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Digital Chinese Medicine 2018年第3期1卷 228-238页

作者： Jun PENG Kun PAN Zheng-Rong LIU Yu-Hui QIN Qing-Hua PENG Department of Traditional Chinese Medicine Ophthalmology Hunan University of Chinese Medicine Changsha Hunan410208 China

Objective The effects of Shuang Dan Ming Mu capsule on expression of vegf-a,vegf-b,vegf-c and the vegf receptor,Flk-1,were examined in a diabetic retinopathy rats *** Forty Sprague-Dawley(SD)rats were randomized into Groups A(blank),b(model),C(Shuang Dan Ming Mu)and D(positive control)group,with each group containing10rats *** from groups b,C and D were administered one dose of50mg/kg streptozotocin(STZ)by tail vein injection to establish a diabetic rat *** week after model preparation,medication was continuously administered by *** gavage for8weeks,the animals were sacrificed and retinal expression of vegf-a,vegf-b,vegf-c and Flk-1was quantified by immunohistochemical *** At week8of drug administration after model preparation,the average protein expression grayscale values for vegf-a,vegf-b,vegf-c and Flk-1in the rats model,Shuang Dan Ming Mu and positive control groups were all lower than those in the normal group,while the mean optical density values were higher than those in the normal *** the model group was compared to the normal group,the difference was extremely significant(Pvegf-a,vegf-b,vegf-c and Flk-1in the Shuang Dan Ming Mu and positive control groups were all higher than those in the model group,while the mean optical density values were lower than those in the model group(Pvegf-a,vegf-b,vegf-c and Flk-1in the retinas of diabetic model rats and exhibit some protective effects in their retinas.

关键词： Shuang Dan Ming Mu capsule Diabetic rats model vegf-a vegf-b vegf-c Flk-1

vegf-b,白细胞介素-6和b淋巴细胞瘤-2在甲状腺癌中的诊断价值分析

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中文科技期刊数据库（文摘版）医药卫生 2023年第1期 139-141页

作者：李胜佳邢台市精神病医院河北邢台054004

探究vegf-b,白细胞介素-6和b淋巴细胞瘤-2在甲状腺癌中的诊断价值分析。方法纳入本院2022年1月至2022年12月收治的55例甲状腺癌患者并列入观察组,选取同期同样数量的健康体检志愿者列入对照组。两组均进行vegf-b,白细胞介素-6和b淋巴... 详细信息

探究vegf-b,白细胞介素-6和b淋巴细胞瘤-2在甲状腺癌中的诊断价值分析。方法纳入本院2022年1月至2022年12月收治的55例甲状腺癌患者并列入观察组,选取同期同样数量的健康体检志愿者列入对照组。两组均进行vegf-b,白细胞介素-6和b淋巴细胞瘤-2的检测,对比差异。结果观察组的vegf-b以及白细胞介素-6水平均高于对照组(Pvegf-b、b淋巴细胞瘤-2的阳性率均高于对照组(Pvegf-b,白细胞介素-6和b淋巴细胞瘤-2指标与正常人群存在差异性,通过这三种指标的检测能够对甲状腺癌患者进行诊断上的参考辅助,而三项指标联合检测能够进一步提升检出率,对于患者的临床诊断和治疗指导提供有利信息。

关键词： vegf-b 白细胞介素-6 b淋巴细胞瘤-2 甲状腺癌

LncRNA H19和vegf-b在糖尿病视网膜病变患者中的表达及临床意义

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中国实验诊断学 2022年第5期26卷 642-647页

作者：唐晓蕾代艳丁倩李倩蒋艳李建绵阳市中心医院眼科四川绵阳621000 巴中市通江县医院眼科四川巴中635700

目的探究糖尿病视网膜病变(DR)患者中LncRNA H19和vegf-b表达水平以及临床意义。方法选取2型糖尿病患者120例分为糖尿病无视网膜病变组(DM组)、非增殖型糖尿病视网膜病变组(NPDR组)和增殖型糖尿病视网膜病变组(PDR组),每组各40例患者... 详细信息

