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Control of de novo root regeneration efficiency by developmental status of Arabidopsis leaf explants

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Journal of Genetics and Genomics 2019年第3期46卷 133-140页

作者： Jing Pan Fei Zhao Guifang Zhang Yu Pan Lijun Sun Ning Bao Peng Qin Lyuqin Chen Jie Yu Yijing Zhang Lin Xu National Key Laboratory of Plant Molecular Genetics CAS Center for Excellence in Molecular Plant Sciences Shanghai Institute of Plant Physiology and Ecology Chinese Academy of Sciences University of Chinese Academy of Sciences School of Life Sciences Nantong University School of Public Health Nantong University Department of Instrument Science and Engineering Shanghai Jiao Tong University Departments of Neurosurgery Psychiatry and Behavioral Sci-ences Stanford University School of Medicine

De novo root regeneration(DNRR) has wide applications in agriculture such as those related to cutting technology. Detached Arabidopsis thaliana leaf explants can regenerate adventitious roots without added hormones. The regenerative ability is highly dependent on the developmental status of the leaf. An immature leaf has a higher regenerative ability, while a mature leaf is difficult to regenerate. Using RNASeq analysis, we showed that the expression levels of many genes, including those in the auxin network,changed during leaf maturation. Particularly, the expression levels of many YUCCA(YUC) genes in the auxin biosynthesis pathway are responsive to leaf maturation. Overexpression of YUC1 in the yuc-1 D dominant mutant rescued the rooting defects caused by leaf maturation. In addition, YUC4 expression levels were also affected by circadian rhythms. The regenerative ability was reduced in both immature and mature mutant leaf explants from the new wuschel-related homeobox 11-3(wox11-3) and wox12-3 mutant alleles created by the CRISPR/Cas9 method. Overall, the transcriptome and genetic data, together with the auxin concentration analysis, indicate that the ability to upregulate auxin levels upon detachment may be reduced during leaf maturation. Thus, multiple developmental and environmental signals may converge to control auxin accumulation, which affects the efficiency of the wox11/12-mediated DNRR from leaf explants.

关键词： De novo root regeneration wox11 Arabidopsis Developmental status Circadian rhythms YUCCA

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直接和间接芽再生之间调控机制的比较研究

直接和间接芽再生之间调控机制的比较研究

作者：刘炯慧山东农业大学

学位级别：硕士

在合适的外源激素条件下,高等植物能够再生茎尖分生组织,进而通过芽再生形成新的个体。茎尖分生组织的重建是植物细胞多能性的体现,是植物遗传转化和离体快繁的先决条件。研究发现,植物的芽再生可分为直接和间接两种类型。在间接芽再生... 详细信息

在合适的外源激素条件下,高等植物能够再生茎尖分生组织,进而通过芽再生形成新的个体。茎尖分生组织的重建是植物细胞多能性的体现,是植物遗传转化和离体快繁的先决条件。研究发现,植物的芽再生可分为直接和间接两种类型。在间接芽再生过程中,外植体先在富含生长素的愈伤组织诱导培养基(callusinducing medium)上诱导愈伤组织形成,然后转到富含细胞分裂素的芽诱导培养基(shoot-inducing medium)上诱导芽再生;而在直接芽再生过程中,侧根原基(lateral root primordia)可以不经过愈伤组织的产生直接转分化为茎尖分生组织,此过程无愈伤组织产生。然而两种芽再生类型调控机制之间的异同目前尚不清楚。本研究以萌发6天的拟南芥幼苗为材料,以下胚轴和根作为外植体,先在含有生长素NAA的培养基上培养48 h,然后转移至含有细胞分裂素2-i P的培养基中培养,使得经由愈伤组织间接芽再生和侧根原基直接芽再生两种体系可以在一个外植体上同时发生。随后我们利用激光扫描共聚焦显微镜对两种芽再生过程的形态结构进行观察。结果表明,两种芽再生过程中形态变化规律十分相似。不同之处在于与直接再生相比,间接再生形成的茎尖分生组织基部较宽,从而在随后的培养过程中产生了体积较大的茎尖分生组织。q RT-PCR结果显示,激素信号转导相关基因AUXIN RESPONSE FACTOR 5(ARF5)和ARABIDOPSIS RESPONSR REGULATOR 1(ARR1),以及干细胞关键调控基因LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN 16(LBD16)、PLETHORA 1(PLT1)、SCARECROW(SCR)、WUSCHEL RELATED HOMEOBOX 5(wox5)和WUSCHEL(WUS)的转录水平在两种芽再生过程之间未发生显著差异。利用报告株系的分析发现,wox5、WUS、SCR和ARR1在两种芽再生过程之间表现出相似的表达模式。然而wox11在两种再生过程中存在差异。在芽的间接再生过程中,表达wox11的起始细胞数量较多,从而形成体积较大的茎尖分生组织;而在直接再生过程中,表达wox11的起始细胞数量较少,因而产生体积较小的茎尖分生组织。进一步的研究发现,在DOMAINS REARRANGED METHYLTRANSFERASE 1(DRM1)、DRM2和CHROMOMETHYLASE 3(CMT3)基因突变造成的非CG位点DNA甲基化几乎完全消失的drm1 drm2 cmt3(ddc)三突变体中,芽的直接再生能力增强,且直接再生芽过程中wox11表达水平较野生型显著上调;而芽的间接再生能力和间接芽再生过程中wox11转录水平与野生型相比均无明显改变。重亚硫酸盐测序表明DRM1、DRM2和CMT3基因的突变特异性地影响了直接芽再生过程中非CG位点DNA甲基化,但对间接芽再生途径无影响。本研究发现表达wox11的起始细胞数量与芽再生的类型密切相关,非CG位点DNA甲基化特异性地调节直接芽再生过程中wox11的表达,对间接芽再生过程没有影响。研究结果为理解器官再生过程中细胞命运转变的调控机制提供了新的信息。

