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硫酸右旋糖苷通过下调血管内皮生长因子/血管内皮生长因子受体2表达和M2型巨噬细胞浸润抑制胃癌血管生成的研究

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实用医学杂志 2020年第17期36卷 2365-2370页

作者：郭嘉欣李梦琪尚静焦龙杏侯绍章徐远义黄允宁宁夏医科大学基础医学院病理学系银川750000 宁夏回族自治区人民医院胃肠外科银川750000

目的研究硫酸右旋糖苷(dextran sulfate,DS)对裸鼠腹腔胃癌转移瘤中M2型巨噬细胞、血管生成和血管内皮生长因子(vegf)/血管内皮生长因子受体2(vegfr2)的影响。方法取34例人胃癌及12例癌旁组织标本,采用免疫组织化学及免疫荧光双染检测... 详细信息

目的研究硫酸右旋糖苷(dextran sulfate,DS)对裸鼠腹腔胃癌转移瘤中M2型巨噬细胞、血管生成和血管内皮生长因子(vegf)/血管内皮生长因子受体2(vegfr2)的影响。方法取34例人胃癌及12例癌旁组织标本,采用免疫组织化学及免疫荧光双染检测胃癌及癌旁组织中CD163(M2型巨噬细胞标记物)及CD34(代表微血管密度MVD)的表达;构建裸鼠胃癌腹腔种植转移模型DS组和对照组,14 d后观察裸鼠腹腔成瘤情况,采用免疫组织化学检测两组转移瘤CD163、CD34的表达,Western blot检测两组转移瘤CD163、vegf和vegfr2的表达。结果人胃癌组织免疫组化及免疫荧光结果显示,胃癌组织中M2型巨噬细胞浸润数量和微血管密度(MVD)显著高于癌旁组织(P2型巨噬细胞浸润数量与MVD呈正相关(r=0.7013,P2型巨噬细胞数量和MVD显著少于对照组(Pvegf和vegfr2蛋白表达较对照组明显降低(P=0.002、0.001、0.037)。结论硫酸右旋糖苷通过减少裸鼠转移瘤中M2型巨噬细胞浸润和vegf、vegfr2的表达抑制血管生成,进而抑制胃癌细胞腹腔种植转移。

关键词：硫酸右旋糖苷血管生成 M2型巨噬细胞胃癌腹腔种植转移 vegf/vegfr2

川芎-赤芍药对及其活性成分调控miR-126抑制斑块内血管新生的研究

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川芎-赤芍药对及其活性成分调控miR-126抑制斑块内血管新生的研究

作者：袁亚慧中国中医科学院

学位级别：硕士

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)斑块内血管新生易引起斑块内出血、斑块破裂,诱发急性心脑血管事件,抑制血管新生的治疗措施可能为稳定AS斑块提供思路。现代研究发现中医血瘀证与AS斑块内血管新生密不可分,因此活血化瘀可能是治疗AS... 详细信息