目的探究糖尿病视网膜病变(DR)患者中LncRNA H19和vegf-b表达水平以及临床意义。方法选取2型糖尿病患者120例分为糖尿病无视网膜病变组(DM组)、非增殖型糖尿病视网膜病变组(NPDR组)和增殖型糖尿病视网膜病变组(PDR组),每组各40例患者;选取特发性黄斑裂孔且不伴糖尿病的患者40例为对照组(NC组)。分别采用ELISA法和RT-qPCR法检测各玻璃体和血清样品中vegf-b和LncRNA H19的表达水平;免疫组化检测LncRNA H19和vegf-b阳性表达;通过Logistic多元回归分析vegf-b和LncRNA H19是否为DR的危险因素。结果免疫组化结果表明NC组患者视网膜组织中LncRNA H19阳性表达数高于PDR组(Pvegfb阳性表达数低于PDR组(Pvegf-b表达水平依次升高,差异有统计学意义(Pblo结果显示PDR组患者膜组织中vegf-b蛋白表达水平显著高于NC组(Pvegf-b浓度与血清中IL-6水平呈线性正相关(r=0.899,Pvegf-b表达水平升高,而LncRNA H19相对表达水平下降,且为DR的危险因素,其可能参与了DR的发生发展过程。

关键词：糖尿病视网膜病变 LncRNA H19 vegf-b

hs-CRP联合vegf-b检测对急性STEMI患者介入术后MACE的预测价值

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中国急救复苏与灾害医学杂志 2022年第7期17卷 939-942页

作者：张欢苏炳新徐良成连云港第一人民医院心内科江苏连云港222000 连云港第一人民医院心血管内科江苏连云港222000

目的探究超敏C反应蛋白(hs-CRP)联合血管内皮生长因子-b(vegf-b)检测对急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者介入术后主要不良心脏事件(MACE)的预测价值。方法选取连云港第一人民医院2019年7月—2021年8月收治的306例STEMI患者作为研究... 详细信息

目的探究超敏C反应蛋白(hs-CRP)联合血管内皮生长因子-b(vegf-b)检测对急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者介入术后主要不良心脏事件(MACE)的预测价值。方法选取连云港第一人民医院2019年7月—2021年8月收治的306例STEMI患者作为研究对象,收集患者基础人口学资料及入院时相关病理资料,分别采用乳胶凝集比浊法和电化学发光法检测血清hs-CRP及vegf-b表达水平,根据患者术后6个月随访结局将其分为MACE组和非MACE组。Logistic回归分析STEMI患者术后发生MACE的相关因素。以受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)评估血清hs-CRP及vegf-b对STEMI患者术后发生MACE的预测效能。结果随访6个月内,306例STEMI患者中MACE发生率为25.49%,共计78例,剩余228例(74.51%)均出现MACE。Logistic结果显示合并高血压、高脂血症、血清hs-CRP及vegf-b异常表达均为STEMI患者术后发生MACE的相关因素(Pvegf-b单一及联合预测STEMI患者术后发生MACE的AUC分别为0.717、0.733、0.841,且单一预测效能低于联合(Pvegf-b可用于STEMI患者术后MACE的预测评估,且联合预测效能更高。

关键词：急性ST段抬高型心肌梗死 hs-CRP vegf-b 主要不良心脏事件

vegf-b基因靶向siRNA对肝癌细胞裸鼠皮下种植瘤vegf-b蛋白表达的影响

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VEGF-B基因靶向siRNA对肝癌细胞裸鼠皮下种植瘤VEGF-B蛋白表达的...

