沉默第9天时,将RepA-GFP接种在沉默本生烟植株中,并在接种的第3天时观察表型,结果发现成功沉默wrky1后接种RepA的本生烟无坏死症状出现,用RT-q PCR检测浸润RepA-GFP的本生烟叶片中Nb wrky1的表达水平,结果显示RepA

关键词：柑橘褪绿矮缩病毒复制相关蛋白细胞死亡 wrky1

HIS1-3和wrky1基因协同调节植物盐胁迫响应的机制研究

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HIS1-3和WRKY1基因协同调节植物盐胁迫响应的机制研究

作者：吴席合肥工业大学

学位级别：硕士

迄今为止,全球范围内有大量的盐碱化土地;在我国同样也有着大量的盐碱化土地。盐胁迫是自然界中主要的几种非生物胁迫之一,对植物生长造成严重损害,且对生态环境的稳定造成威胁,因此研究植物对盐胁迫响应的机制具有重要意义。本实验室... 详细信息

迄今为止,全球范围内有大量的盐碱化土地;在我国同样也有着大量的盐碱化土地。盐胁迫是自然界中主要的几种非生物胁迫之一,对植物生长造成严重损害,且对生态环境的稳定造成威胁,因此研究植物对盐胁迫响应的机制具有重要意义。本实验室的前期研究中发现HIS1-3基因负调控植物对盐胁迫的响应,而wrky1基因正调控植物对盐胁迫的响应。本研究进一步证实HIS1-3和wrky1基因协同调控植物对盐胁迫的响应。主要研究结果如下:1.q RT-PCR分析显示,Na Cl处理下,野生型拟南芥(WT)中HIS1-3基因的表达量随着盐处理时间的增加而下降,此外his1-3突变体对盐胁迫表现耐受,而HIS1-3OE过表达植株对盐胁迫表现敏感,表明HIS1-3基因负调节植物对盐胁迫的响应。*** Cl处理后,his1-3突变体中根和茎的钠离子含量比WT高,而HIS1-3OE过表达植株中根和茎的钠离子含量比WT低,表明HIS1-3基因通过调节植株体内钠离子含量来调控植株对盐胁迫的响应。3.盐胁迫条件下,his1-3突变体中SOS1和SOS2基因的转录水平较WT高,HIS1-3OE过表达植株中SOS1和SOS2基因的表达量要比WT中低,结果说明,盐胁迫下,HIS1-3基因可能通过SOS途径调节植株体内的钠离子含量,进而增强植物的对盐胁迫的抗性。4.利用烟草瞬时表达系统分析,发现wrky1可激活SOS1,SOS2和SOS3的转录活性,而HIS1-3能够抑制wrky1对SOS1和SOS2基因表达的激活。5.进一步通过酵母双杂交实验发现HIS1-3和wrky1基因并无相互作用,表明HIS1-3基因可能通过SOS1和SOS2的启动子上的占位来调节wrky1对SOS1和SOS2基因转录活性,进而影响植物对盐胁迫的响应。6.通过染色质免疫共沉淀的方法发现HIS1-3可以直接结合到SOS1和SOS2的启动子上,说明HIS1-3通过直接结合到SOS1和SOS2的启动子上,进行转录负调控。同样,发现wrky1也直接结合到SOS1,SOS2和SOS3的启动子上,从而正调控SOS1,SOS2和SOS3基因的转录活性。综上所述,在正常生理条件下,HIS1-3会结合于SOS1和SOS2基因的启动子上,占据了wrky1与SOS1和SOS2基因启动子结合的结合位点;在盐胁迫状态下,外界盐胁迫的影响会导致HIS1-3基因降低表达量,从而SOS1和SOS2基因启动子暴露出来,而此时wrky1基因作为转录因子,直接结合到SOS1,SOS2和SOS3基因的启动子上,启动SOS1,SOS2和SOS3基因的表达。SOS1作为钠离子转运蛋白,会将植株体内多余的钠离子排出体外,减少过多钠离子对植株的毒害,从而使植株产生耐盐现象。

