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鸡wdr5基因真核表达载体构建及对PGCs形成相关基因表达的影响

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2021年第10期49卷 9-14,23页

作者：张晨左其生邹艺琛赵娟娟张亚妮李碧春扬州大学动物科学与技术学院农业科技发展研究院教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室江苏扬州225009

【目的】对鸡色氨酸天冬氨酸重复域5(WD repeat domain 5,wdr5)进行生物信息学分析,构建真核表达载体,并检测其对原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)形成相关基因表达的影响,探索wdr5在鸡PGCs形成中的调控作用。【方法】利用Prot... 详细信息

【目的】对鸡色氨酸天冬氨酸重复域5(WD repeat domain 5,wdr5)进行生物信息学分析,构建真核表达载体,并检测其对原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)形成相关基因表达的影响,探索wdr5在鸡PGCs形成中的调控作用。【方法】利用ProtParam、NCBI保守结构域分析、Uniport、TMHMM Server v.2.0和SignalP在线网站,分析wdr5的氨基酸序列、保守结构域、亲疏水性、跨膜结构域和信号肽表达。利用SWISS-MODEL进行同源建模预测其三级结构,借助String网站进行互作蛋白的预测。构建重组载体pcDNA3.1-wdr5-GST,进行双酶切和测序鉴定;将重组载体pcDNA3.1-wdr5-GST转染PGCs,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot检验wdr5重组蛋白在PGC中的表达情况;用RT-qPCR检测过表达wdr5对PGCs形成相关基因(DDX4、C-KIT、BLIMP1、LIN28B和PRDM14)表达水平的影响。【结果】wdr5蛋白含有1个高度保守的WD40结构域,内含7个典型的WD40重复序列;其亲水性高、不含跨膜结构域、无信号肽表达,可用于构建重组真核表达载体。同源建模和互作蛋白预测显示wdr5高度保守,互作蛋白为类ASH2蛋白(ASH2 Like,ASH2L)、RB结合蛋白5(RB Binding Protein 5,RBBP5)、DPY30和KAT8调控因子NSL复合物亚基3(KAT8 Regulatory NSL Complex Subunit 3,KANSL3)。双酶切和测序结果表明,重组载体pcDNA3.1-wdr5-GST构建成功。RT-qPCR结果显示PGC中重组载体可使wdr5过量表达;Western blot结果表明,PGC中可表达重组蛋白。wdr5过表达可使PGCs形成相关基因的表达水平升高。【结论】构建的wdr5重组载体在鸡PGCs中能够表达;wdr5基因表达上调后,PGCs形成相关基因表达水平升高,推测其可调控鸡PGCs的形成。

关键词： wdr5 鸡真核融合表达载体原始生殖干细胞

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wdr5赖氨酸甲基化修饰及其功能研究

WDR5赖氨酸甲基化修饰及其功能研究

作者：麻玉慧东北师范大学

学位级别：硕士

蛋白质赖氨酸甲基化修饰在基因转录调控、细胞衰老、癌症等生物学事件中发挥着重要的作用,这种修饰主要是由蛋白赖氨酸甲基转移酶催化完成的。wdr5作为赖氨酸甲基转移酶复合物的组分之一,参与了组蛋白H3K4二甲基化和三甲基化修饰过程,... 详细信息

蛋白质赖氨酸甲基化修饰在基因转录调控、细胞衰老、癌症等生物学事件中发挥着重要的作用,这种修饰主要是由蛋白赖氨酸甲基转移酶催化完成的。wdr5作为赖氨酸甲基转移酶复合物的组分之一,参与了组蛋白H3K4二甲基化和三甲基化修饰过程,在胚胎细胞自我更新过程、骨骼发育和乳腺癌细胞的转移以及膀胱癌细胞增殖过程中发挥着重要作用,但目前并没有关于wdr5蛋白的氨基酸残基是否受到翻译后修饰,及其相关功能的报道。我们的研究发现,wdr5蛋白第207位和第325位赖氨酸残基受到单甲基化修饰,对wdr5蛋白进行单甲基化修饰的酶为赖氨酸甲基转移酶SETD6。Western Blotting实验证明,干涉wdr5基因表达后,细胞内H3K4me3修饰水平下降;过表达耐受干涉的野生型wdr5蛋白(wdr5 WT),细胞内H3K4me3修饰水平会显著恢复;而过表达第207位、325位赖氨酸同时突变为精氨酸的wdr5蛋白(wdr5 K207R,K325R),细胞内H3K4me3修饰水平恢复却不明显;随后的IP实验发现,这种双突变的wdr5与MLL1的结合基本没有受到影响。集落形成实验、细胞划痕实验和细胞迁移实验表明,过表达wdr5 WT的MCF7细胞增殖和迁移能力增强,而过表达上述双突变wdr5的MCF7细胞,其相关功能没有显著变化。综上所述,我们的研究发现,SETD6催化了wdr5特定位点赖氨酸甲基化修饰,wdr5甲基化会使细胞内H3K4me3修饰水平提高,乳腺癌细胞的增殖和迁移能力增强。