作者：白建国河北医科大学

学位级别：硕士

目的：原发性肝癌(以下简称肝癌)为常见的恶性肿瘤之一，发病隐匿，进展速度快，预后差。目前对于肝癌的治疗主要是以手术为主的综合治疗，包括：手术切除、射频消融、微波固化、化疗栓塞(TACE)、放射治疗、生物免疫治疗等，手术切除为... 详细信息

目的：原发性肝癌(以下简称肝癌)为常见的恶性肿瘤之一，发病隐匿，进展速度快，预后差。目前对于肝癌的治疗主要是以手术为主的综合治疗，包括：手术切除、射频消融、微波固化、化疗栓塞(TACE)、放射治疗、生物免疫治疗等，手术切除为目前最主要、最有效的方法，但患者术后5年生存率低，主要是因为患者术后肿瘤的复发及转移。肿瘤的生长及转移依赖于新生血管的形成，血管的新生是一个多因素调节的过程，血管内皮生长因子(vegf)是促进血管形成的重要调节因子之一，vegf除具有促进血管形成作用外，还具有促进淋巴管形成、调节脂质代谢、保护及营养神经等作用，并且与肿瘤的发生、进展密切相关。现已发现vegf家族共有7个成员，vegf-b为其中重要的一员，我们前期的研究发现肝癌的发生、发展与vegf-b密切相关。RNA干扰(RNAinterference, RNAi)为转录后的基因沉默，可以实现对目的基因的高特异、高效沉默，小干扰RNA(siRNA)是RNA干扰中主要介导因子。本实验从人类vegf-b基因中选取3个靶点，利用RNA干扰技术体外构建3个vegf-b基因靶向siRNA，转染人肝癌细胞HepG2细胞并建立裸鼠皮下种植瘤模型，观察抑制vegf-b基因后对肝癌细胞裸鼠皮下种植瘤的影响，从而为肝癌的基因治疗提供新的靶点及理论依据。方法：从人vegf-b基因中选取3个靶点，利用RNA干扰技术体外构建3个靶向siRNA。常规培养人肝癌细胞HepG2细胞，借助质粒载体将阴性空白对照质粒及3个阳性vegf-b基因靶向siRNA质粒转染入HepG2细胞(转染后分别命名为：bt0，bt1，bt2，bt3)，转染48小时后观察转染效率，用blasticidin稳定筛选并培养扩增。将24只裸鼠随机分成4组，并将转染筛选后的4组细胞种植于裸鼠皮下，建立裸鼠皮下种植瘤模型(分别命名为：mbt0组，mbt1组，mbt2组，mbt3组)。常规饲养裸鼠并观察裸鼠皮下种植瘤的生长情况，30天后处死裸鼠，并测量计算皮下种植瘤的体积和重量，利用Western blot方法检测种植瘤vegf-b蛋白表达情况。结果： 1以质粒为载体，可成功将体外构建的vegf-b基因靶向siRNA转染入肝癌细胞HepG2细胞，转染48小时后，转染效率可达705%。 2对照组mbt0组与实验组mbt1组、mbt2组、mbt3组裸鼠皮下均成瘤，3个实验组裸鼠皮下种植瘤生长速度较对照组缓慢，30天后种植瘤体积分别为：(1.671±0.131)cm3、(1.083±0.224)cm3、(1.252±0.204)cm3、(1.127±0.276)cm3，瘤体重量分别为：(1.049±0.104)g、(0.681±0.130)g、(0.804±0.119)g、(0.733±0.138)g。3个实验组瘤体的体积及重量均显著小于阴性对照组(Pblot方法显示：3个实验组(mbt1、mbt2、mbt3)条带亮度明显暗于对照组(mbt0)条带，目的条带/β-actin条带灰度值示：0.692±0.059、0.411±0.039、0.544±0.063、0.503±0.102，3个实验组种植瘤vegf-b蛋白表达水平显著低于阴性对照(Pvegf-b基因靶向siRNA成功转染HepG2细胞并构建裸鼠皮下种植瘤模型后，可明显抑制裸鼠皮下种植瘤的生长及种植瘤vegf-b蛋白的表达。