关键词：直接再生间接再生 wox11 DNA甲基化

杨树Prowox11启动子克隆及组织特异表达分析

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分子植物育种 2017年第11期15卷 4405-4410页

作者：胥猛谢雯凡潘惠新黄敏仁南京林业大学南方现代林业协同创新中心南京210037 南京林业大学林学院南京210037

作为拟南芥At wox11的同源基因,杨树Pe wox11a和Pe wox11b基因在不定根发生及形态建成过程中发挥重要重要。过表达的Pe wox11a和Pe wox11b转基因杨树不仅不定根数量显著增加,而且在茎和叶上产生大量异位根;同时,两者的过表达也影响转基... 详细信息

作为拟南芥At wox11的同源基因,杨树Pe wox11a和Pe wox11b基因在不定根发生及形态建成过程中发挥重要重要。过表达的Pe wox11a和Pe wox11b转基因杨树不仅不定根数量显著增加,而且在茎和叶上产生大量异位根;同时,两者的过表达也影响转基因杨树腋芽和叶片的发育。为了深入探究两者之间的时空表达调控模式及其生物学功能,本研究克隆和鉴定了Pe wox11a和Pe WO11b基因的启动子序列,1 953 bp长度的Pro wox11a和1 772 bp长度的Pro wox11b。两个基因的启动子序列均含有多个植物激素的应答元件或结合位点。启动子GUS表达载体构建及遗传转化分析表明,Pro wox11a启动子驱动GUS基因在根原基启动及随后发育早期的分生组织中特异表达,而Pro wox11b启动子驱动GUS基因在不定根发生的重要区域下胚轴特异表达。

关键词：启动子分析 wox11 不定根发育特异表达

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乙烯调控拟南芥根从头再生的分子机制研究

乙烯调控拟南芥根从头再生的分子机制研究

作者：姚璐璐南京师范大学

学位级别：硕士

离体的植物器官具有强大的能力,可以从剩余组织的部分再生新的器官,然后形成一个完整的植物。例如,拟南芥叶片外植体可以在不经任何外源激素处理下从切割部位再生出不定根。这个过程被称为根从头再生(de novo root regeneration)。然而... 详细信息