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)斑块内血管新生易引起斑块内出血、斑块破裂,诱发急性心脑血管事件,抑制血管新生的治疗措施可能为稳定AS斑块提供思路。现代研究发现中医血瘀证与AS斑块内血管新生密不可分,因此活血化瘀可能是治疗AS斑块内血管新生的新思路。川芎-赤芍药对(Chuanxiong-Chishao herb-pair,CX-CS)是活血化瘀经典药对,临床和基础研究均证实其对AS具有良好的效果,但CX-CS调节AS斑块内血管新生的机制尚不清楚。微小RNA126(microRNA-126,miR-126)是血管内皮细胞特异性表达的miRNAs,与AS的发生、发展密切相关,CX-CS是否通过调控miR-126发挥抑制血管新生、抗AS的作用尚不清楚。1.目的探讨CX-CS及其活性成分川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)和芍药苷(paeoniflorin,PF)对AS斑块内血管新生的作用,并基于miR-126探讨CX-CS 及其活性成分 TMP-PF 干预 AS 斑块内血管新生的分子机制。2.方法(1)CX-CS对ApoE-/-小鼠AS斑块内血管新生的作用及机制以C57BL/6J小鼠为正常对照(control),ApoE-/-小鼠随机分为模型组(model)、CX-CS 组、CX-CS+miR-126 拮抗剂(CX-CS+miR-126 antagonist)组、辛伐他汀组(simvastatin)。ApoE-/-小鼠高脂饲料喂养3个月,给予CX-CS浸膏或辛伐他汀1个月,给药前CX-CS+miR-126 antagonist组小鼠尾静脉注射腺相关病毒(AAV)介导的miR126a-5p antagonist。给药1个月后检测血清血脂(甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C))水平,酶联免疫吸附法(enzyme linked immuno sorbent assay,ELISA)检测血清血管内皮细胞生长因(vascular endothelial growth factor,vegf)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的表达,HE染色观察斑块面积,油红O染色观察斑块内脂质面积,免疫荧光检测斑块CD31的表达,PCR检测小鼠主动脉miR-126表达,western blot检测小鼠主动脉 vegf、vegf 受体 2(vegf receptor2,vegfr2)、bFGF 和 FGF 受体 1(FGF receptor1,FGFR1)的表达。(2)基于miR-126探讨CX-CS活性成分(TMP-PF)对氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)血管新生的作用及机制Ox-LDL诱导HUVECs建立体外血管新生模型,以CX-CS活性成分川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)、芍药苷(paeoniflorin,PF)配伍(1 μ mol/L TMP+10 μmol/L PF)干预 ox-LDL 诱导的 HUVECs。HUVECs 分为对照组(control)、模型组(model)、CX-CS 活性成分组(TMP-PF)、CX-CS 活性成分+miR-126抑制剂组(TMP-PF+miR-126 inhibitor)和辛伐他汀组(simvastatin),以 miR-126 inhibitor转染 HUVECs 24 小时,ox-LDL 诱导 12小时,1 μ mol/L TMP+10 μmol/L PF干预24小时,观察内皮细胞增殖(MTT法)、迁移(划痕实验)、成管(细胞成管实验)情况,ELISA检测细胞上清液vegf的表达,PCR检测内皮细胞miR-126的表达,western blot检测内皮细胞 vegf、vegfr2、bFGF、FGFR1 的表达。3.结果:(1)CX-CS通过上调miR-126抑制ApoE-/-小鼠斑块内血管新生与正常组相比,模型组小鼠TC、TG和LDL-C水平显著升高,HDL-C水平显著降低,斑块面积明显增大,斑块脂质浸润增加,斑块内新生血管密度增加(CD31表达升高),主动脉vegf、bFGF、vegfr2和FGFR1表达明显上调,miR-126表达明显降

关键词：动脉粥样硬化血管新生川芎-赤芍药对川芎嗪芍药苷活性成分 miR-126 vegf/vegfr2

阿帕替尼对套细胞淋巴瘤的体外杀伤作用及相关分子机制探讨

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阿帕替尼对套细胞淋巴瘤的体外杀伤作用及相关分子机制探讨

作者：陈钦伟南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景:套细胞淋巴瘤（Mantle cell lymphoma,MCL）是一种恶性B细胞淋巴瘤,临床发病率不高,约占非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma,NHL）3~6%,中老年患者多发。典型的形态学特征为单克隆淋巴组织在套区弥漫或结节状生长,常伴有CD5... 详细信息