关键词：原发性肝癌 vegf-b siRNA 细胞转染稳定筛选裸鼠 Western blot

vegf-b促进糖尿病小鼠角膜神经再生的机制研究

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VEGF-B促进糖尿病小鼠角膜神经再生的机制研究

作者：冯璐济南大学

学位级别：硕士

目的通过I型糖尿病小鼠模型和体外三叉神经节细胞模型,研究血管内皮生长因子b(vegf-b)对糖尿病小鼠角膜上皮和神经再生的作用,并探讨其机制。方法选取链脲佐菌素(STZ)诱导的I型糖尿病小鼠与同龄对照小鼠,建立角膜上皮损伤再生模型。West... 详细信息

目的通过I型糖尿病小鼠模型和体外三叉神经节细胞模型,研究血管内皮生长因子b(vegf-b)对糖尿病小鼠角膜上皮和神经再生的作用,并探讨其机制。方法选取链脲佐菌素(STZ)诱导的I型糖尿病小鼠与同龄对照小鼠,建立角膜上皮损伤再生模型。Western blot和免疫组化检测正常和糖尿病小鼠角膜上皮内源性vegf-b表达量差异;荧光素钠染色检测外源性vegf-b对糖尿病小鼠角膜上皮损伤愈合速率的影响;角膜整体铺片染色检测vegf-b对糖尿病小鼠角膜神经再生的作用。体外培养小鼠原代三叉神经节细胞,加入中和抗体以及小分子抑制剂,免疫荧光检测vegf-b对三叉神经节细胞轴突生长、线粒体氧化应激状态的影响;Western blot检测vegf-b对三叉神经节细胞内信号通路的活化情况。结果(1)与同龄对照相比,随着糖尿病小鼠病程的延长,糖尿病小鼠体重显著减轻,血糖水平显著升高,且小鼠角膜敏感度显著降低。角膜神经染色显示糖尿病小鼠的角膜上皮末梢神经纤维密度显著减少,且基底膜神经显微结构显著改变。正常小鼠再生角膜上皮中的vegf-b表达水平较正常角膜上皮显著增强,而在糖尿病小鼠再生角膜上皮中,vegf-b的表达未见显著提高。(2)外源性添加vegf-b可显著促进正常及糖尿病小鼠角膜神经、上皮再生和角膜敏感度恢复。(3)糖尿病导致三叉神经节细胞内ROS水平显著升高,线粒体处于氧化应激状态。vegf-b可以显著降低三叉神经节细胞内ROS水平,显著降低其线粒体应激水平,封闭vegfR-1而非NRP-1,可以完全抵消vegf-b对糖尿病三叉神经节细胞线粒体应激水平的恢复。(4)vegf-b可显著促进正常及糖尿病小鼠三叉神经节细胞轴突的生长以及下游Akt、GSK3β和S6K磷酸化水平升高。封闭vegfR-1而非NRP-1,可完全抵消vegf-b的促进功能。加入Akt、GSK3β、mTOR的抑制剂,可完全阻断vegf-b的促神经生长作用。结论(1)随着病程延长,糖尿病小鼠出现角膜上皮神经退行,敏感度下降等糖尿病角膜病变特征,且再生角膜上皮中vegf-b表达显著降低。(2)外源性vegf-b可以促进糖尿病小鼠的角膜神经修复及上皮愈合,促进角膜敏感度恢复。(3)vegf-b通过恢复线粒体应激水平和活化vegfR-1及其下游PI-3K/Akt-GSK-3β-m TOR信号通路促进糖尿病三叉神经节细胞轴突的生长。

关键词： vegf-b 糖尿病角膜神经再生角膜敏感度 vegfR-1

vegf-b及其受体Flt-1在肝癌中的表达及意义

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VEGF-B及其受体Flt-1在肝癌中的表达及意义

作者：苑建磊河北医科大学

学位级别：硕士

目的:原发性肝癌(简称肝癌)是常见的消化系恶性肿瘤,年死亡率居恶性肿瘤第二位,临床症状出现晚,症状出现后大多已是中晚期,手术切除率低,预后差。传统的手术、化疗、放疗因各自的局限性而不能达到满意的疗效,其原因是肿瘤具有强大的生... 详细信息