离体的植物器官具有强大的能力,可以从剩余组织的部分再生新的器官,然后形成一个完整的植物。例如,拟南芥叶片外植体可以在不经任何外源激素处理下从切割部位再生出不定根。这个过程被称为根从头再生(de novo root regeneration)。然而,根从头再生过程中潜在的精确调控机制还不完全清楚。正如老年人的组织修复能力下降一样,植物的再生能力也随着年龄的增长而下降。已知离体的拟南芥叶片外植体随着年龄的增长,其再生出不定根的能力将逐渐下降。气体激素乙烯长期以来被认为是一种植物衰老激素,能够协同植物体内、体外信号,促进叶片的衰老。在本课题研究中,我们将探究植物再生率随其年龄降低的原因,进一步研究是否与植物激素乙烯有关系。首先,我们观察到植物激素乙烯处理以及乙烯信号通路核心转录因子ETHYLENE INSENSITIVE 3(EIN3)的转录活性提高都可以对根从头再生效率起到强烈抑制作用,相反在缺乏EIN3及其同源蛋白EIL1的乙烯不敏感双重突变体(ein3 eil1)中则表现出更高的根从头再生能力。先前的研究报道表明,根从头再生体系的建立需要WUSCHEL RELATED HOMEOBOX 11(wox11)/wox12和wox5/wox7两组基因的连续诱导表达。进一步研究发现EIN3蛋白直接结合在wox11和wox5基因的启动子区域并抑制其转录。此外,年老的植物展现出EIN3转录和活性的提高,且抑制了wox11和wox5的表达。与此同时,我们观察发现在22天大小野生型植物的叶片外植体中根从头再生效率显著下降,然而在ein3 eil1突变体中,30天大小植物的叶片外植体仍然呈现较高的根从头再生效率。综上所述,这些结果表明,植物年龄利用EIN3作为负调控因子,在某种程度上通过抑制wox基因的活化,来实现对根从头再生的抑制。

关键词： EIN3 wox11 wox5 转录抑制根从头再生

油菜素内酯和糖信号交叉调控植物干细胞命运决定机理研究

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油菜素内酯和糖信号交叉调控植物干细胞命运决定机理研究

作者：苏鑫山东大学

学位级别：硕士

植物干细胞与动物干细胞类似,调控着生命个体的形态建成。但不同之处在于植物采用了胚胎后形态建成模式,通过感知外界环境来调节自己器官的发生、发育、休眠和衰老等过程去适应环境。因此对植物来说,其干细胞的功能更为直接和重要。按... 详细信息

植物干细胞与动物干细胞类似,调控着生命个体的形态建成。但不同之处在于植物采用了胚胎后形态建成模式,通过感知外界环境来调节自己器官的发生、发育、休眠和衰老等过程去适应环境。因此对植物来说,其干细胞的功能更为直接和重要。按照个体发育的先后顺序,植物干细胞包括胚胎期的顶端干细胞、胚胎后期的侧生干细胞和再生过程中体细胞命运转变所建立的再生干细胞。这些不同类型的干细胞调控了植物的形态建成以及对环境的适应性。因此,为了进一步研究植物干细胞命运决定的分子机理,本论文主要围绕油菜素内酯（BR）和糖信号两种信号通路,以BR下游转录因子BRASSINAZOLE-RESISTANT1（BZR1）和糖信号下游重要激酶Target of Rapamycin（TOR）为重点研究分子,以主根和不定根为研究对象,阐明二中信号分子调控干细胞命运决定的分子机制。实验结果包括以下两个方面:1,糖信号和油菜素内酯协同调控根尖静止中心（QC）细胞分裂:研究发现糖促进QC分裂。无糖条件下,QC分裂率为4%,而在1%、3%和5%蔗糖浓度下,QC分裂率明显增加,依次为35%、48%和60%。同样浓度的非代谢糖对QC分裂率无影响。说明糖分子参与QC干细胞分裂活性的调控并非由渗透作用引起,而与糖信号通路有关。进一步发现TOR激酶突变体tor中QC分裂率降低50%左右,HXK1激酶突变体gin2-1中QC分裂率仅降低20%左右,说明糖促进QC分裂需要TOR和HXK1激酶,且TOR激酶更为重要。用外源BL处理发现其可恢复tor少QC分裂表型,进一步将BR信号增强突变体bzr1-1D杂交到tor中,同样可以恢复tor少QC分裂表型。而且发现BR受体缺失突变体bril-301对糖不敏感,而bzr1-1D对糖超敏感,进一步证实糖信号调控QC干细胞分裂活性依赖于BR信号。在分子水平,发现糖可以抑制BZR1蛋白在根尖干细胞中降解。TOR激酶抑制剂AZD处理,wox5的表达量降低,说明TOR的激酶活性可以促进wox5表达;且在同样处理的条件下,bzr1-1D中wox5的表达量要高于野生型中wox5的表达,暗示在TOR激酶失活时,虽然自噬途径打开,但bzr1-1D中的BZR1蛋白由于位于核内而不被降解,仍能促进wox5表达。说明糖信号通过下游TOR激酶,抑制BR下游BZR1蛋白降解,提高QC细胞中wox5的表达,从而促进QC分裂。该研究首次阐明糖作为信号分子促进根尖干细胞的分裂依赖于BR信号,为根尖干细胞活性的研究提供了新的线索。2,糖信号和油菜素内酯都调控不定根形成:不定根是植物在离体受伤后,体内具有干细胞活性的原形成层细胞经过分裂分化在伤口处形成的根器官。研究发现糖信号促进不定根形成需要TOR和HXK1激酶;而高浓度BL以及BR下游转录因子BZR1明显延迟和抑制不定根形成。在分子水平,发现BZR1抑制不定根起始基因wox11及wox12的表达。在遗传学上观察到35S::wox11部分恢复bzr1-1D少不定根形成的表型,说明BZR1位于wox11上游调控不定根形成。通过SEM扫描电镜观察及WIND家族基因qRT-PCR分析,目前认为bzr1-1D伤口处的白色细胞团可能不是愈伤组织。但是,关于BR和糖信号是否相互协调共同参与不定根的形成还有待进一步验证。此研究是在体外离体的条件下进行的,表明BZR1转录因子参与了体外离体再生过程,而且是负调控因子。