研究背景:套细胞淋巴瘤（Mantle cell lymphoma,MCL）是一种恶性B细胞淋巴瘤,临床发病率不高,约占非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma,NHL）3~6%,中老年患者多发。典型的形态学特征为单克隆淋巴组织在套区弥漫或结节状生长,常伴有CD5、CD19、CD20阳性,CD23阴性等免疫表型,t（11;14）（q13;q32）遗传学异常,以及该易位产生的细胞周期蛋白CyclinD1核内阳性。MCL兼具侵袭性淋巴瘤进展快和惰性淋巴瘤难治愈性的双重特征,疾病进展迅速,常规化疗5年生存率＜30%。目前临床上影响患者治疗效果主要存在两个难题:一是MCL治疗上尚无“金标准”方案,传统利妥昔单抗（rituximab）联合CHOP（环磷酰胺,多柔比星,长春新碱,泼尼松）方案对于MCL并不是最佳诱导选择,且大部分患者年纪较大,无法耐受高强度化疗如含中高剂量阿糖胞苷的方案hyper-CVAD/MA等,以及后续的自体造血干细胞移植;二是即使患者初治达到完全缓解,但MCL缓解期短,容易复发,一旦复发,再次缓解率低,预后差。靶向药以低毒性,高选择性的特点,一直是肿瘤研究的热门。近年来,随着基础研究发展,越来越多靶向药物应用于临床,为治愈MCL增添了可能性。因此,积极开发新的靶向药及探索新药与化疗的有效结合对于改善MCL患者生存极为关键。研究表明,vegf与其受体在淋巴瘤中过度表达,vegf/vegfr水平与淋巴瘤预后呈正比关系提示靶向vegf/vegfr通路可能成为治疗MCL的新选择。阿帕替尼（Apatinib）是我国自主研发的血管内皮生长因子受体-2（vegfr-2）抑制剂。能选择性竞争细胞内vegfr-2的ATP结合位点,阻断血管内皮因子（vegf）与其结合,通过抑制肿瘤新生血管生成和下游信号转导通路双重作用来抑制肿瘤生长和营养供给,最终达到治疗肿瘤的目的。作为安全有效的新一代口服小分子受体酪氨酸激酶抑制剂,阿帕替尼目前主要应用于标准化治疗失败的晚期胃癌患者,其他如肺癌、肝癌、乳腺癌等实体瘤的抗肿瘤作用也均有文献报道。受体酪氨酸激酶（RTKs）是细胞表面上一类非常重要的酶联受体家族,是胞内信号转导重要组成部分,兼具受体与酶两种属性,包含血管内皮因子受体（vascular endothelial growth factor receptor,vegfr）,内皮生长因子（epidermal growth factor receptor,EGFR）,胰岛素和胰岛素样生长因子-1受体（insulin and insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-1R）等多种亚型。G 蛋白家族成员 Ras介导的RTKs-Ras-MAPK信号转导通路是RTKs下游重要转导通路之一,当配体（如生长因子）与RTKs结合后导致RTKs二聚体化,活化的RTKs能通过接头分子（Grb2）和鸟苷酸释放因子（SOS）激活Ras蛋白,再引起下游的蛋白激酶（丝裂原活化蛋白激酶mitogen-activated protein kinases,MAPKs）级联磷酸化反应,传导胞外信号入核,参与调节细胞的增殖分化,促进细胞存活等多种生理过程。研究目的:套细胞淋巴瘤（MCL）的化疗效果欠佳,亟需开拓新的靶向治疗手段。本课题以人套细胞淋巴瘤细胞株Mino和Z138为实验对象,探讨阿帕替尼对套细胞淋巴瘤细胞增殖和凋亡的作用,并进一步从Ras-MAPK信号转导通路研究杀伤作用可能的相关分子机制,为探寻套细胞淋巴瘤治疗新方法提供相关实验依据。研究方法:1、细胞株:人套细胞淋巴瘤Mino及Z138细胞株。2、用不同浓度阿帕替尼（0、2.5、5、10、20、40μ M）分别作用MCL细胞株48h,采用CCK-8法检测其增殖抑制作用。3、使用AnnexinV-APC/PI流式双染法检测不同浓度的阿帕替尼（0、10、20、30、40μM）处理48h后对MCL细胞株凋亡比例的变化。4、利用蛋白印迹法（western blotting）检测不同浓度的阿帕替尼（0、20、40μM）作用Mino细胞株48h后,Ras-MAPK信号转导通路上相关蛋白Ras、c-raf、pMEK1/2和pERK1/2表达变化。5、统计学分析使用SPSS20.0软件,两独立样本之间的均数比较采用独立t检验;多组间均数比较使用单因素方差分析（方差齐时使用LSD法进行多重比较;方差不齐时Welch校正后用Dunnett’ sT3方法进行多重比较）。对于某些小样本数据的统计分析,多组间均数比较使用Kruskal-WallisH非参数检验。当参数检验和非参数检验结果不同时,以非参数检验的结果为准,结果相同时,采用参数检验方法的结论。所有计量资料使用M±SD表示,校验水准为