关键词： HIS1-3 wrky1 拟南芥盐胁迫 SOS途径

HvMPK4 phosphorylates Hvwrky1 to enhance its suppression of barley immunity to powdery mildew fungus

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Journal of Genetics and Genomics 2024年第3期51卷 313-325页

作者： Pengya Xue Ling Zhang Renchun Fan Yanan Li Xinyun Han Ting Qi Lifang Zhao Deshui Yu Qian-Hua Shen State Key Laboratory of Plant Cell and Chromosome Engineering Institute of Genetics and Developmental BiologyInnovation Academy for Seed DesignChinese Academy of SciencesBeijing 100101China CAS Center for Excellence in Biotic Interactions College of Advanced Agricultural SciencesUniversity of Chinese Academy of SciencesBeijing 100049China Department of Nutritional Sciences&Toxicology University of CaliforniaBerkeleyCA 94720USA Lushan Botanical Garden Chinese Academy of ScienceJiujiangJiangxi 332900China

Mitogen-activated protein kinase(MAPK)cascades play important roles in disease resistance in model plant ***,the functions of MAPK signaling pathways in crop disease resistance are largely *** we report the function of HvMKK1-HvMPK4-Hvwrky1 module in barley immune ***4 is identified to play a negative role in barley immune response against Bgh,as virus-induced gene silencing of HvMPK4 results in enhanced disease resistance whilst stably overexpressing HvMPK4 leads to super-susceptibility to Bgh ***,the barley MAPK kinase HvMKK1 is found to specifically interact with HvMPK4,and the activated HvMKK1^(DD) variant specifically phosphorylates HvMPK4 in ***,the transcription factor Hvwrky1 is identified to be a downstream target of HvMPK4 and phosphorylated by HvMPK4 in vitro in the presence of HvMKK1^(DD).Phosphorylation assay coupled with mutagenesis analyses identifies S122,T284,and S347 in Hvwrky1 as the major residues phosphorylated by ***1 is phosphorylated in barley at the early stages of Bgh infection,which enhances its suppression on barley immunity likely due to enhanced DNA-binding and transcriptional repression *** data suggest that the HvMKK1-HvMPK4 kinase pair acts upstream of Hvwrky1 to negatively regulate barley immunity against powdery mildew.

关键词： Barley MPK4 wrky1 Phosphorylation Disease resistance Powdery mildew

香蕉Mawrky1转录因子在果实和幼苗诱导抗冷性中表达分析

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热带作物学报 2021年第2期42卷 303-309页

作者：洪克前谷会陈丽中国热带农业科学院南亚热带作物研究所/海南省热带园艺产品采后生理与保鲜重点实验室广东湛江524091

为了探究香蕉Mawrky1转录因子在抗冷诱导过程中的作用,采用外源过氧化氢(H_(2)O_(2))、茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)和丙烯(propylene)等处理香蕉果实,同时采用外源H_(2)O_(2)、MeJA和脱落酸(ABA)等处理香蕉幼苗,处理结束后,将实验材... 详细信息

为了探究香蕉Mawrky1转录因子在抗冷诱导过程中的作用,采用外源过氧化氢(H_(2)O_(2))、茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)和丙烯(propylene)等处理香蕉果实,同时采用外源H_(2)O_(2)、MeJA和脱落酸(ABA)等处理香蕉幼苗,处理结束后,将实验材料放置于7℃下贮藏,通过Northern blot技术分析实验材料中Mawrky1基因表达变化。H_(2)O_(2)、MeJA、SA和propylene等处理均使果实冷害症状推迟2 d出现;处理组果实中Mawrky1 mRNA积累均早且高于对照组。H_(2)O_(2)、MeJA和ABA等处理也均使幼苗推迟18 h显现冷害症状;处理组幼苗中Mawrky1基因表达提前且表达量相对较高。相比较这几种外源性调节剂,MeJA和H_(2)O_(2)处理的香蕉果实和幼苗所获得的抗冷效果优于其他生长调节剂,同时Mawrky1基因表达水平也比其他处理组提前或表达量更高,推测Mawrky1可能更加积极响应MeJA或H_(2)O_(2)诱导香蕉耐冷性。