目的:原发性肝癌(简称肝癌)是常见的消化系恶性肿瘤,年死亡率居恶性肿瘤第二位,临床症状出现晚,症状出现后大多已是中晚期,手术切除率低,预后差。传统的手术、化疗、放疗因各自的局限性而不能达到满意的疗效,其原因是肿瘤具有强大的生长和转移能力。肿瘤的生长和转移有赖于血管新生,促进血管新生的关键因子是血管内皮生长因子家族成员( vascular endothelial growth factor family vegfs)。vegfs包括vegf-A、b、C、D、E和PIGF (placenta growth factor,胎盘生长因子)。近年来,许多文献报道了血管内皮生长因子(vegf)在多种恶性肿瘤中异常表达,并与肿瘤的生长、转移及预后相关。其中vegf-b及其受体Flt-1的表达已见于人神经系统肿瘤、乳腺癌、肾癌、大肠癌、肺癌等:与大肠癌和肺癌的淋巴浸润和淋巴转移密切相关;可以调节肾癌中肿瘤血管的形成;在恶性的神经胶质瘤血管生成过程中,可能作为辅助因子而发挥作用;在乳腺癌中其主要作用不是促进血管形成,而是与淋巴转移密切相关,目前对于抗vegf受体的治疗,为乳腺癌的治疗提供新的途径。但vegf-b及其受体在肝癌中的表达及意义尚未见于报道。本实验采用免疫组织化学染色法,检测分析肝癌组织、癌旁肝组织及正常肝组织中vegf-b及Flt-1蛋白的表达,探讨其表达与肝癌临床病理特征之间的关系。方法:选用55例行肝癌切除的肝细胞肝癌组织和33例癌旁肝组织标本,15例正常肝组织作正常对照。采用免疫组织化学染色法(S-P法)检测肝癌组织、癌旁肝组织和正常肝组织中vegf-b、Flt-1的表达,并结合患者的临床病理特征进行分析。结果1肝癌组织、癌旁肝组织及正常肝组织中vegf-b和Flt-1蛋白的表达vegf-b在肝癌组织、癌旁肝组织及正常肝组织中的阳性表达率分别是76.4%(42/55)、54.5%(18/33)及33.3%(5/15),肝癌组织中vegf-b的表达率最高,正常肝组织中vegf-b的表达率最低,肝癌组织与癌旁肝组织、正常肝组织之间的表达率均有显著差异(Pvegf-b蛋白表达与肝癌临床病理特征的关系有胆管或门静脉瘤栓形成的肝癌组织中vegf-b蛋白阳性表达率为100.0%(11/11),无胆管或门静脉瘤栓形成的肝癌组织中vegf-b阳性表达率为70.4%(31/44),二者具有显著性差异(Pvegf-b的表达还与临床分期、有无包膜形成及肝内或淋巴结转移有关(P0.05)。3肝癌组织中Flt-1蛋白表达与肝癌临床病理特征的关系有胆管或门静脉瘤栓形成的肝癌组织中Flt-1蛋白阳性表达率为100.0%(11/11),无胆管或门静脉瘤栓形成的肝癌组织中Flt-1阳性表达率为65.9%(29/44),二者的表达率有显著性差异(P0.05)。4 vegf-b和Flt-1在肝癌组织中表达的关系55例肝癌组织中vegf-b和Flt-1蛋白同时阳性表达者34例,同时阴性表达者11例,二者的表达呈显著正相关(Pvegf-b及Flt-1蛋白表达与生存率的关系55例患者中,总体的1年、2年生存率分别为51.28%、28.84%;vegf-b阳性表达组患者1年、2年生存率分别为45.82%、21.38%,而阴性表达组1年、2年生存率分别为69.93%、52.40%,Log-rank检验结果显示二者生存时间有显著性差异(Pvegf-b和Flt-1在肝癌组织中的表达水平显著高于癌旁肝组