关键词：阿帕替尼套细胞淋巴瘤 vegf/vegfr2 Ras-MAPK 通路

PI3K/Akt-HIF-1信号系统在糖尿病创面愈合过程中的表达及其意义

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PI3K/Akt-HIF-1信号系统在糖尿病创面愈合过程中的表达及其意义

作者：景丽峰南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景随着人们生活水平的提高和人口老龄化加速,全球糖尿病发病率日益增长,给全人类的健康安全带来了巨大的威胁。据预测到2025年,中国、印度、美国将成为世界上拥有糖尿病患者最多的国家,糖尿病患病率将达到4.4%,患者数将由200... 详细信息

研究背景随着人们生活水平的提高和人口老龄化加速,全球糖尿病发病率日益增长,给全人类的健康安全带来了巨大的威胁。据预测到2025年,中国、印度、美国将成为世界上拥有糖尿病患者最多的国家,糖尿病患病率将达到4.4%,患者数将由2000年的1.71亿人增至2030年的3.66亿人。最近的调查显示,美国每年实施的6万多例非创伤性手术中50%为糖尿病患者;我国三甲医院非创伤性截肢患者中约有1/3为糖尿病所致,我国糖尿病足患者中合并感染率高达70%,糖尿病患者的截肢率是非糖尿病患者的40倍。糖尿病创面愈合延迟的因素众多,包括周围神经病变、免疫反应缺陷、周围微血管病、血红蛋白糖基化引起的组织氧输送不足、红细胞变化、Ⅲ型和Ⅰ型皮肤胶原比例改变[4]、糖尿病皮肤的生物力学改变、成纤维细胞和角质细胞迁移、扩增能力减弱、角质细胞和内皮细胞凋亡等。另外,糖尿病创面愈合延迟与参与组织重建的生长因子不足关系密切,这些生长因子包括PDGF、vegf、 NOS、KGF和FGF等。与非糖尿病创面相比,在细胞水平上,糖尿病创面中成纤维细胞、角质形成细胞和内皮细胞扩增、迁移能力减弱,上皮细胞凋亡加速,胶原合成减少,血管生成减少和上皮化延迟,正是糖尿病创面的这些缺陷以及并发创面感染和骨髓炎,所以容易导致糖尿病足、甚至截肢。除此之外,干细胞功能受损也会影响创面愈合。在糖尿病大鼠创面模型中,糖尿病创面中分离的表皮干细胞克隆、分化能力降低。但脂肪干细胞与上述细胞不同,糖尿病创面和正常创面中分离的脂肪干细胞可分泌等量的生长因子、细胞因子和Ⅰ型胶原,甚至能以同等速度扩增。因此,糖尿病人的脂肪干细胞可为自身创面愈合和更新提供细胞来源。给非糖尿病大鼠创面局部注射高浓度葡萄糖将抑制血管的正常形成过程,表明高血糖将直接影响血管新生。创面新生血管不足将限制炎症细胞进入创面,同时炎症细胞释放的生长因子也减少,创面的氧气也供给不足。