关键词：香蕉 wrky1 转录因子耐冷性

茄子Smwrky1转录因子基因克隆及序列分析

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中国农学通报 2014年第10期30卷 124-128页

作者：邵帅赵福宽徐岭贤北京农学院生物科学与工程学院北京102206

克隆茄子转录因子Smwrky1基因,对其序列进行分析,为Smwrky1基因在茄子抗逆分子育种的应用中提供理论依据。以茄子幼苗为试材,依据GenBank上已提交的番茄、甜椒、烟草的wrky基因序列设计引物,提取总RNA利用RT-PCR方法扩增得到基因片段,... 详细信息

克隆茄子转录因子Smwrky1基因,对其序列进行分析,为Smwrky1基因在茄子抗逆分子育种的应用中提供理论依据。以茄子幼苗为试材,依据GenBank上已提交的番茄、甜椒、烟草的wrky基因序列设计引物,提取总RNA利用RT-PCR方法扩增得到基因片段,克隆、测序并通过NCBI在线和DNAMAN等软件对其核酸及氨基酸序列进行分析。同源克隆得到Smwrky1,核酸序列930 bp,翻译为310个氨基酸组成的蛋白序列,其中Ser和Thr量最多,分别占总氨基酸数的12.0%和11.0%。NCBI检索Smwrky1属于wrky基因超家族,第114至120个氨基酸含有wrky保守结构域"wrkyGQK",其锌指结构为C2H2型,初步证实Smwrky1属于第二大类wrky转录因子。DNAMAN构建茄子Smwrky1与不同植物wrky蛋白的系统发育树,表明茄子wrky1与番茄中的wrky1蛋白亲缘关系最近,同源性达96%。wrky基因在植物耐逆性的研究中有着重要的作用,通过克隆出Smwrky1基因片段,为进一步克隆其全长、研究其功能做前期准备,为分子育种、培育茄子耐逆性新品种奠定了一定的基础。

关键词：茄子 wrky1 基因克隆序列分析

桑花叶型矮缩相关病毒的RepA蛋白在烟草上诱导细胞死亡的机理研究

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桑花叶型矮缩相关病毒的RepA蛋白在烟草上诱导细胞死亡的机理研究

作者：孙少双中国农业科学院

学位级别：硕士

双生病毒是一类具有孪生颗粒形态的单链环状DNA病毒,广泛分布于全球50多个国家和地区,对番茄、木薯、棉花等多种草本植物造成毁灭性危害。近年来,随着高通量测序技术的发展,研究者们不断地从柑橘、葡萄、桑树和苹果等多种多年生木本植... 详细信息