关键词： wdr5 赖氨酸甲基化 SETD6 H3K4me3 细胞增殖和迁移

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wdr5对SOX9基因的初步表观调控

WDR5对SOX9基因的初步表观调控

作者：段君君大理大学

学位级别：硕士

WD重复蛋白5(WD repeat-containing protein 5,wdr5)是WD-40蛋白家族的成员,由333个氨基酸组成,其肽链含有7个WD重复结构形成的β-折叠,是wdr5的主要功能结构域。作为WD40家族的成员,它广泛参与了生物体的基因表达调控,在混合谱系白血... 详细信息

WD重复蛋白5(WD repeat-containing protein 5,wdr5)是WD-40蛋白家族的成员,由333个氨基酸组成,其肽链含有7个WD重复结构形成的β-折叠,是wdr5的主要功能结构域。作为WD40家族的成员,它广泛参与了生物体的基因表达调控,在混合谱系白血病的激活、肿瘤形成、VISA相关的信号复合体的装配及IRF3和NF-κB的激活等方面都发挥了巨大作用。但迄今为止,wdr5还有许多生物学作用机理尚待阐明。本课题第二部分利用基因重组技术构建人源wdr5全长结构基因真核表达载体,建立稳定表达wdr5的LNCaP细胞株。实验中通过PCR扩增wdr5基因后,将wdr5插入pCI-neo载体中,酶切及测序鉴定重组质粒。采用脂质体转染法将重组质粒转染LNCaP细胞,Real Time-PCR检测转染细胞wdr5的mRNA表达水平。经酶切及测序证实成功构建了真核表达载体pCI-neo-wdr5构建正确,重组质粒转染到LNCaP细胞后,经G418筛选获得稳定表达的细胞株,Real Time-PCR方法检测到wdr5基因在转录水平的表达,初步表明稳定表达wdr5的LNCaP细胞株的建立,为下一步wdr5的深入研究及应用奠定了基础。在哺乳动物个体发育过程中,DNA甲基化对性别决定和分化具有重要调节作用。近来在我们实验研究中证实了wdr5和SRY能共定位在SOX9的启动子上,并且通过两者协调作用上调SOX9的表达,同时抑制beta-Catenin的表达。因此,wdr5在性别决定中起着重要的调节作用。但是wdr5如何参与及具体调节SOX9基因表达机制却不清楚。故本课题的第三部分,我们应用与wdr5直接紧密相关的组蛋白标记H3K4me1/2/3抗体进行染色体免疫沉降(ChIP)实验,以验证wdr5分子对SOX9基因启动子的初步表观调节。

关键词： wdr5 真核表达 SOX9 DNA甲基化

wdr5通过Wnt通路促进肝癌细胞增殖的研究

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Wdr5通过Wnt通路促进肝癌细胞增殖的研究

作者：王晓锋兰州大学

学位级别：硕士

目的:研究发现wdr5在干细胞的分化、全能性维持以及肿瘤发生发展过程中发挥着重要作用,下调wdr5可以抑制成骨细胞的增殖,而上调wdr5可以促进膀胱癌细胞的增殖及自我更新能力。然而wdr5对肝癌细胞增殖能力的影响未见报道。本研究拟通过构... 详细信息