关键词： QC（静止中心） BZR1 TOR激酶不定根 wox11

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生长素调控拟南芥不定根再生的分子机制研究

生长素调控拟南芥不定根再生的分子机制研究

作者：温绍廷上海师范大学

学位级别：硕士

根是植物重要的营养器官,可以帮助植物固着在土壤中,同时可以储藏养分、吸收水分、运输物质以供植物体的生长发育。高等植物的根系主要包括主根、侧根和不定根。主根来源于种子中的胚根;侧根和不定根都是胚后发育的产物。侧根是指主根... 详细信息

根是植物重要的营养器官,可以帮助植物固着在土壤中,同时可以储藏养分、吸收水分、运输物质以供植物体的生长发育。高等植物的根系主要包括主根、侧根和不定根。主根来源于种子中的胚根;侧根和不定根都是胚后发育的产物。侧根是指主根上产生的根,不定根可以产生于不同的部位,来源于不同的细胞。植物激素生长素可以促进不同根的发生,但是生长素如何促进不同不定根的起始还不清楚。本文利用模式植物拟南芥,建立了不同类型不定根的培养体系,分析了生长素促进侧根和不定根起始过程中关键基因的的突变体,在不同部位产生不定根的表型。并通过不定根发生过程中细胞命运转变的分子marker对不同类型不定根进行细胞谱系追踪。研究表明,激活型生长素响应因子ARF6/8/7/19(AUXIN RESPONSE FACTOR6/8/7/19)冗余促进不定根的再生,并参与再生潜能细胞向根创始细胞的细胞命运转变过程。生长素促进侧根发生的IAA14(INDOLE-3-ACETIC ACID INDUCIBLE 14)-ARF7/19模块参与下胚轴自发不定根和不定侧根的发生,但较弱的参与到离体叶片再生不定根的过程中。促进离体叶片不定根再生的wox11/12(WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX 11/12)-wox5/7和wox11/12-LBD16(LATERAL ORGAN BOUNDARI ES-DOMAIN 16)模块参与下胚轴自发不定根的发生,而wox11/12并不参与下胚轴伤口和主根伤口处诱导的不定根的产生。参与不定根再生的ARF6/8/7/19也参与到下胚轴伤口不定根和土壤中不定侧根的发生。wox11在不同类型不定根的起始过程中均有所表达,暗示着wox11可能是普适的参与不定根再生的转录因子。综上,生长素参与到不同类型不定根的再生过程中,但参与不同类型不定根的生长素相应因子不同。不同部位不定根的再生所采取的策略也不同。

关键词：生长素响应因子不定根再生 wox11 根系下胚轴

EIN3 suppresses plants de novo root regeneration from leaf explants and mediates age-regulated regeneration decline

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EIN3 suppresses plants de novo root regeneration from leaf e...