Ferguson等和Delamaire M等在实验中发现糖尿病创面中急性炎症细胞增加,但糖尿病代谢障碍导致中性粒细胞和巨噬细胞迁移能力不足、白细胞趋化能力减弱。因此,细胞水平的变化加大了创面感染、血管形成不足的风险。在分子水平机制上,生长因子通过信号通路调节细胞活性,影响了创面愈合的每个时期。实验证明：生长因子与表皮细胞增殖关系密切,而且可通过调节内皮细胞迁移、增殖促进血管生成。不管在糖尿病动物模型中,还是在Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病病人的临床试验中,糖尿病创面中HIF-1减少,其下游靶基因表达减少或功能减退,如vegf、PDGF、ANGPT、SDF-1及eNOS等。糖尿病患者下肢皮肤中HIF-1及vegf的表达降低,导致血管密度下降,血液循环不良和伤口愈合障碍,是糖尿病足发生的重要因素。然而通过慢病毒转染或其它方法维持HIF-1稳定表达,可改善创面微环境,促进新血管生成,加快创面愈合血管再生和血管生成是创面愈合的关键因素。血管不仅仅输送营养物质和氧气到创面,而且携带炎症细胞和干细胞到创面。但是糖尿病创面中微循环受损,其与生长因子、内皮细胞功能受损有关。而血管生成主要由低氧诱导,HIF-1在调节细胞对低氧的反应,创面血管新生中起了至关重要的作用,其中包括内皮细胞活化、迁移和扩增;血管平滑肌细胞迁移和扩增,骨髓源性的成血管细胞动员、分化和扩增以及基质重塑;调节特定的干细胞效应器,控制干细胞迁移及动员、增殖和多向分化。最近研究证实,骨髓来源的内皮祖细胞通过募集、增殖形成新血管是生后血管发生的主要方式。而vegf和SDF-1是诱导血管发生的重要因子。 HIF-1最先是由Semenza和Wang于1992年从低氧诱导肝癌细胞的细胞核提取物中首次发现的。HIF-1是一个异二聚体复合物,由HIF-1α和HIF-1β两个亚基构成。HIF-1β主要在细胞核内持续表达,不受氧浓度影响;HIF-1α在细胞浆内表达,具有氧浓度敏感性。在正氧条件下,HIF-1α不稳定,半衰期小于5min。在低氧条件下,PHDs无活性导致泛素—蛋白酶体作用受到抑制,HIF-1α通过核定位信号（Nuclear localization signal, NLS）介导入细胞核,与目的基因的低氧反应元件（HRE）结合激活靶基因表达,对机体内的一系列因素进行调节。目前研究表明,虽然低氧是调节HIF-1α的主要因素,但还有许多因素影响HIF-1α的稳定性及功能,如血糖浓度、生长因子、细胞因子、活性氧自由基（reactive oxygen species, ROS）、糖基化终末产物（Advanced Glycation End Products, AGEs）及胰岛素等;而且HIF-1直接或间接地调节多种约100多种基因的表达,涉及适应和生存机制,如血管生成、无氧糖酵解、红细胞生成及