目的:研究发现wdr5在干细胞的分化、全能性维持以及肿瘤发生发展过程中发挥着重要作用,下调wdr5可以抑制成骨细胞的增殖,而上调wdr5可以促进膀胱癌细胞的增殖及自我更新能力。然而wdr5对肝癌细胞增殖能力的影响未见报道。本研究拟通过构建wdr5干扰模型,采用慢病毒转染的方法感染肝癌细胞后观察肝癌细胞增殖能力的变化来探讨其对肝癌细胞增殖能力的影响及其可能的机制,为原发性肝癌的诊断及临床治疗提供新的的思路及理论依据。方法:通过构建wdr5的shRNA模型shwdr5 A和shwdr5 B,并通过慢病毒转染方法感染靶细胞(人肝癌细胞株Huh7和HepG2),用qPCR和Western blot方法检测干扰后wdr5的表达水平验证感染效果。进而通过克隆形成实验和MTT法检测下调或沉默wdr5表达之后对肝细胞增殖的影响,并用qPCR和Western blot检测Wnt通路中关键基因β-catenin表达水平的变化来探索wdr5是否通过经典Wnt/β-catenin通路,并调节关键基因β-catenin的表达而影响肝癌细胞的增殖。结果:成功构建wdr5的干扰模型后,通过慢病毒转染方法感染肝癌细胞株Huh7和HepG2,qPCR和Western blot实验结果显示干扰后wdr5的表达水平较对照组明显下降。克隆形成实验和MTT法结果显示,当wdr5表达被沉默或下调后,肝癌细胞株Huh7和HepG2的克隆形成和细胞增殖能力显著降低。进一步通过qPCR和Western blot法检测Wnt通路关键基因β-catenin表达水平,发现在Huh7细胞株中,wdr5被干扰后,β-catenin的表达水平显著降低。结论:wdr5对肝癌细胞的增殖具有重要调节作用,下调wdr5能抑制肝癌细胞的增殖,而这一作用的重要机制可能是通过经典Wnt/β-catenin通路,并调节关键基因β-catenin的表达来实现的。

关键词： wdr5 原发性肝癌增殖 Wnt通路 β-catenin

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wdr5在胆管癌中的作用机制及预后研究

WDR5在胆管癌中的作用机制及预后研究

作者：陈田力山东大学

学位级别：硕士

研究背景:胆管癌(cholangiocarcinoma,CCA)是一种起源于胆道上皮系统的高侵袭性恶性肿瘤,在世界范围内的发病率呈上升趋势。胆管癌起病隐匿,早期诊断困难,大多数患者诊断时已失去手术治疗机会,且化疗、放疗耐药,因此预后极差。根据解剖... 详细信息