关键词：原发性肝癌 vegf-b Flt-1 免疫组织化学染色累积生存率

vegf-b基因靶向siRNA对人肝癌细胞HepG2细胞裸鼠皮下种植瘤的影响

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VEGF-B基因靶向siRNA对人肝癌细胞HepG2细胞裸鼠皮下种植瘤的影响

作者：吴剑飞河北医科大学

学位级别：硕士

目的：抗人vegf-b基因siRNA载体阳性质粒稳定转染人肝癌细胞株HepG2细胞，将vegf-b低表达HepG2细胞种植于裸鼠皮下成瘤，以探讨vegf-b基因靶向siRNA对肝癌细胞生物学特性的影响，为肝癌的基因治疗开辟新的靶点。方法：采用已构建好的3... 详细信息

目的：抗人vegf-b基因siRNA载体阳性质粒稳定转染人肝癌细胞株HepG2细胞，将vegf-b低表达HepG2细胞种植于裸鼠皮下成瘤，以探讨vegf-b基因靶向siRNA对肝癌细胞生物学特性的影响，为肝癌的基因治疗开辟新的靶点。方法：采用已构建好的3组vegf-b基因靶向siRNA载体阳性质粒和1组阴性对照空载质粒瞬时转染人肝癌细胞株HepG2细胞，前3组经vegf-b靶向siRNA阳性质粒转染的HepG2细胞通过杀稻瘟菌素稳定筛选后，获得的3组vegf-b低表达的HepG2细胞。最后共得到四组HepG2细胞：三组vegf-b靶向siRNA阳性质粒转染组(分别称之为bs1组、bs2组、bs3组)、阴性对照空载质粒转染组(称之为bs0组)。将此4组HepG2细胞扩增后分别接种于4组裸鼠皮下(每组6只，共24只)，建立人肝癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型，4组裸鼠分别称之为Ps0组、Ps1组、Ps2组、Ps3组。5周后对比测量4组裸鼠皮下种植瘤的体积、重量，提取肿瘤组织mRNA，经RT-PCR检测vegf-b基因的表达，研究vegf-b基因靶向siRNA对肝癌细胞增殖及表达vegf-b的影响。结果： 1分别种植bs0组、bs1组、bs2组、bs3组HepG2细胞的裸鼠，在接种细胞后1周左右均成瘤，5周后肿瘤体积分别为(2.274±0.451)cm、(0.709±0.333)cm、(0.698±0.614)cm、和(0.649±0.430)cm，瘤重分别为(1.451±0.287)g、(0.507±0.212)g、(0.633±0.498)g、和(0.583±0.343)g，Ps1组、Ps2组、Ps3组的体积和瘤重均显著小于Ps0组(Pvegf-b基因靶向siRNA的HepG2细胞的荷瘤裸鼠中，Ps0组、Ps1组、Ps2组和Ps3组的vegf-b mRNA的表达量分别为1.496±0.399、0.640±0.316、0.672±0.364和0.803±0.438。三种vegf-b靶向siRNA阳性质粒组的裸鼠皮下种植瘤vegf-b mRNA表达水平均显著低于阴性对照空载质粒组(Pvegf-b基因靶向siRNA转染组HepG2肝癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型，vegf-b基因靶向siRNA能够抑制HepG2细胞在裸鼠体内增殖能力，并能降低肿瘤组织vegf-b基因表达。

关键词：肝癌 HepG2细胞 vegf-b siRNA 转染裸鼠 RT-PCR

vegf-b基因靶向siRNA治疗原发性肝癌实验研究

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VEGF-B基因靶向siRNA治疗原发性肝癌实验研究

作者：孙建河北医科大学

学位级别：硕士

目的：原发性肝癌(简称肝癌)是临床常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，预后差。在全球癌症发病率中居第5位，死亡率居第3位。在我国，肝癌发病人数约占全球的55%。目前肝癌首选手术治疗，但手术只适用于10%0%的早期肝癌患者,且治疗效果欠... 详细信息