关键词：糖尿病HIF-1α vegf/vegfr2 SDF-1α/CXCR4 创面愈合

Apatinib对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株的杀伤作用及分子机制的探讨

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Apatinib对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株的杀伤作用及分子机制的探讨

作者：王焱南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景:弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是成人最常见的淋巴系统肿瘤,占非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)的30-40%,是其最常见的一种亚型。DLBCL是一种异质性很大的侵袭性恶性肿瘤,包括在组织形态... 详细信息

研究背景:弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是成人最常见的淋巴系统肿瘤,占非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)的30-40%,是其最常见的一种亚型。DLBCL是一种异质性很大的侵袭性恶性肿瘤,包括在组织形态学、细胞遗传学、分子生物学及临床预后方面。近年来,基于含有利妥昔单抗(rituximab)的联合化疗 R-CHOP(rituximab,cyclophosphamide,doxorubicin,vincristine,prednisolone)方案,DLBCL患者的治疗效果显著提高,生存期也明显延长。然而在R-CHOP的治疗下,仍有近1/3的难治复发患者,且只有很少的患者得益于挽救治疗及自体造血干细胞移植(autologous stem cell transplantation,ASCT)。那么新的药物对于治疗DLBCL是迫切需要的,目前靶向药物一直是恶性肿瘤研究的热点。血管生成对肿瘤生长及转移至关重要,选择性的抑制血管生成已成为抗肿瘤治疗的策略,目前越来越多的靶向血管生成药物在临床上运用于肿瘤。Apatinib是一种靶向血管的抑制剂,为血管内皮生长因子受体-2(vegfr-2)酪氨酸激酶抑制剂;Apatinb能强效抑制肿瘤血管生成,主要作用机制是竞争性结合该受体胞内酪氨酸ATP结合位点,高度选择性地抑制vegfr2酪氨酸激酶活性,阻断vegfr2与内皮生长因子(vegf)结合后的信号传导。vegf与vegfr2结合后可以激活多种信号通路,包括PI3K/Akt、Ras通路等,而Ras通路与人类绝大多数肿瘤密切相关,也是vegf/vegfr2激活后重要的信号途径。Apatinib作用于vegfr2后,可以抑制vegf/vegfr2的激活,从而抑制其激活Ras信号通路,发挥抗肿瘤效应。研究目的:探讨Apatinib能否抑制弥漫大B细胞淋巴瘤细胞增殖并诱导其凋亡,并进一步研究其杀伤作用与Ras信号通路的关系,为开拓弥漫大B细胞淋巴瘤治疗新方法提供实验依据。研究方法:1、用 CCK-8 法检测不同浓度的(2.5、5、10、20、40μmol/L)Apatinib 作用48h后对DLBCL细胞株的增殖抑制作用。2、用Annexin-V/PI双染法流式细胞术检测不同浓度的(0、10、20、30、40μmol/L)Apatinb处理48h后对DLBCL细胞株凋亡的影响。3、利用蛋白免疫印迹法检测Apatinib作用oci-ly1和细胞SU-DHL-2 48h后pvegfr2蛋白及Ras信号通路中Ras、c-Raf、pMEK1/2和pErK1/2的表达变化。4、统计学分析采用SPSS19.0软件,由于均是小样本数据的统计,两组独立样本均数的比较采用非参数检验(Mann-WhitheyU检验);多组间均数比较采用多个独立样本的非参数检验(Kruskal-WallisH检验)。计量资料用Mean±SD表示,所有的检验分析均是双侧检验,检验水准为α=0.05。研究结果:***8 结果显示:Apatinib 对 GCB 型 DLBCL 细胞株 oci-ly1、SU-DHL-4(S4)及ABC细胞株oci-ly3、SU-DHL-2(S2)具有明显的增殖抑制作用,并呈剂量依赖性。Apatinib 作用 oci-ly1、SU-DHL-4(S4)oci-ly3、SU-DHL-2(S2)细胞 48h 后,其 IC50 分别为(19.30±0.07)μmol/L、(18.15±0.15)μmol/L、(18.15±0.15)μmol/L、(15.29±0.13)μmol/L 和(12.34±0.27)μmol/L,经多个独立样本的非参数检验Kruskal-Wallis H检验分析结果表明与对照组比较差异均具有统计学意义(χ2=16.460,P=0.006;χ2=16.248,P=0.006;χ2=16.460,P=0.006 和χ2=16.648,P=0.005)。经两个独立样本非参数检验Mann-Whitney U分析,ABC型细胞株oci-ly3的增殖抑制率分别明显高于两种GCB型细胞株oci-ly1和SU-DHL-4(S4)(P=0.047和P=0.047);同样,另一株ABC型细胞株SU-DHL-2的增殖抑制率分别高于两种 GCB 型细胞株 oci-ly1 和 SU-DHL-4(S4)(P=0.047 和 P=0.047)。*** V/PI双染法流式细胞术检测Apatinib作用于GCB型DLBCL细胞株 oci-ly1、SU-DHL-4(S4)及 ABC 型细胞株 oci-ly3,SU-DHL-2(S2)48h 后的凋亡比例,发现 Apatinib

关键词： Apatinib 弥漫大B细胞淋巴瘤 vegf/vegfr2 Ras通路

促红细胞生成素对短暂缺氧新生大鼠神经保护作用的研究

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促红细胞生成素对短暂缺氧新生大鼠神经保护作用的研究

作者：闫方方郑州大学

学位级别：硕士

目的通过建立新生大鼠短暂缺氧模型,模拟新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic ischemic encephalopathy,HIE)的临床病理过程。采用腹腔注射法给予促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)治疗,通过检测大鼠的白质损伤情况及认知功能变化,研究促红... 详细信息