研究背景:胆管癌(cholangiocarcinoma,CCA)是一种起源于胆道上皮系统的高侵袭性恶性肿瘤,在世界范围内的发病率呈上升趋势。胆管癌起病隐匿,早期诊断困难,大多数患者诊断时已失去手术治疗机会,且化疗、放疗耐药,因此预后极差。根据解剖学结构,胆管癌可进一步分为肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,iCCA)、肝门部胆管癌(perihilarcholangiocarcinoma,pCCA)和远端胆管癌(distal cholangiocarcinoma,dCCA)三种亚型。pCCA是最常见的CCA类型,约占总CCA病例的50%-60%,而dCCA和iCCA分别占20%-30%和10%。根治性手术切除是CCA患者主要且最有效的治疗策略。不幸的是,大多数患者在诊断时便已处于晚期,失去了根治性手术的机会。即便胆管癌患者行根治性手术,术后5年总生存率(overall survival,OS)仍不足30%。此外,胆管癌对全身治疗如放疗、化疗十分不敏感,且尚缺乏有效的靶向药物。种种原因导致了胆管癌患者的5年生存率仅不到10%。因此,我们迫切需要新的肿瘤标志物和靶向药物来改善胆管癌患者的预后。遗憾的是,与肺癌等其他常见癌症相比,关于胆管癌的肿瘤标志物或潜在药物靶点的研究仍举步维艰。导致这一结果的原因有很多,包括手术根治率低、标本获取和队列建立困难。最新研究表明,每个胆管癌亚型不仅具有不同的发病率、临床特征、治疗策略和预后,而且具有不同的分子特征和生物学行为。因此,对于三种不同的CCA亚型的研究应分别进行,尤其是肿瘤标志物相关的研究。wdr5蛋白是WD40蛋白家族中的明星蛋白之一,其肽链含有7个WD重复结构形成7个β-折叠,构成了wdr5的主要功能结构域,许多蛋白质的结合和识别都依赖于此结构域。目前对wdr5的研究,主要还是集中在表观遗传学研究领域。wdr5可以与组蛋白甲基转移酶MLL1及SET1家族形成复合物,催化H3K4三甲基化进而激活基因转录,最终影响表观遗传。此外,wdr5也被报导可以与c-Myc蛋白的MbⅢb结构域结合,调控c-Myc与其靶基因的结合能力。wdr5已被证实在结直肠癌、胃癌、膀胱癌等恶性肿瘤中异常表达并能促进肿瘤细胞的增殖和侵袭,而在胆管癌中尚缺乏系统研究。研究目的:1.基于TCGA癌症数据库,分析wdr5在36个CCA组织和9个正常胆管上皮组织中的差异表达情况,明确wdr5作为肿瘤标志物的潜在价值。2.利用CCA患者手术切除的组织标本,通过qRT-PCR进一步探究wdr5在不同亚型的CCA中的表达情况。3.对CCA患者组织微阵列芯片(tissue microarray,TMA)进行免疫组织化学染色(immunohistochemical staining,IHC),通过 IHC 评分再次比较 wdr5在不同亚型的CCA组织和癌旁组织中的表达情况;结合患者的术后随访,明确wdr5与CCA患者预后的关系。4.通过qPCR、Western blot等分子生物学技术及体内、体外实验,明确wdr5对CCA细胞增殖、迁移、侵袭、转移能力及上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响。研究方法:1.借助TCGA数据库可视化网站GEPIA,挖掘TCGA数据库中的36个CCA组织和9个正常胆管上皮组织的wdr5 mRNA表达数据,通过单因素方差分析(One Way ANOVA),统计CCA组织和正常胆管上皮组织中wdr5 mRNA表达水平差异。2.收集18对iCCA、16对pCCA和14对dCCA患者的新鲜手术切除标本,通过qRT-PCR进一步明确wdr5在不同亚型胆管癌和癌旁组织中mRNA的表达差异。3.收集山东大学齐鲁医院自2012年1月至2018年12月接受胆管癌根治性手术患者的石蜡组织标本共计336例(其中iCCA78例,pCCA 141例,dCCA88例以及iCCA癌旁组织12例,pCCA癌旁组织17例)。制作组织芯片,行IHC染色并对wdr5在组织芯片中的表达进行评分。4.比较wdr5在不同亚型胆管癌之间、癌组织及癌旁组织之间的蛋白表达差异。5.利用 ROC 曲线(receiver operating characteristic curve)分别计算得到 iCCA,pCCA和dCCA的cut-off值,进而将其患者分为wdr5低表达组和高表达组。通过Kaplan-Meier法和long-rank检验进行单因素生存分析,明确胆管癌临床病理特征及wdr5表达对患者预后的影响。通过Cox回归模型进行多因素分析,明确wdr5是否是影响胆管癌预后的独立危险因素。6.利用慢病毒载体,对胆管癌细胞中wdr5进行敲低或过表达,通过CCK

关键词：胆管癌 wdr5 预后转移

wdr5在间充质干细胞中的功能调控作用及机制研究

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WDR5在间充质干细胞中的功能调控作用及机制研究

作者：张琛天津医科大学

学位级别：硕士

目的:间充质干细胞是一类能够自我复制,克隆形成和多谱系分化的多能干细胞,正是其多向的分化功能,使其在多方面有着应用前景。wdr5作为WD40蛋白家族的主要成员,在组织再生和骨组织发育中存在重要的作用,然而其在间充质干细胞中的作用尚... 详细信息