目的：原发性肝癌(简称肝癌)是临床常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，预后差。在全球癌症发病率中居第5位，死亡率居第3位。在我国，肝癌发病人数约占全球的55%。目前肝癌首选手术治疗，但手术只适用于10%0%的早期肝癌患者,且治疗效果欠佳,绝大多数患者在术后2年内复发;而对于晚期肝癌患者，以介入治疗为主的化疗栓塞法亦不能明显改善其预后。近年研究表明，生物治疗,特别是分子靶向治疗在控制肝癌细胞增殖、预防和延缓复发转移及提高患者的生活质量等方面具有独特的优势，并成为研究热点。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, vegf)是一个结构相似的生长因子家族，目前已发现的vegf家族成员有7个，分别是vegf-A(即通常所指的vegf)、vegf-b、vegf-C、vegf-D、vegf-E、vegf-F和胎盘生长因子(Placenta growth factor, PLGF)。它们都是同源二聚体糖蛋白，具有相似的空间结构。vegf家族主要作用于血管和淋巴管内皮细胞，通过其特异性的膜受体介导实现其生物学效应，具有促进内皮细胞增殖、增加微血管通透性、诱导血管生成等多种功能，与肿瘤的生长、转移密切相关。大量的实验研究已证实,大部分恶性肿瘤都有vegf家族成员的表达，而在正常组织中没有或仅有极低水平的表达。 RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指生物体内由双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)现象，是一种dsRNA分子在mRNA水平上封闭相关基因表达的过程。然而，体外合成的长链dsRNA会产生细胞毒反应,短链RNA(213nt)即小干扰RNA(small interferenceRNA, siRNA)可避免该情况发生。研究表明,体外合成的siRNA与内源性siRNA一样，能够发挥分解靶mRNA特异性沉默靶基因的功能。随着对肿瘤发生发展机制的研究和生物技术的发展，肿瘤基因治疗、分子靶向治疗已成为肿瘤治疗的重要发展方向，RNAi技术也在人类基因功能研究和药物靶点鉴定等方面备受青睐，并具有潜在临床应用价值。本研究应用RNAi技术沉默vegf-b基因，观察人肝癌细胞HepG2细胞vegf-b蛋白的表达情况，进一步阐明vegf-b表达与肝癌生物学特性的关系，以期为vegf-b成为肝癌临床治疗靶点提供新的理论依据，也为最终阐明肝癌发生、发展的分子机制奠定实验基础。方法：常规培养人肝癌细胞HepG2细胞。以人vegf-b基因序列(NM03377.3)为靶基因选取3个靶位点，分别构建3个针对靶位点的siRNA质粒表达载体(S1、S2和S3)，同时合成一个阴性对照质粒表达载体(NC)，这些载体均能表达绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)。用脂质体转染法将载体转染入人肝癌细胞HepG2细胞;激光共聚焦显微镜观察转染效率;在转染后48小时，用Western blot技术检测HepG2细胞vegf-b蛋白表达情况。结果：Western blot结果显示HepG2-S1、HepG2-S2、HepG2-S3目的基因蛋白染色条带与HepG2-NC相比减弱。定量分析结果显示HepG2-NC、HepG2-S1、HepG2-S2、HepG2-S3的vegf-b蛋白表达水平分别为0.547±0.012，0.322±0.030，0.235±0.008，0.272±0.018。三个实验组细胞vegf-b蛋白表达水平均显著低于HepG2-NC对照组(Pvegf-b蛋白的表达，其中，HepG2-S2抑制效果最强，HepG2-S3次之，HepG2-S1最弱。结论：体外构建的vegf-b基因靶向siRNA转染肝癌细胞后，能够明显抑制人肝癌细胞HepG2细胞vegf-b蛋白表达。

关键词：原发性肝癌 vegf-b RNA干扰 Western blot HepG2细胞

vegf-b基因靶向siRNA对肝癌细胞裸鼠皮下种植瘤的影响

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VEGF-B基因靶向siRNA对肝癌细胞裸鼠皮下种植瘤的影响