目的通过建立新生大鼠短暂缺氧模型,模拟新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic ischemic encephalopathy,HIE)的临床病理过程。采用腹腔注射法给予促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)治疗,通过检测大鼠的白质损伤情况及认知功能变化,研究促红细胞生成素对缺氧缺血大鼠的神经保护作用;通过检测海马组织血管密度及vegf/vegfr2通路相关蛋白的表达情况,探究促红细胞生成素发挥神经保护作用的可能机制。方法1.参照Nyakas的方法,将新生7日龄雄性SD大鼠置于100%氮气中持续缺氧10min,建立新生大鼠HIE模型。通过观察比较对照组和缺氧模型组大鼠的一般神经行为学表现;尼氏染色法观察海马组织神经元损伤情况,以及缺氧后48h、72h脑组织含水量;判断缺氧模型组大鼠的脑组织损伤情况,评价模型建立情况。2.按照实验设计,将新生7日龄雄性SD大鼠随机分为5组:control,anoxia+vehicle,anoxia+rh EPO,anoxia+SU5416+rh EPO,anoxia+SU5416;通过评价各组大鼠的一般生长发育情况(包括睁眼时间、门齿显露时间、竖耳时间及体重变化),LFB染色法检测胼胝体中部的白质损伤情况,免疫荧光(Lectin染色)检测海马组织血管密度,Morris水迷宫实验检测各组大鼠的认知功能,以及Western blot技术检测各组大鼠海马组织EPOR、vegf、t-Raf1、p-Raf1、t-ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表达情况,综合分析rh EPO腹腔应用对HIE大鼠的治疗作用,同时探究血管再生相关通路vegf/vegfr2在其中发挥的作用。结果1.缺氧模型组大鼠在缺氧过程中出现躁动、紫绀、窒息、昏迷等脑组织缺氧及神经功能障碍的表现;与对照组相比,缺氧模型组大鼠的脑组织含水量增加,海马CA1区神经元变性严重,学习、记忆能力及空间定向能力减退;2.各组大鼠的一般生长发育状况(睁眼时间、竖耳时间、门齿显露时间)及早期体重变化(40日龄之前)没有明显的差异,40日龄之后,缺氧组大鼠的体重较对照组明显降低;***染色结果显示,缺氧各组大鼠均存在一定程度的白质损伤,其中anoxia+rh EPO组白质损伤情况较其他3个缺氧处理组大鼠明显减轻;免疫荧光染色结果表明,anoxia+rh EPO组大鼠海马CA1区血管密度较其他缺氧组明显增加;Morris水迷宫结果显示,与对照组相比,缺氧各组大鼠均存在一定的认知功能障碍,而rh EPO腹腔应用能明显改善缺氧大鼠的认知功能;*** blot结果显示,缺氧处理后,大鼠的EPOR及vegf表达量增加,rh EPO腹腔应用后,增加幅度更明显;t-Raf1及t-ERK1/2表达量不受缺氧及rh EPO治疗的影响,但是p-Raf1及p-ERK1/2表达量在缺氧及rh EPO治疗后明显增加;与anoxia+rh EPO组相比,anoxia+SU5416+rh EPO组大鼠的p-Raf1及p-ERK1/2表达量明显降低。结论本研究通过100%氮气环境中缺氧的方法,成功建立了新生大鼠HIE模型;大剂量rh EPO(5000U/Kg)腹腔注射给药,能够减轻缺氧造成的脑损伤,发挥神经保护作用,明显减轻白质损伤,改善认知功能障碍,促进血管再生;rh EPO的神经保护作用可能与其激活vegf/vegfr2通路有关。

关键词：促红细胞生成素缺氧缺血性脑病血管再生 vegf/vegfr2

孕甾烷生物碱衍生物QN66抗肿瘤转移分子作用机制和靶点研究

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孕甾烷生物碱衍生物QN66抗肿瘤转移分子作用机制和靶点研究

作者：贾美琪天津医科大学

学位级别：硕士

目的:本文应用人乳腺细胞MDA-MB-231以及人脐静脉内皮细胞HUVEC,考察孕甾烷生物碱衍生物QN66对细胞迁移、侵袭和粘附的影响,以及小管形成的作用,并进行分子机制研究;推测可能的靶点蛋白,并鉴定主要作用靶点。方法:1.首先MTT方法评价QN66... 详细信息