目的:间充质干细胞是一类能够自我复制,克隆形成和多谱系分化的多能干细胞,正是其多向的分化功能,使其在多方面有着应用前景。wdr5作为WD40蛋白家族的主要成员,在组织再生和骨组织发育中存在重要的作用,然而其在间充质干细胞中的作用尚不明确。因此阐明wdr5是否为调控间充质干细胞的关键靶点,为研发促进牙再生、骨再生的小分子制剂提供理论依据。方法:1.获得人间充质干细胞2.目的质粒的获取将wdr5的基因序列在NCBI数据库查询获得,应用Whitehead提供的程序设计wdr5的SiRNA,将其插入慢病毒的shRNA载体pLKO.1上,测序鉴定,最终构建成wdr5 shRNA质粒。采用基因合成的方法得到加表面标签Myc Tag的wdr5基因全长,将其连接到逆转录病毒pQCXIN的表达载体上,对序列进行鉴定后,最终构建成wdr5的Myc-wdr5过表达质粒。3.包装以及收集病毒对照组Scramble shRNA(Scramsh)空载体质粒、实验组wdr5 shRNA(wdr5sh)质粒及对应的包装质粒(VSVG和dv-8.2)培养于293T细胞中进行病毒的包装,48小时后将获取的上清液行病毒滴度测定,平均分装于冻存管中,-80℃冰箱留存。逆转录病毒对照空质粒pQCXIN、实验组Myc-wdr5的质粒及相应的包装质粒(CPI和GPE)培养于293T细胞中进行病毒的包装,72小时后将获取的上清液行病毒滴度测定,平均分装于冻存管中,-80℃冰箱留存。4.构建稳定转染的细胞系利用Scramsh以及wdr5sh病毒,分别对间充质干细胞进行转染,48小时后对转染后的细胞加入puromycin进行筛选,筛选3天后得到对照Scramsh和wdr5sh病毒稳定转染的间充质干细胞。为确定病毒的转染效率,对转染后的细胞进行mRNA层面以及蛋白表达层面对间充质干细胞wdr5的敲低效果进行检测。对照组病毒pQCXIN和实验组病毒Myc-wdr5转染细胞,转染后48小时后对转染病毒的细胞行7天G418的筛选,为确定病毒的转染效率,对转染后的细胞进行mRNA层面以及蛋白表达层面对间充质干细胞wdr5的过表达效果进行检测。***5对间充质干细胞功能影响的体外研究成骨/成牙本质分化能力的检测:用成骨/成牙本质诱导的培养液(Millipore)对间充质干细胞在体外向成骨/成牙本质的方向分化诱导。其中包括细胞在成骨诱导初期指标-碱性磷酸酶活性,晚期分化指标(细胞体外矿化能力)-茜素红和钙离子浓度检测。同时收取诱导过程中细胞并提取mRNA进行检测,其中包括成骨/成牙分化指标(RUNX2、DSPP、OPN、BSP、DMP-1)在1周、2周、3周表达的变化。成神经向分化能力检测:对间充质干细胞在体外进行成神经方向分化诱导。其中包括收取成神经方向诱导过程中的细胞,提取mRNA后检测成神经分化指标(NCAM、TH、βIII-Tubulin、NerouD)在3天、6天、9天表达量的变化。并观察细胞诱导后形态学变化及免疫荧光鉴定神经干细胞标记物Nestin和早期神经元标记物β-III-Tubulin。成血管向分化检测:对间充质干细胞进行成血管方向分化诱导。在诱导0天、4天、7天、10天时间点收取细胞提取mRNA,检测RNA各个时期成血管分化指标(ANG-1、VEGF、PDGFA)等的变化。6.统计学分析应用统计学计算软件SPSS 22.2,根据t检验或方差分析,实验结果P值小于0.05表示有统计学差异。结果:1.对稳定转染wdr5的根尖牙乳头干细胞,在mRNA和蛋白表达量上进行测定,结果表明转染后的根尖牙乳头干细胞wdr5基因敲低组与wdr5基因过表达组均存在明显敲低效果与过表达效果。2.通过检测5天的ALP活性、3周的ARS染色、以及钙离子浓度测定和经过1周、2周、3周成骨诱导的细胞mRNA,结果表明和对照组相比,敲低wdr5的根尖牙乳头干细胞中ALP活性、ARS染色、钙离子浓度明显增高,成神经向分化指标(NCAM、TH、β-III-Tubulin、NerouD),在骨髓间充质干细胞中具有相同结果。成血管向分化指标(ANG-1、VEGF、PDGFA),同样也表达升高,过表达组结果则与之相反。根尖牙乳头干细胞中过表达wdr5组与对照组相比,成骨/成牙相关分化指标(RUNX2、OPN、BSP、DSPP、DMP1)表达降低。结论:***5体外抑制间充质干细胞早期成骨/成牙指标-ALP活性、体外矿化能力、晚期成骨/成牙分化指标及关键转录因子的表达。***5体外抑制间充质干细胞神经向分化的形态学改变、神经向特异性蛋白表达以及神经向分化指标的表达。***5体外抑制SCAPs成血管向分化指标的表达。