作者：于国栋河北医科大学

学位级别：硕士

目的：原发性肝癌（简称肝癌）是我国常见的消化系统恶性肿瘤之一，起病隐匿、恶性程度高、进展迅速，多数患者在症状出现时已处于中晚期而错失手术机会，手术治疗仍是治疗肝癌的首选方法，但多数患者在术后2年内出现肿瘤复发，术后肿... 详细信息

目的：原发性肝癌（简称肝癌）是我国常见的消化系统恶性肿瘤之一，起病隐匿、恶性程度高、进展迅速，多数患者在症状出现时已处于中晚期而错失手术机会，手术治疗仍是治疗肝癌的首选方法，但多数患者在术后2年内出现肿瘤复发，术后肿瘤转移和复发已成为影响肝癌患者能否长期生存的主要问题，而肿瘤血管新生是肿瘤生长和转移的主要原因。血管内皮生长因子家族(vascular endothelial growth facter family members,vegfs)在血管新生过程中起关键作用。作为vegf家族成员之一的vegf-b在肝癌进展过程中呈现高表达状态，并影响肝癌患者的预后。因此抑制vegf-b基因表达有望成为治疗肝癌的一种新手段。RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是通过一定途径将与内源性mRNA编码区同源的双链RNA（double stranded RNA, dsRNA）导入细胞内，致该mRNA发生降解而产生基因表达沉默的效果。其中小干扰RNA（small interferenceRNA，siRNA）是RNAi的主要效应分子，是由20多个核苷酸组成的小片段dsRNA分子。以质粒或者病毒为载体将靶向基因siRNA导入细胞，并对特定基因产生沉默。本研究利用RNAi技术，设计针对vegf-b基因的siRNA，转染肝癌细胞株HepG2细胞，通过建立裸鼠皮下种植瘤模型，观察实验组与对照组种植瘤的生长情况，并应用免疫组织化学染色法检测各组vegf-b蛋白表达情况。方法：利用RNAi技术，将体外合成的vegf-b基因靶向siRNA转染入人肝癌细胞株HepG2细胞，分别建立阴性组（对照组）Eg0以及三个阳性组（实验组）Eg1、Eg2、Eg3。用blasticidin稳定筛选后，进行培养扩增，最后共得到四组HepG2细胞：三组vegf-b基因靶向siRNA阳性质粒转染组(Eg1、Eg2、Eg3)、阴性对照空载质粒转染组(Eg0)。然后分别接种于4组裸鼠皮下(每组6只，随机分配)，建立人肝癌细胞裸鼠皮下种植瘤模型，即Ec0组、Ec1组、Ec2组、Ec3组。定期观察裸鼠皮下种植瘤的生长情况，30天后处死裸鼠，对比测量4组裸鼠皮下种植瘤的体积、重量，并用免疫组织化学染色法检测分析vegf-b蛋白的表达。采用Image-Pro Plus6.0图像分析系统进行相对定量分析，计算每个视野的单位面积内阳性染色积分光密度值(IOD)，取其均值进行统计分析。结果：1以含荧光标记的质粒为载体，成功将vegf-b基因靶向siRNA转染入人肝癌细胞HepG2细胞，48小时后转染效率均达60～70%。224只裸鼠皮下均成瘤，3个实验组裸鼠皮下种植瘤平均生长速度较对照组缓慢，30天后种植瘤体积对照组为：(1.698±0.137)cm3，实验组分别为(1.107±0.355)cm3、(1.229±0.099)cm3、(1.162±0.188)cm3，瘤体重量对照组为：(1.068±0.086)g，实验组分别为：（0.696±0.224)g、(0.772±0.062)g、(0.730±0.118)g。3个实验组种植瘤体积及重量均显著小于对照组(Pvegf-b蛋白表达水平显著低于阴性对照组(Pvegf-b基因靶向siRNA可明显抑制裸鼠皮下种植瘤的生长及瘤组织vegf-b蛋白的表达。

关键词：原发性肝癌 vegf-b siRNA HepG2细胞转染裸鼠免疫组织化学染色