目的:本文应用人乳腺细胞MDA-MB-231以及人脐静脉内皮细胞HUVEC,考察孕甾烷生物碱衍生物QN66对细胞迁移、侵袭和粘附的影响,以及小管形成的作用,并进行分子机制研究;推测可能的靶点蛋白,并鉴定主要作用靶点。方法:1.首先MTT方法评价QN66对MDA-MB-231和HUVEC细胞增殖抑制作用;伤口愈合实验研究化合物对迁移能力的影响,transwell小室-侵袭实验考察化合物对细胞对侵袭能力的影响;基质胶粘附实验考察化合物对细胞粘附能力的影响。并利用体外matrigel上培养内皮细胞形成三维管状结构,观察QN66对HUVEC细胞小管形成的影响。*** blot及ELISE等方法研究化合物对三阴性乳腺癌细胞转移及血管生成相关通路PI3K/AKT,Erk1/2,FAK等相关信号传导的影响,阐明抗转移和抗血管生成作用机制。3.根据分子作用机制结果,推测可能的作用靶点,利用药物设计软件进行分子对接,进而推断作用靶点,随后应用细胞热转移技术(CETSA)方法对配体与靶蛋白结合进行鉴定,确定孕甾烷生物碱衍生物QN66的作用靶点。结果:1.在非细胞毒剂量下,QN66抑制MDA-MB-231细胞侵袭,迁移以及粘附功能,并呈现一定的剂量依存性。在分子机制作用研究中QN66剂量依赖性地下调HIF-1α表达水平,下调靶基因vegf表达水平,并降低其受体vegfr2的磷酸化水平,下调vegfr2下游信号分子AKT,m TOR,PKCδ,FAK,Erk1/2,p70S6k,4EBP1的磷酸化水平,以HIF-1α激动剂DMOG干预后,QN66抑制乳腺癌细胞迁移的能力显著下降从而发挥抗转移作用。说明QN66通过下调HIF-1α表达水平,发挥抗乳腺癌细胞转移作用。2.非细胞毒剂量下,在HUVEC细胞中,QN66抑制HUVEC细胞迁移和侵袭,并显著抑制HUVEC细胞的小管形成能力,Western blot实验结果表明,QN66进一步下调vegfr2的磷酸化水平,下调vegfr2下游信号分子AKT,m TOR,FAK,Erk1/2的磷酸化水平,来发挥抗血管生成的作用。3.细胞热转移CETSA方法检测QN66与HSP90的结合作用,与对照组相比,发现在相应温度下QN66可以提高HSP90蛋白热稳定性,并在等温剂量反应实验条件下,QN66对HSP90的热稳定性呈剂量依存性。结论:1.化合物孕甾烷衍生物碱QN66通过抑制MDA-MB-231细胞的趋化迁移、侵袭和粘附,发挥抗肿瘤细胞转移的作用;并且显著抑制HUVEC细胞的趋化运动能力、划痕愈合能力、侵袭能力及粘附能力,且降低HUVEC细胞的小管形成能力。2.分子作用机制研究结果表明,说明QN66为HIF-1α潜在抑制剂,通过HIF-1α的靶基因vegf抑制vegf/vegfr2轴,下调乳腺癌细胞中vegfr2下游信号分子AKT,m TOR,PKCδ,FAK,Erk1/2的磷酸化水平,从而发挥抗乳腺癌细胞迁移,侵袭和粘附作用,并降低HUVEC细胞vegfr2的磷酸化水平,另外,下调vegfr2下游信号分子AKT,FAK,Erk1/2的磷酸化水平,进而发挥抗血管生成的作用。3.分子对接实验表明QN66与HSP90具有相互作用,进一步以细胞热转移技术CETSA方法验证,孕甾烷生物碱衍生物QN66的相关作用靶点为HSP90,HIF-1α为HSP90的客户蛋白,抑制HSP90会导致HIF-1α表达水平下降,进而影响其靶基因vegf的表达,通过vegf/vegfr2轴,下调vegfr2下游信号分子AKT/m TOR,PKCδ,FAK,Erk1/2的磷酸化水平,从而发挥抗转移和抗血管生成作用。

关键词：孕甾烷衍生物QN66 抗肿瘤转移和抗血管生成 HSP90 HIF-1α vegf/vegfr2