关键词： wdr5 成牙/成牙本质分化间充质干细胞牙齿再生骨组织再生

wdr5在大鼠肾脏缺血再灌注损伤中的作用机制研究

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WDR5在大鼠肾脏缺血再灌注损伤中的作用机制研究

作者：张伍武汉大学

学位级别：硕士

研究背景和目的:wdr5基因为编码WD重复蛋白家族的成员,由40个左右的氨基酸残基组成,具有保守的GH(甘氨酸和组氨酸)和WD(色氨酸和天冬氨酸)序列。该家族成员参与各种细胞过程,包括细胞周期进程、信号转导、细胞凋亡和基因调控。关于wdr5... 详细信息

研究背景和目的:wdr5基因为编码WD重复蛋白家族的成员,由40个左右的氨基酸残基组成,具有保守的GH(甘氨酸和组氨酸)和WD(色氨酸和天冬氨酸)序列。该家族成员参与各种细胞过程,包括细胞周期进程、信号转导、细胞凋亡和基因调控。关于wdr5在肿瘤中的相关作用已比较明确,但是其在肾脏缺血再灌注损伤中的相关作用,目前尚无文献报道。因此本研究通过荧光定量PCR、免疫组化分析、Western Blot、TUNEL染色法,大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型建立等方法,探讨wdr5及其抑制剂(wdr5-0103)在大鼠肾脏缺血再灌注损伤中的调控作用与机制。研究方法:成年雄性SD大鼠48只,按照随机数表法分为对照组、IR组(缺血再灌注损伤组)、药物溶剂组(DMSO组)、wdr5抑制剂低剂量组(1mg/kg)、wdr5抑制剂中剂量组(5mg/kg)、wdr5抑制剂高剂量组(25mg/kg)。对照组:仅切除大鼠右肾;IR组:切除大鼠右肾后用无创伤血管夹夹闭大鼠左肾肾蒂血管45分钟,松开血管夹恢复血流再灌注,模拟缺血再灌注过程;DMSO组:手术同I/R组,在闭合左肾血管45min,松开血管夹后腹腔注射DMSO;不同浓度wdr5抑制剂组:腹腔注射不同浓度的wdr5-0103,余同IR组。检测各组大鼠血清尿素氮和肌酐水平,免疫组化染色检测wdr5蛋白表达变化,TUNEL染色检测细胞凋亡,Realtime-PCR检测TNF-α、IL-1β和ICAM-1表达水平,Western Blot检测TLR4蛋白和NF-κB蛋白表达。研究结果:与对照组相比,IR组大鼠血Cr和BUN水平升高,肾组织wdr5蛋白水平升高,肾组织凋亡明显,凋亡细胞数增加,TNF-α、IL-1β和ICAM-1的m RNA水平明显升高,TLR4/NF-κB蛋白表达水平明显升高(P均wdr5抑制剂组血Cr和BUN水平明显降低,且25mg/kg组降低最明显;wdr5抑制剂高剂量组wdr5的蛋白表达降低,大鼠肾组织的病理学损害明显减轻,凋亡细胞数明显减少;TNF-α、IL-1β和ICAM-1m RNA水平明显降低;TLR4/NF-κB表达水平明显降低(P均wdr5抑制剂可通过TLR4/NF-κB通路,减轻肾缺血再灌注损伤后细胞的凋亡及细胞内炎性因子的表达,从而减少肾缺血再灌注损伤所导致的损害,对机体起到保护作用。以上研究发现为进一步了解wdr5蛋白的生物学功能提供了理论和实验证据,也为临床上改善肾缺血再灌注损伤患者损害提供了新的思路和研究方向。

关键词：肾缺血再灌注损伤 wdr5 凋亡炎症因子 TLR4/NF-κB

SOX9对wdr5基因表达的表观遗传机制初探

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SOX9对WDR5基因表达的表观遗传机制初探

作者：王江大理大学

学位级别：硕士

SOX9是SOX(SRY-related HMG box)家族的重要成员,人类的SOX9基因定位于染色体17q24.325.1,可编码509个氨基酸,是一种与性腺发育有关的转录因子。近年来的研究发现SOX9基因的功能呈现多样性,其作为转录因子参与了胚胎的发育过程,尤其是... 详细信息