双生病毒是一类具有孪生颗粒形态的单链环状DNA病毒,广泛分布于全球50多个国家和地区,对番茄、木薯、棉花等多种草本植物造成毁灭性危害。近年来,随着高通量测序技术的发展,研究者们不断地从柑橘、葡萄、桑树和苹果等多种多年生木本植物中检测到了新的双生病毒。由于基因组比较小,编码的遗传信息有限,双生病毒需要依赖与植物复杂的相互作用才能完成复制、转录和移动等生活史。因此,研究双生病毒与植物的互作对于了解植物抵御病毒侵染的机制以及病毒的致病机理具有重要作用。桑花叶型矮缩相关病毒(Mulberry mosaic dwarf-associated virus,MMDaV)是从表现花叶和矮缩的桑树上分离的一种单组份双生病毒。由于生物学特性以及致病机理尚不明确,MMDaV被国际病毒分类委员会划分为双生病毒科的一个暂定种。本论文充分利用研究植物与病毒互作的模式植物——本氏烟,对MMDaV与植物的相互作用开展了以下研究:首先构建了MMDaV的侵染性克隆并将其接种本氏烟,发现MMDaV的侵染性克隆接种3天后在本氏烟上引起了类似过敏性反应的细胞死亡。进一步将MMDaV病毒链上编码的V1、V2、V3、V4和V5以及互补链上编码的C1(RepA)和C2(Rep)构建到含有GFP标签的植物双元表达载体,利用农杆菌介导的瞬时表达方法浸润本氏烟,发现MMDaV编码的RepA的表达在本氏烟上诱导了细胞死亡。为了明确RepA引起细胞死亡的相关功能域,利用生物信息学对RepA的序列和结构域进行了分析,构建了RepA的8个缺失突变体。通过农杆菌介导的瞬时表达试验,发现RepA的RCA motif是RepA在本氏烟上诱导细胞死亡所必需的。进一步利用激光共聚焦显微镜对RepA及其突变体的亚细胞定位进行分析,发现RepA定位于本氏烟表皮细胞的细胞核中,并且RepA的细胞核定位可能与其诱导的细胞死亡有关。在植物中,MAPK级联反应和茉莉酸等信号途径参与了植物对多种病原物的抗性。为了筛选参与RepA诱导的细胞死亡的寄主因子,利用病毒诱导的基因沉默技术对本氏烟中的NDR1、RAR1、COI1、CTR1、NTF6、wrky1、NPR1和MEK2等8个基因进行沉默,之后在相应基因沉默的烟草上瞬时表达RepA,发现NDR1、RAR1、COI1、CTR1、NTF6、NPR1和MEK2等7个基因的沉默不影响RepA引起的细胞死亡的产生,而wrky1沉默后抑制了RepA引起的细胞死亡。进一步在wrky1沉默的植物上接种MMDaV的侵染性克隆,发现wrky1的沉默也抑制了MMDaV侵染引起的细胞死亡。利用实时荧光定量PCR分析了RepA以及MMDaV接种后wrky1的基因表达情况,发现RepA的表达或者MMDaV的侵染均显著上调了wrky1的表达,推测MMDaV的RepA通过激活wrky1的表达而引起了细胞死亡反应。

关键词：桑花叶型矮缩相关病毒 RepA 细胞死亡 wrky1

三七地上茎4个转录因子基因转录水平的纵向变化及其与总三萜皂苷含量的关系

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贵州农业科学 2020年第5期48卷 31-36页

作者：臧灵飞张洪玲杨迪赵鹏宇赵昶灵李桂琼古朝山张优顾凡陈杞临云南农业大学农学与生物技术学院云南昆明650201 云南省热带作物科学研究所云南景洪666100 上海理工大学环境与建筑学院上海200093

为三七绿紫茎三萜皂苷合成转录调控机理提供参考,将彻底长成的绿紫茎均分为18段,用实时荧光定量PCR检测茎段的三七碱性螺旋-环-螺旋蛋白基因(bHLH)、乙烯响应因子基因(ERF)、v-myb骨髓母细胞增多症病毒癌基因同源物基因(MYB)和wrky1蛋... 详细信息

为三七绿紫茎三萜皂苷合成转录调控机理提供参考,将彻底长成的绿紫茎均分为18段,用实时荧光定量PCR检测茎段的三七碱性螺旋-环-螺旋蛋白基因(bHLH)、乙烯响应因子基因(ERF)、v-myb骨髓母细胞增多症病毒癌基因同源物基因(MYB)和wrky1蛋白基因(wrky1)的转录水平,用香草醛-高氯酸比色法检测茎段的总三萜皂苷含量(TTSC),分析转录水平与TTSC间的Pearson相关性。结果表明:从三七绿紫茎的顶部到基部,三七bHLH、ERF、MYB和wrky1的转录水平分别呈波动式平缓上升、不规则7峰、波动幅度逐渐增大的6峰和具2个主峰的6峰曲线;TTSC呈V型曲线,最低TTSC出现在茎上部的黄金分割点处;4个转录因子基因的转录水平和TTSC在不同茎段间的差异均达到极显著水平,且转录水平与TTSC之间的Pearson相关系数分别为0.371、0.130、-0.169和-0.195。因此,与三七绿紫茎三萜皂苷合成相关的主要转录因子应为三七的碱性螺旋-环-螺旋蛋白,其次为乙烯响应因子。

关键词：三七绿紫茎 bHLH ERF MYB wrky1 转录水平总三萜皂苷相关性