SOX9是SOX(SRY-related HMG box)家族的重要成员,人类的SOX9基因定位于染色体17q24.325.1,可编码509个氨基酸,是一种与性腺发育有关的转录因子。近年来的研究发现SOX9基因的功能呈现多样性,其作为转录因子参与了胚胎的发育过程,尤其是在性别决定和软骨的形成中起到关键的调控作用。但是至今为止,SOX9基因的许多生物学功能及其作用机制仍有待研究。WD重复蛋白5(WD repeat-containing protein 5,wdr5)是WD-40蛋白家族的成员,WD重复蛋白是一段含40个氨基酸的保守序列。wdr5作为MLL复合体的重要成员,能引起基因5’端编码区组蛋白H3K4的甲基化。新近发现wdr5和SRY共定位在SOX9的启动子上,两者协同上调SOX9的表达,可能在性别决定过程中具有促进作用。然而,关于SOX9与wdr5是如何相互作用仍然不得而知。故本课题我们利用基因克隆的方法构建过表达SOX9的载体后,经转染成功获得稳定表达SOX9的LNcap细胞株;随后采用染色体免疫共沉降的方法,检测SOX9在调节wdr5表达的过程中,wdr5启动子上主要的组蛋白标记修饰发生的变化,旨在探讨SOX9对wdr5的表达影响。

关键词： SOX9 慢病毒表达载体 wdr5 染色质免疫共沉降

wdr5在大鼠肾脏缺血再灌注损伤中的作用及机制研究

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微循环学杂志 2021年第1期31卷 7-12页

作者：张伍刘修恒王磊武汉大学人民医院泌尿外科武汉430060

目的:探讨wdr5基因在肾脏缺血再灌注损伤中的作用及机制。方法:成年雄性SD大鼠48只,按照随机数表法分为对照组、缺血再灌注损伤组(IR组)、药物溶剂组(DMSO组)、wdr5-0103低剂量组(1mg/kg)、wdr5-0103中剂量组(5mg/kg)、wdr5-0103高剂量... 详细信息

目的:探讨wdr5基因在肾脏缺血再灌注损伤中的作用及机制。方法:成年雄性SD大鼠48只,按照随机数表法分为对照组、缺血再灌注损伤组(IR组)、药物溶剂组(DMSO组)、wdr5-0103低剂量组(1mg/kg)、wdr5-0103中剂量组(5mg/kg)、wdr5-0103高剂量组(25mg/kg)。对照组:仅切除大鼠右肾;IR组:切除大鼠右肾后用无创伤血管夹夹闭大鼠左肾肾蒂血管45min,松开血管夹恢复血流再灌注,模拟缺血再灌注过程;DMSO组:手术同IR组,在闭合左肾血管45min,松开血管夹后腹腔注射DMSO;不同浓度wdr5-0103组:腹腔注射不同浓度的wdr5-0103,余同IR组。检测各组大鼠血清尿素氮和肌酐水平,免疫组化染色检测wdr5蛋白表达变化,TUNEL染色检测细胞凋亡,qRT-PCR检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达水平,Western Blot检测TLR4蛋白和核因子-κB(NF-κB)蛋白表达。结果:与对照组相比,IR组大鼠血Cr和BUN水平升高,肾组织wdr5蛋白水平升高,肾组织损伤明显,细胞凋亡率增加,TNF-α、IL-1β和ICAM-1的mRNA水平明显升高,TLR4/NF-κB蛋白表达水平明显升高(P均wdr5-0103组血Cr和BUN水平显著降低,且25mg/kg组降低最明显;wdr5-0103高剂量组wdr5的蛋白表达降低;大鼠肾组织的病理学损害减轻,细胞凋亡率明显减少;TNF-α、IL-1β和ICAM-1mRNA水平明显降低;TLR4/NF-κB表达水平也明显降低(P均wdr5-0103可减轻IR后的细胞凋亡与炎性反应,从而调控肾脏缺血再灌注损伤,其机制可能与下调TLR4/NF-κB通路有关。

关键词：肾缺血再灌注损伤 wdr5 wdr5-0103 凋亡炎症因子 TLR4/NF-κB